Denne protokollen beskriver hvordan å etterligne patte-til-avvenning overgang in vitro ved hjelp av mus sent fosterets intestinal organoids kultivert for 30 dager.
På slutten av patte perioden, mange pattedyrarter gjennomgår store endringer i intestinal epitel som er forbundet med evnen til å fordøye fast føde. Denne prosessen er betegnet patte-til-avvenning overgang og resulterer i utskifting av nyfødt epitel med voksen epitel som går hånd i hånd med metabolske og morfologiske justeringer. Disse komplekse utviklingsmessige endringene er et resultat av et genetisk program som er iboende til tarm epitelceller, men kan til en viss grad være modulert av ytre faktorer. Langvarig kultur av mus primære intestinal epitelceller fra slutten av fosterets periode, viser patte-til-avvenning overgang in vitro. Her beskriver vi en detaljert protokoll for mus fosterets intestinal organoid kultur best egnet til å modellere denne prosessen in vitro. Vi beskriver flere nyttige analyser designet for å overvåke endringen av intestinal funksjoner knyttet til patte-til-avvenning overgang over tid. I tillegg inkluderer vi et eksempel på en ytre faktor som er i stand til å påvirke patte-til-avvenning overgang in vivo, som en representasjon av modulerende tidspunktet for patte-til-avvenning overgangen in vitro. Dette in vitro tilnærming kan brukes til å studere molekylære mekanismer av patte-til-avvenning overgangen samt modulatorer av denne prosessen. Viktigere, med hensyn til dyreetikk i forskning, erstatter jegn vivo modeller av denne in vitro-modellen bidrar til foredling av dyreforsøk og muligens til en reduksjon i bruken av dyr for å studere gut modningsprosesser.
I mange pattedyrarter, inkludert mus og menn, har nyfødt tarmen flere funksjoner som er forskjellig fra det fullt modne tarm epitel. Disse funksjonene Letter nyfødt enterocytes til å fordøye og absorbere melk, som inneholder høyt fett og lite karbohydrater, med laktose som det store karbohydrat. Pensel kanten av nyfødte tarm epitelceller uttrykker disaccharidase laktase-phlorizin Hydrolase (LCT)1 for å fordøye melken disakkarid laktose. Etter at patte perioden, enterocytes tilpasse å fordøye fast føde som er rik på komplekse karbohydrater og lite fett. Dette er manifestert ved en bryter i pensel grensen disaccharidase uttrykk fra laktase til sucrase-isomaltase (SIS) og trehalase (Treh), som kan fordøye mer komplekse karbohydrater til stede i fast føde2. En annen metabolske bryteren er knyttet til den lave konsentrasjonen av arginin i melk. Å sørge for behovet for arginin, nyfødt enterocytes uttrykke hastigheten begrense enzymet i Arginine biosyntesen, argininosuccinate syntase-1 (Ass1), til synthetize Arginine3. I kontrast, voksen enterocytes uttrykke arginase 2 (Arg2), et enzym som kan catabolizing arginin som er rikelig i solid mat. I tillegg uttrykker nyfødt tarm epitel nyfødte FC reseptoren for immunglobuliner (FcRn), som formidler absorpsjon av mors IgG fra melken inn i blodsirkulasjonen/blodbanen4. Uttrykket av FcRn avtar betydelig under patte-til-avvenning overgang5. I mus, modning av Paneth celler oppstår fødselen, sammentreffet med dannelse og modning av Krypter, og er preget av uttrykk for antimikrobielle peptider lysosome (Lyz) og defensins6.
Alle disse endringene er en del av patte-til-avvenning overgangen, en prosess som skjer gradvis etter fødselen til en måned av alder i mus, når intestinal epitel når sin eldre voksen tilstand. Patte-til-avvenning overgangen er egentlig regulert og developmentally satt i tarmen røret. Transkripsjon faktor B lymfocytter-indusert modning protein-1 (blimp-1) spiller en nøkkelrolle i denne iboende modningsprosess7. Blimp-1 er svært uttrykt i nyfødt epitel, mens uttrykket synker og er tapt under patte-til-avvenning overgang og derfor kan tjene som en pålitelig markør for nyfødte intestinal epitel. Til tross for tilværelse en iboende forarbeide, det patte-å-venne overgang kan modulert av ekstern faktorene. For eksempel er syntetisk analog av kortisol, deksametason, kjent for å akselerere tarm modning i vivo8,9.
Current in vitro-modeller som brukes til å studere intestinal epitel modning inkludert patte-til-avvenning overgangen, utnytte voksen epitel cellelinjer og/eller voksen organoids som bærer egenskapene til voksen intestinal epitel. Vi har nylig demonstrert at primære intestinal epitelceller isolert fra slutten av fosterets tarmen modne og recapitulate den patte-til-avvenning overgangen når vokser in vitro som organoids10. Vi viste videre at denne tarmen modningsprosess in vitro skjer i samme takt som i vivo. Til slutt brukte vi deksametason til å akselerere modningsprosessen på samme måte som beskrevet for in vivo Studies.
