Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקות מעבר היניקה-to-הגמילה בתוך מבחנה באמצעות העכבר מאוחר מעיים של המעי העוברי תרבותי במשך 30 ימים.
Abstract
בסוף תקופת היניקה, מינים רבים של יונקים עוברים שינויים משמעותיים באפיתל המעי הקשורים ליכולת לעכל מזון מוצק. תהליך זה נקרא מעבר יניקה-to-הגמילה ותוצאות החלפת אפיתל ה, עם האפיתל המבוגר אשר הולך יד ביד עם התאמות מטבולית מורפולוגית. אלה שינויים התפתחותיים מורכבים הם תוצאה של תוכנית גנטית כי הוא מהותי בתאי אפיתל המעי אבל יכול, במידה מסוימת, להיות מאופנן על ידי גורמים חיצוניים. תרבות ממושכת של העכבר תאים אפיתל המעי העיקרי מהתקופה העוברית המאוחרת, לאחר מעבר היניקה-הגמילה בתוך מבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור תרבות העוברי העכבר מעיים אורגאיד המתאים ביותר למודל זה תהליך בתוך מבחנה. אנו מתארים מספר שימושי שנועד לפקח על שינוי של פונקציות המעי הקשורות מעבר היניקה-אל-הגמילה לאורך זמן. בנוסף, אנו כוללים דוגמה של גורם חיצוני שמסוגל להשפיע על מעבר היניקה-אל-הגמילה ב-vivo, כייצוג של מודלדירוג העיתוי של המעבר מתוך הגמילה במבחנה. זה בגישה מחוץ למבחנה ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים של מעבר היניקה-לגמילה, כמו גם מאפטורים של תהליך זה. חשוב מכך, ביחס לאתיקה בעלי חיים במחקר, החלפת מודלים in vivo על ידי זה במודל מתורבת תורמת עידון של ניסויים בעלי חיים ואולי ירידה בשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד תהליכי ההבשלה של המעיים.
Introduction
במינים רבים של יונקים, כולל עכברים וגברים, המעי ה, יש מספר תכונות שונות מן האפיתל המעי המלא בוגרת. תכונות אלה להקל על הנוציטים לעיכול לעכל ולספוג חלב, אשר מכיל גבוה שומן ופחמימות נמוכות, עם לקטוז כמו פחמימות גדולות. גבול המברשת של התאים האפיתל המעי הנועיים לבטא את הפירוק לקטאז-phlorizin הידרולז (lct)1 כדי לעכל את החלב דו-סוכר לקטוז. לאחר תקופת היניקה, הסתגלות הגוף לעכל מזון מוצק, כי הוא עשיר בפחמימות מורכבות נמוך בשומן. זה בא לידי ביטוי באמצעות מעבר של גבול המברשת disaccharidase הביטוי מן לקטאז ל sucrase-איזואלבורסה (Sis) ו trehalase (Treh), אשר יכול לעכל פחמימות מורכבות יותר נוכח מזון מוצק2. מתג מטבולית נוסף קשור לריכוז הנמוך של ארגינין בחלב. כדי לספק את הצורך של ארגינין, הנוציטים באנתאי לבטא את הקצב הגבלת האנזים בביוסינתזה של ארגינין, הארגינוסות1 סטנדרטים -1 (Ass1), כדי לסנתז את ארגינין3. לעומת זאת, מבוגר בידור מהיר arginase 2 (Arg2), אנזים המסוגל לבטל את arginase כי הוא שופע מזון מוצק. יתר על כן, האפיתל המעי הלופנום מבטא את הקולטן של הלוגלוטים עבור החיסוני (FcRn), אשר מדיה הקליטה של IgG אימהי מן החלב לתוך זרימת הדם/מחזור הדם4. הביטוי של FcRn מסרב באופן משמעותי במהלך מעבר היניקה-לגמילה5. בעכברים, התבגרות של תאים paneth מתרחשת postnatally, בד בבד עם היווצרות והתבגרות של קריפטים, והוא מאופיין על ידי ביטוי של פפטידים מיקרוביאלית ליזוזום (lyz) ו השלכה חטאים6.
כל השינויים הללו הם חלק מהמעבר לגמילה, תהליך המתרחש בהדרגה לאחר הלידה לחודש אחד של גיל בעכברים, כאשר האפיתל המעי מגיע למצב מבוגרים בוגרת שלה. . מוסדר ומוכן לפיתוח בצינור הבטן גורם שעתוק B לימפוציטים המושרה חלבון-1 (בלון-1) ממלא תפקיד מפתח בתהליך זה התבגרות מהותי7. בלון בלון -1 מבוטא במידה רבה ב אפיתל התינוק, בעוד הביטוי שלה פוחתת והוא איבד במהלך המעבר היניקה-to-הגמילה ולכן יכול לשמש סמן אמין של אפיתל המעי ה, המיעיים. למרות היותו תהליך מהותי, מעבר היניקה-לגמילה יכול להיות מאופנן על ידי גורמים חיצוניים. לדוגמה, האנלוגי הסינתטי של הקורטיזול, דקאמתאסאחד, ידוע להאיץ בהבשלה של המעיים ב vivo8,9.
הנוכחי מודלים של חוץ גופית משמש לחקר התבגרות אפיתל המעי כולל מעבר היניקה-אל-והגמילה, לנצל קווי אפיתל למבוגרים תאים ו/או אורגנואידים למבוגרים אשר מאפיינים דוב של אפיתל המעי הבוגר. לאחרונה הדגמנו כי בתאי אפיתל המעי העיקרי בודד מן המעי עוברית מאוחר בוגרת לבין לכידה מעבר היניקה-אל-הגמילה כאשר גדל בחוץ גופית כמו אורגנואידים10. עוד הצגנו את העובדה שתהליך ההבשלה של המעיים במבחנה מתרחש באותו קצב כמו בvivo. לבסוף, השתמשנו דקסמטסון כדי להאיץ את תהליך ההבשלה באותה אופנה שתוארה במחקרים vivo .
כאן, אנו מתווה פרוטוקול מדויק לבידוד ולתרבות של העכבר המנוח אורגנואידים המעי. אנו מתארים את הדרך המועדפת של איסוף דגימות עבור תרבות ארגונית ממושכת ושיטות לפקח על מעבר היניקה-לגמילה בתוך מבחנה. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים בעלי מבחנה של התבגרות אפיתל מעיים ומודולטורים של תהליך זה ותוצאות תפוקה גבוהה יותר, הגדלת ערך האיכות והתמורה של הנתונים והפחתה של שימוש בבעלי חיים.
Protocol
מחקר זה נערך בהתאם להנחיות המוסדיים לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים שהוקמה על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת אמסטרדם בציות מלא לחקיקה הלאומית בנושא מחקר בעלי חיים בעקבות ההנחיה האירופאית 2010/63/האיחוד האירופי לשימוש בעלי חיים למטרות מדעיות (ALC312).
1. בידוד אורגנואידים של מעיים עוברי
- הקריבו את העוברים הE18-E20 בעריפת ראש באמצעות מספריים כירורגיים, בהתאם לתקנות המוסריות המאושרות.
- מיד לאחר המתת החסד, חתכו בזהירות את הבטן התחתונה של העובר עם מספריים מעיים והסירו את כל המעי.
הערה: יש לבצע בידוד באמצעות מעיים בין E18 ו-E20 של הריון על מנת להשיג את המעבר הנכון לגמילה ולהבשלה בתוך מבחנה. - , עם שני מלקחיים קטנים. תמתח את המעיים באמצעות הבטן והנספח כמדריכים, חותכים את החלק הנמוך ביותר והמרוחק של המעי הדק.
הערה: אם הניתוח נעשה בזהירות, ניתן לבודד גם את המעי הגס. חותכים אותו לגזרים באמצעות נספח כמדריך (איור 1). - להפוך את המעי לפתוח longitudinally: לתקן את המעי באמצעות להב תער ממוקם לאורך ולמשוך את המעי ידי מלקחיים הזזה (זרוע אחת של מלקחיים על כל צד של להב תער) לאורך להב תער. לאחר מכן, לחתוך את המעי הפתוח בחתיכות 1 ס מ.
- להכין צינורות 2 50 mL עם 10 מ ל של מלוחים קרח קר פוספט באגירה (PBS). העבר את החלק הנמוך ביותר המרוחק של המעי הדק (ואת המעי הגס אם ישים) בנפרד לצינורות. לשמור על הצינורות על הקרח תוך מבתר את המעיים של עכברים נוספים. לאסוף את כל חלקי המעי של המלטה אחד יחד באותו צינור.
הערה: לכלוך אחד יש בדרך כלל 6-10 עוברים. יש לשלב את המעיים של כל העוברים. סכום זה צריך להספיק כדי להניב 4-8 בארות עם אורגנואידים, בצלחת 48-באר, לכל חלק של המעי. - המשך עם בידוד אורגנואיד כמתואר בעבר11. בקיצור, לשטוף את חתיכות המעי עם הקרח קר PBS, מודורית עם 2 מ"מ חומצה ethylenediam, במשך 30 דקות ב -4 ° c, הנתק את הקריפטטים מן הרקמה על ידי שטיפת בחומרה את השברים עם הקרח הקר PBS + 10% סרום העוברי (fcs), מסנן באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר ו צנטריפוגה לאסוף את הקריפטטים ב 150 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- צלחת 4 כדי 8 בארות עם הקריפטטים ג'ל מטריקס לחילוץ, בהתאם לגודל גלולה, בצלחת חם 48-באר. השתמש 20 μL של קריפטטים מושעה ג'ל מטריצה מסחטות לכל טוב. תנו למיאת ג'ל המיטריתאי לגבש בחממה 37 ° c במשך 10 דקות.
הערה: בהתחשב בכך שרק 40% עד 50% מהקריפדים הבודדים בצורת הטופס, המטרה היא לצפיפות של 250 ועד 300 ליצירת אורגנואידים בממוצע. ראשית להוסיף מטריצה פחות מיותר מיותר לחילוץ מאשר צורך. חפשו תחת המיקרוסקופ לאחר platting את הבאר הראשונה כדי לנתח אם הצפיפות של הקריפטטים מבודדים הוא אידיאלי. במקרה הצורך, הוסיפו ג'ל מטריצות מיותר. - בינתיים בינונית להכין ENR: 14 מ ל של מדיום מתקדם בינונית הנשר שונה/Ham ' s F-12 (Dמאמ/F12) 1:1 + + + (בתוספת 4-(2-הידרולוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (HEPES) 1x, סטרפטומיצין-גלוטמין 0.01 M ו-0.2 U/mL פניצילין/מדיום, 4 מ ל של מדיה ממוזג, 2 מ ל של מדיה ממוזג, 400 μL של B27 מוסף 1x, 200 μL של N2 תוספת 1x, 50 μL של 1.25 mM n-Acetylcysteine, 20 μL של 0.05 μg/mL מקדם גידול באפידרמיס (EGF).
הערה: כאשר מעגלי המעי הגס של culturing, תוספת עם 50% מדיה ממוזגת של Wnt. - הוסף 250 μL של מדיום ENR לכל טוב.
2. שריר של אורגנואידים עוברי
- שנה את המדיום של התרבויות 3 פעמים בשבוע. ההבשלה של האורגנואידים מושגת לאחר חודש של תרבות.
- ביום 3 לאחר כל מעבר, יש לספור את מספר הספרואידים והאורגנואידים בעזרת מיקרוסקופ אופטי. מכמת לפחות 3 בארות לכל מחלה וכל האורגנואידים הקיימים בכל באר.
הערה: מספר היורואידים מצטמצם עם הזמן, בעוד שמספר האורגנואידים גדל (איור 2). - מעבר לאורגנואידים פעם בשבוע על ידי דיסוציאציה מכנית כפי שמתואר להלן.
- הסר בינוני ולהוסיף 1 מ ל של הקרח קר מתקדם DMEM/F12 1:1 + + +. לאסוף את כל ג'ל מטריקס מסחטות עם אורגנואידים לתוך שפופרת 15 mL. השתמש בתשר של 200 μL על גבי קצה מסנן של 1000 μL ופיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לשבש את האורגנואידים.
- צנטריפוגה ב 150 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה ב 20 μL של ג'ל מטריצה מוטית לכל טוב. בדרך כלל, אורגנואידים עוברית ניתן להרחיב ביחס 1:2.
- תן למיגון ג'ל מטריצה מגבש עבור 5-10 דקות. הוסף 250 μL של מדיום ENR לכל טוב.
3. התבגרות ניתוח ב-RNA וברמת החלבון
- לנתח את התרבות כל 3 ימים לאחר כל מעבר, לתקופה של חודש 1 (כלומר, הזמן שבו התבגרות מלאה מושגת) (איור 3).
הערה: התרבות העוברית של העובר היא דינמית (סרט 1) וכלה להימנע מווריאציות התחדשות נורמלית של אורגנואידים לאחר הפרעה מכנית, יש צורך לאסוף תמיד דגימות באותו יום לאחר המעבר. -
בידוד רנ א
- לאסוף 3 בארות של אורגנואידים באמצעות 200 μL של מאגר לליזה RNA עבור כל היטב שנוספו עם 2 μL של β-mercaptoethanol. לאחר הוספת מאגר לליזה RNA + β-mercaptoethanol אל הבאר, לוודא כל ג'ל מטריצה מתוכל עם אורגנואידים מועבר RNase-חינם 1.5 mL שפופרת.
- מערבולת במרץ ולשמור ב-80 ° c עבור לא יותר מחודש 1. בידוד רנ א באמצעות מסחרית זמין בערכות עמודות הספין.
- כדי להגדיל את איכות ה-RNA, לאחר שטיפת שלבים להוסיף 500 μL של 80% אטוח ולערבב בעדינות על ידי היפוך העמודה. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 11,000 x g כדי לייבש את העמודה לחלוטין.
הערה: הקפד לשטוף את החלק הפנימי של המכסה של הצינור עם 80% אטוח על ידי מצליף את הצינור הפוך שלוש עד חמש פעמים כדי להיפטר כל העקבות של guanidine thiocyanate. - כדי להגדיל את התשואה RNA, המתן 1-2 דקות לאחר החלת המים החופשיים RNase לפני הצנטריפוגה. מחדש את ה-RNA על ידי החלת הזרימה הראשונה עד לעמודה בפעם השנייה.
הערה: איכות RNA מבודדת מספיקה לשימוש בניתוח ביטויים ברחבי הגנום. בדוק אם מספר שלמות RNA הוא מעל 8.
-
בידוד חלבונים
- לאסוף 5 בארות של אורגנואידים באמצעות 250 μL של הקרח קר התאוששות תא פתרון לתוך שפופרת 1 15 mL. דגירה עבור לפחות 30 דקות על הקרח כדי לפזר את מטריצה החילוץ ג'ל (זה יפחית את תרומת החלבון של ג'ל מטריקס מסחטות).
- . תשטוף עם הקרח הקר הוסף 250 μL של מאגר פירוק תאים ואחסן ב-80 ° c.
הערה: לאחר sonication, ניתן להשתמש בדגימות כדי לאתר פעילות אנזימים או עבור Blots מערביים.
-
כתמים חיסוני
- לאסוף 2 בארות של אורגנואידים באמצעות 250 μL של פתרון שחזור תא קר הקרח לתוך שפופרת 15 mL. דגירה עבור לפחות 30 דקות על הקרח כדי לפזר את ג'ל מטריצה החילוץ (זה יהיה להפחית את הרקע מכתים). . תשטוף עם הקרח הקר
- תקן את האורגנואידים באמצעות 500 μL של 4% פאראפורמאלגינדה (בתחתית) עבור 1 h ב 4 ° c. . תשטוף עם הקרח הקר המשך אל הטבעה ארגונית שלמה או להטבעת פרפין, לפי פרוטוקולים שפורסמו12.
הערה: השתמש בפיפטה מפלסטיק לטיפול באורגנואידים. זה ימנע הפרעה של המבנה שלה.
4. השפעת פקטור חיצוני (dexamethasone כדוגמה) על תהליך התבגרות אורגאיד
- ביום אחד של תרבות, להוסיף 0.01 מטרים dexthasone לאורגנואידים. מודאת האורגנואידים עם דקסמטסון במהלך החודש כולו של התרבות על ידי הוספת דקסמטסון חדש כל מדיום בפעם שונה.
- ביטוי גנטי
- בידוד RNA כפי שמתואר לעיל. לסנתז, באותו זמן, cDNA של כל הדגימות כדי להיות מושווה (מטופלים ולא מטופלים). המשך בשיטה המועדפת על qRTPCR.
- השתמש ב-GeNorm כדי לזהות את שני גנים התייחסות היציבה ביותר בכל פעם טיפול חדש משמש על אורגנואידים העובר. השתמש בממוצע הגיאומטרי של שני הגנים שנבחרו להתייחסות לחישובי ביטויים יחסיים.
הערה: הצעות של גנים התייחסות לבדוק את העכבר העוברי אורגנואידים: ציקלופילין, βactin, ה, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib ו Tbp. - כדי לחקור כיצד גורם חיצוני מסוים משפיע על התבגרות העוברי העכבר לאחר הלידה, כל הגנים הבאים צריך להיות מוערך.
- בדוק אם העובר סמנים לקטאז (Lct), התפתחות סטנדרטים 1 (Ass1), B לימפוציט חלבון התבגרות 1 (בלון-1) וקולטן Fc (fcrn) ירידה בביטוי במהלך השבועיים הראשונים של התרבות, נעדרים עבור זמן התרבות הנותרים (איור 4c). לנתח אם תבנית זו משתנה.
- בדוק אם סמנים מבוגרים sucrase-איזואלבורסה (Sis), arginase 2 (Arg2), trehalase (treh) ו ליזוזים (lyz) להגדיל בביטוי לאחר שבועיים של תרבות (איור 4d). לנתח אם תבנית זו שונתה על-ידי הגורם החיצוני.
הערה: Dexamethasone הוא גורם חיצוני שיכול להאיץ את ההבשלה של אורגנואידים העובר יכול לשמש כפקד חיובי בכל הניסויים שמטרתם לבדוק גורמים חיצוניים אחרים.
- ניתוח פעילות אנזימים
- בידוד חלבון כמתואר לעיל. זיהוי פעילות מעיים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו על ידי dahlqvist ומסר13,14.
- להכין 0.625 M מלפימית-מאגר pH 6.0 (לשמור על 3 חודשים ב 4 ° c). באמצעות מאגר זה, להכין 0.05 M לקטוז (להוסיף ה-p-הידרוקסיהמאואובנזואואואואואואואוסיאואואואוטויהמייצב כדי לעכב את הפעילות של ליסוזומפ-גלטוסי 0.05 מ ז; 0.05 מ ' סוכות ו-0.05 M טרהלז.
הערה: ניתן לשמור את כל הפתרונות הללו במשך 5 ימים ב -4 ° c. לשמור על קרח בזמן הכנת הזמן. - הכנת תקני הקנה על ידי דילול 5.56 M פתרון גלוקוז עם מים אלקטרופורזה להשיג פתרונות עם הריכוזים הבאים: 0.125 M; 0.1 מ'; 0.075 מ'; 0.05 m ו 0.025 M.
הערה: הפתרון יציב למשך שלושה חודשים לפחות ב -4 ° c. - מודקון בצלחת 96-באר עבור 60 דקות ב 37 ° צ':
-30 μL של אורגאיד ליפוסט עם 30μL של לקטוז
-30 μL של ארגון ליאיד עם 30μL של סוכרוז
-30 μL של 10 פעמים מדולל אורגאיד ליפוסט עם 30 μL של מלקטוז
-30 μL של חמש פעמים מדולל אורגאיד ליפוסט עם 30 μL של טרהלאז
-30 μL של ליפוסט מדולל אורגאיד עם 30 μL של חומצה מלפימית, כרקע לדוגמה
-30 μL של כל תקן גלוקוז
-30 μL של מים טהורים, כריק
-30 μL של שליטה חיובית (מיטוב דילול; רקמת המעי עוברית העובר יכול לשמש כשליטה עבור פעילות לקטאז בעוד רקמת מעיים למבוגרים יכול לשמש כשליטה sucrase, מלטאז ו trehalase)
הערה: דילול דגימות צריך להתבצע עם מאגר פירוק תאים. השאר את הדגימות ואת הצלחת על הקרח תוך כדי הכנת הסדר. - כדי לקבוע את כמות הגלוקוז המיוצר על ידי האנזימים הנמצאים לאחר הדגירה לאחר האינקובאיד עם מצעים המתאימים שלהם, להוסיף במהירות 200 μL של הפתרון PGO-color ולמדוד ספיגת bance ב 450 nm כל 5 דקות עבור 30 דקות ב 37 ° c.
הערה: להפוך את הפתרון PGO-color טרי. השתמש 10 U/mL גלוקוז-אוקסידאז, 2 U/mL peroxidase ו 7.88 mmol/L-dianisidine ב 0.5 מול/L Tris-HCl מאגר ב-pH 7.0. הפתרון צריך להיות בטמפרטורת החדר כאשר הוא מתווסף לצלחת. - חישוב פעילות בהתאם לתקן גלוקוז ונכון עבור כמות מוחלטת של חלבון (נקבע על ידי שיטת החומצה הבינותית (BCA)). פעילות אנזים צריך להתבטא כ-μM גלוקוז/μg חלבון · min-1 (איור 5b).
הערה: למדוד פעילות arginase באמצעות מסחרית זמינה הפעילות המערכת הערכה.
Representative Results
תרבות ממושכת של תאים אפיתל המעי עוברי
הפרוטוקול לחיקוי של מעבר היניקה-לגמילה בתוך מבחנה, תלוי בטיפול הנכון של אורגנואידים עוברי במהלך התרבות הממושכת. האבויה והמעי המרוחק מבודדים E18-E20 העוברים העכבר מופרדים כפי שהוצג (איור 1). עם בידוד, תאים אפיתל הם הזרע כיפות החילוץ מטריקס ג'ל (איור 2). זה בדרך כלל לוקח ארבעה מעברים ו כ 28-30 ימים של תרבות עבור אורגנואידים עוברי להבשיל למדינה מבוגרים. במהלך הזמן הזה, תאים בשלבים שונים של התבגרות ניתן לאסוף (איור 3).
הנציגה במורד הזרם של מעבר היניקה-הגמילה בחוץ-גופית
כדי לאשר שאורגנואידים עוברי בודד הם הקרוב ביותר או המרוחק, להשוות את רמת הביטוי של סמנים האבובית אחד לחתוך משפחה בן המשפחה 2 (Onecut2) ו-החלבון מאגד של טה 4 (Gata4) ו-השני סמנים חומצות שומן מחייב חלבון6 (Fabp6) ו Guanylate Cyclase Activator 2a (Guca2a) ביןהתרבויות מעבר לגמילה מחוץ לגופית ניתן לפקח על ידי שני סטים של גנים: העובר (איור 4C) וסמנים למבוגרים (איור 4c). סמנים עוברי צריך להקטין בהדרגה במהלך התרבות, בעוד הביטוי של סמנים בוגרים צריך להגדיל בהדרגה (איור 4C, D).
שימוש בגורם חיצוני כצירוף של מעבר מוצץ לגמילה בתוך מבחנה
בפרוטוקול זה דקסמטסון סינתטי glucocorticoid, שימש כדוגמה הגורם החיצוני מסוגל לשנות מעבר יניקה-לגמילה בתוך מבחנה. נתוני הנציג באיור 5 מציע כי ההשפעות של גורמים חיצוניים הם הטובים ביותר להיקבע על ידי מספר assays כפי שהם לא בהכרח צריך להיות גנומית. לדוגמה, במקרה של sucrase-איזואלבורסה הן RNA והן ביטוי חלבון הם המושרה עם דקסמטסון (איור 5a) ואילו ביטוי trehalase משתנה רק ברמת החלבון. (איור 5B).
איור 1: בידוד של המעי העוברי העכבר קטן. (א) תצלום של המעי העוברי ומתוח, כולל הקיבה, בראש ובמעיים קטנים, נספח ונקודתיים. קו שחור מציין היכן יש לחתוך את המעיים כדי לחלק את המעיים האבועיים הקטנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הנציגה המייצגת תמונות מיקרוסקופיים של התרבות האבואידית האורבית והעוברית ביום 3, יום 17 והיום 28 לתרבות. כל התמונות התקבלו ביום 3 לאחר המעבר ולהראות את הירידה במספר השעות הנוספות של spheroids. סרגל קנה מידה: 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: וידאו ייצוגית המציגה דינמיקה של תרבות עוברית, מיום 4 עד 6 של התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור 3: ייצוג סכמטי של אוסף אורגנואיד לניתוח ההבשלה של המעיים לאורך זמן. צריכות להיות מתורבתות. למשך חודש אחד ולעבור כל שבוע דגימות עבור ניתוח התבגרות יש לאסוף 3 ימים לאחר בידוד כל 3 ימים לאחר כל מעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נציג qRTPCRs של התבגרות הבטן סמנים האבואידים והעוברי העובר. (א) האבובית הOnecut2 והGata4 מבוטאים בעיקר בתרבות הארגונית ה בעוד (ב) הFabp6 והGuca2a מבוטאים בעיקר בתרבות הבין-ארגונית. (ג) סמנים העוברי lct, Ass1, בלון -1 ו fcrn ירידה ו (ד) סמנים למבוגרים Sis, Arg2, treh ו- lyz להגדיל לאורך זמן הן בתרבויות האבודית והמרוחק ביותר. קווי שגיאה מייצגים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מקדם חיצוני dexamethone יכול לווסת את ההבשלה של אורגנואידים העובר. (א) ביטוי הגנים של סמן עוברי בלון-1 הוא ירד ביום 12 של התרבות ב דקסמטסון מטופל אורגנואידים לעומת בקרת אורגנואידים, בעוד שני ביטוי הגנים (ב) ופעילות אנזימים (ג) של סמן למבוגרים sucrase-איזואלבורסה (Sis) הוא גדל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר culturing של אורגנואידים מאוחר מעיים עוברית למשך זמן ממושך לחקות מעבר היניקה-לגמילה בתוך מבחנה. תהליך ההבשלה שווה לקצב בvivo ומושלם לאחר חודש אחד בתרבות. ניתוח במטה של תרבות זו באמצעות RNA כמותי וטכניקות חלבונים מפורטים.
בפרוטוקול זה, תאי מעיים ראשוניים מעוברי E18-E20 העכבר משמשים. השלב ההתפתחותי של תאי עכבר ראשיים המשמשים להפקת אורגנואידים עבור פרוטוקול זה חשוב במיוחד. השימוש בשלב התפתחותי מוקדם יותר יגרום ליצירת מעיים המעיים השומרים על הביטוי הגנטי הספציפי שלהם במהלך תקופה ממושכת של זמן עם מעבר מוגבל לאורגנואידים למבוגרים15,16. רק מאוחר בשלב העוברי העובר מסוגלים לעבור לאורגנואידים למבוגרים ב מבחנה10. כדי למקסם את חלון ההזדמנויות ביחס להשפעה של גורמים חיצוניים על התבגרות הבטן, מעיים משלב עוברי מאוחר מומלץ ולא מעיים של גורים נולדו כי נחשפו חיידקים וחלב אמא. הוא דיווח כי מטבוליטים חיידקיים מסוימים ורכיבי חלב יכולים לשמש מכפילי התהליך ההבשלה17.
כדי להשיג כמויות מספיקות של תאים כדי לשמור על התרבות לחודש אחד כדי ללמוד את ההבשלה כולה מהלידה עד לבגרות, תוך איסוף דגימות עבור ניתוח במורד הזרם, מעיים של 6-8 עוברים צריך לשמש כחומר מתחיל. מעדיפים להשתמש בעוברים מאותו שלב התפתחותי ליצירת התרבות. אנו לא ממליצים על אגירת שינויים שונים כאשר הבדלים קלים בשלב ההתפתחותי יכולים להשפיע על ביטוי של הגנים הבגרותם.
הפרוטוקול המתואר כאן לחשבון הדור האורגואיד מהמעי הקטן והקצר ביותר כדי לשמור על תכונות התפתחותיות של מגזרים שונים של הבטן. כחלופה, המעי השלם יכול לשמש כדי לחקור התבגרות הכולל ביחס להגדיל/להקטין את הביטוי של סמנים ספציפיים. במקרה האחרון, ניתן להשתמש בפחות עוברים כדי לבודד תאי מעיים לצורך התחלת התרבות.
פרוטוקול זה מפותח באמצעות תרבויות תלת-ממדיות של אורגנואיד. כמו אורגנואידים לעבור צמיחה דינמית בתרבות, חשוב לאסוף דגימות עבור ניתוח במורד באותו זמן לאחר התהליך. בפרוטוקול זה, בחרנו את היום השלישי לאחר המעבר, כפי שהוא מייצג את הזמן הבינוני בין שתי הפיצולים שבו אורגנואידים מכילים ניצנים חזקים ומעט ללא מוות תאי. ניתן להשתמש בנקודת זמן חלופית לאחר הפסעה, אך היא צריכה להיות עקבית במהלך הניסוי כולו. אנחנו לא ממליצים אורגנואידים גדל במשך יותר מ -7 ימים לאחר מעבר, כמו גידול של תאי המוות בלומן אורגאיד יכול להשפיע על התוצאות.
בניסויים שלנו, השתמשנו דקסמטסון כדוגמה של גורם חיצוני המוצג הטוב ביותר ללמוד בספרות כדי להאיץ התבגרות מעיים ב vivo9,18. Dexamethasone מפעילה את השפעותיו באמצעות מסלולים גנומים ושאינם גנומים. לדוגמה, ברמה של תקנה גנומית, עלייה מלאה של רמות mrna של Sis ניתן לצפות. ברמה שאינה גנומית, אנו מתבוננים בשינויים בפעילות אנזימי העיכול כגון טרהלאז. שניהם מתוארים בהתאם להיבטים ספציפיים של דקסמטסון על sucrase גן הפעלה והפעלת לא גנומית השפעה על אנזימים מברשת המעי הנצפים ב vivo19. העובדה כי גורמים חיצוניים, כמו גלוקוקורטיקואידים סינתטי, יכול לווסת היבטים מסוימים של מעבר היניקה-אל-הגמילה בתרבות אורגאידית, בדומה לזה שמתואר vivo, עוד קובע את העכבר העוברי מעיים אורגנואידים כמודל לחקירה של סוג אחר של מאפטורים של התבגרות בטן.
למרות ההבשלה מורפולוגית של אפיתל המעי האנושי הושלמה ברחם בשלב הריונית של 22 שבועות, הפונקציה מחסום המעי מתבגר עד הילדות בקשר קרוב עם סוג של האכלה, פיתוח של microbiota ו תגובה חיסונית. בשל הזמינות המוגבלת של רקמות האדם בשלבים ההתפתחותיים הללו, ערך הטרנסלtional של מודל מבחנה מתורבת טמון באפשרות של מסכי תפוקה גבוהה של גורמים המסוגלים לעצב מעיים, תהליך שמור בקרב יונקים מוצצים.
חשוב מכך, ביחס לאתיקה בעלי חיים במחקר, מודל זה יכול לתרום לעידון של ניסויים בבעלי חיים כפי שאינו כולל התערבויות שבוצעו על בעלי חיים. מספר בעלי החיים ניתן לצמצם עוד יותר על-ידי עיצוב מחודש של שאלות מחקר לשתי נקודות זמן של תרבות שיאפשרו בדיקה של מספר מרכיבים בתרבות אחת.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->. מחברים לא מצהירים דבר לגלות
Acknowledgments
לא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