Her skisserer vi en presis protokoll for isolasjon og kultur av mus sent fosterets intestinal organoids. Vi beskriver den foretrukne måten å samle prøver for langvarig organoid kultur og metoder for å overvåke patte-til-avvenning overgang in vitro. Denne protokollen kan brukes for in vitro studier av intestinal epitel modning og modulatorer av denne prosessen og resulterer i høyere gjennomstrømning, økt kvalitet og translational verdi av data og en reduksjon av dyr bruk.
Denne protokollen beskriver dyrking av sen fosterets intestinal organoids for lengre tid å etterligne patte-til-avvenning overgangen in vitro. Modningsprosessen er lik tempoet i vivo og fullføres etter en måned i kulturen. Nedstrøms analyse av denne kulturen ved hjelp av kvantitative RNA og protein teknikker er detaljert.
I denne protokollen brukes primære tarm celler fra E18-E20 mus embryo. Den utviklingsmessige stadiet av primær mus celler brukes til å generere organoids for denne protokollen er spesielt viktig. Bruke tidligere utviklingsmessige scenen vil resultere i generering av intestinal spheroids som opprettholder deres spesifikke fosterets genuttrykk over en lengre periode med begrenset overgang tilvoksen organoids. Bare sent Foster scenen spheroids er i stand til transitt til voksen organoids in vitro10. For å maksimere vinduet av muligheter med hensyn til virkningen av ytre faktorer på Gut modning, tarmen fra slutten av Foster scenen er anbefalt og ikke tarmen fra født valper som har vært utsatt for mikrober og morsmelk. Det er rapportert at visse bakterielle metabolitter og melke komponenter kan fungere som bestemmelsesord av modningsprosessen17.
For å oppnå tilstrekkelige mengder celler for å opprettholde kulturen i en måned for å studere hele modning fra fødsel opp til voksen, mens samle prøvene for nedstrøms analyser, tarmen fra 6-8 embryo bør brukes som utgangsmateriale. Det foretrekkes å bruke embryo fra samme utviklingstrinn for å generere kulturen. Vi anbefaler ikke pooling forskjellige kull som små forskjeller i utviklingstrinn kan påvirke uttrykk for modning gener.
Protokollen som er beskrevet her står for organoid generasjon fra proksimale og hånd i tynntarmen for å opprettholde utviklingsmessige funksjoner i ulike segmenter av tarmen. Som et alternativ, kan hele tarmen brukes til å undersøke den generelle modning med hensyn til økningen/nedgang uttrykk for de spesifikke markører. I sistnevnte tilfelle kan færre embryo brukes til å isolere tarm celler for å starte kultur.
Denne protokollen er utviklet ved hjelp av tredimensjonale organoid kulturer. Som organoids gjennomgår dynamisk vekst i kulturen, er det viktig å samle prøver for nedstrøms analyser på samme tidspunkt etter passaging. I denne protokollen, har vi valgt dag 3 etter passering, som det representerer middels tid mellom to deler der organoids inneholder robuste knopper og liten eller ingen celle død. Et alternativt tids punkt etter passaging kan brukes, men det bør være konsistent under hele eksperimentet. Vi anbefaler ikke økende organoids i mer enn 7 dager etter en passasje, som økning av dødsceller i organoid lumen kan påvirke resultatene.
I våre eksperimenter har vi brukt deksametason som et eksempel på en ytre faktor som er vist og best studert i litteraturen for å akselerere tarm modning i vivo9,18. Deksametason utøver sin virkning via både genomisk og ikke-genomisk ruter. For eksempel, på nivået av genomisk regulering, en veslevoksne økning på SIS mRNA nivåer kan observeres. På et ikke-genomisk nivå, observerer vi endringer i aktiviteten av fordøyelsesenzymer som trehalase. Begge er i samsvar med beskrevne spesifikke aspekter ved deksametason på sucrase gen aktivering og ikke-genomisk aktiverings effekt på grense enzymer i tarm penselen observert i vivo19. Det faktum at ytre faktorer, som syntetisk glukokortikoider, kan modulere visse aspekter av patte-til-avvenning overgang i organoid kulturen, på samme måte som beskrevet i Vivo, etablerer videre musen fosterets intestinal organoids som en modell for etterforskning av ulike type modulatorer av gut modning.
Selv om morfologiske modning av humant intestinal epitel er fullført i Utero på svangerskaps nivå av 22 uker, intestinal barriere funksjonen modnes till barndommen i et nært forhold til den type fôring, utvikling av bakterieflora og immunrespons. På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av menneskelig vev på disse utviklingsmessige stadier, ligger den translational verdien av in vitro murine modell i muligheten for høy gjennomstrømming skjermer av faktorer i stand til modulerende intestinal modning, en prosess bevart blant pattedyr.
Viktigere, med hensyn til dyr etikk i forskning, kan denne modellen bidra til foredling av dyreforsøk som det ikke inkluderer intervensjoner utført på dyr. Antallet dyr kan reduseres ytterligere ved å omstrukturere forskningsspørsmål til en eller to tids punkter kultur som vil tillate testing av flere komponenter i en kultur.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |