Detta protokoll beskriver hur man imiterar Suckling till avvänjning övergång in vitro med hjälp av mus sena foster tarm organoider odlade i 30 dagar.
I slutet av amningsperioden genomgår många däggdjursarter stora förändringar i tarmens epitel som är förknippade med förmågan att smälta fast föda. Denna process kallas Suckling till avvänjning övergång och resulterar i utbyte av neonatal epitel med vuxet epitel som går hand i hand med metabola och morfologiska justeringar. Dessa komplexa utvecklingsmässiga förändringar är resultatet av ett genetiskt program som är inneboende i tarmen epitelceller men kan, i viss mån, moduleras av extrinsic faktorer. Långvarig kultur av mus primära intestinala epitelceller från sena foster perioden, recapitulates Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för mus fetalt intestinal Organoid kultur bäst lämpad att modellera denna process in vitro-. Vi beskriver flera användbara analyser som utformats för att övervaka förändringen av tarm funktioner i samband med diande-till-avvänjning över tiden. Dessutom, vi inkluderar ett exempel på en extrinsic faktor som kan påverka Suckling till avvänjning övergång in vivo, som en representation av modulerande tidpunkten för diande-till-avvänjning övergång in vitro-. Denna in vitro-metod kan användas för att studera molekylära mekanismer för diande-till-avvänjning övergång samt modulatorer av denna process. Viktigare, när det gäller djur etik i forskning , ersätter in vivo modeller av denna in vitro-modell bidrar till förfining av djurförsök och möjligen till en minskning av användningen av djur för att studera Gut mogningen processer.
I många däggdjursarter, inklusive möss och män, har neonatal tarmen flera funktioner som skiljer sig från den fullt mogna intestinal epitelet. Dessa funktioner underlättar neonatal enterocyter att smälta och absorbera mjölk, som innehåller hög fetthalt och låga kolhydrater, med laktos som den stora kolhydrat. Borsten gränsen av neonatal intestinal epitelceller uttrycker disackaridas lactase-phlorizin hydrolas (LCT)1 att smälta mjölken disackarid laktos. Efter diande perioden, enterocyter anpassa sig till smälta fast mat som är rik på komplexa kolhydrater och låg fetthalt. Detta manifesteras genom en switch i pensel gränsen disackaridase uttryck från laktasbrist till sucrase-isomaltase (SIS) och trehalase (Treh), som kan smälta mer komplexa kolhydrater som finns i fast food2. En annan metabolisk Switch är relaterad till den låga koncentrationen av arginin i mjölk. Att föreskriva behovet av arginin, neonatal enterocyter uttrycka den hastighetsbegränsande enzym i arginin biosyntes, argininsuccinatsyntetas syntas-1 (ass1), att syntetisera arginin3. I kontrast, vuxna enterocyter Express arginas 2 (Arg2), ett enzym som kan kataboliserande arginin som är rikligt förekommande i fasta livsmedel. Dessutom uttrycker neonatal intestinal epitel den neonatala FC-receptorn för immunglobuliner (FcRn), som förmedlar absorption av moderns IgG från mjölken i cirkulationen/blodomloppet4. Uttrycket för FcRn minskar markant under den diande-till-avvänjning övergången5. Hos möss, mognad av Paneth celler uppstår postnatally, tillfällighet med bildandet och mogningen av kryptor, och kännetecknas av uttryck av antimikrobiella peptider Lysosomen (LyZ) och defensins6.
Alla dessa förändringar är en del av Suckling till avvänjning övergången, en process som sker gradvis efter födseln till en månads ålder hos möss, när tarmens epitel når sin mogna vuxna staten. Diande-till-avvänjning övergången är i sig reglerad och developmentalt in i tarmen röret. Transkription faktor B lymfocytinducerad mognad protein-1 (Blimp-1) spelar en viktig roll i denna inneboende mogning process7. Blimp-1 är starkt uttryckt i neonatal epitel, medan dess uttryck minskar och går förlorad under diande-till-avvänjning övergången och kan därför fungera som en pålitlig markör för neonatal intestinal epitel. Trots att en inneboende process, den Suckling till avvänjning övergången kan moduleras av externa faktorer. Till exempel, den syntetiska analoga kortisol, dexametason, är känt för att påskynda Gut mogningen in vivo8,9.
Aktuella in vitro-modeller som används för att studera intestinal epitelial mognad inklusive Suckling till avvänjning övergången, utnyttja vuxna epitelial cellinjer och/eller vuxna organoider som bäregenskaper hos vuxna intestinal epitel. Vi har nyligen visat att primära intestinala epitelceller isolerade från sena foster tarmen mogna och recapitulate den Suckling till avvänjning övergången när de växer in vitro-som organoider10. Vi visade vidare att denna Gut mogning process in vitro sker i samma takt som in vivo. Slutligen använde vi dexametason för att påskynda mogningen på samma sätt som beskrivs för in vivo studier.
Här skisserar vi ett exakt protokoll för isolering och kultur av mus sena foster tarm organoider. Vi beskriver det föredragna sättet att samla prover för långvarig Organoid kultur och metoder för att övervaka Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Detta protokoll kan användas för in vitro-studier av intestinal epitelial mognad och modulatorer av denna process och resulterar i högre genomströmning, ökad kvalitet och translationell värde av data och en minskning av djurens användning.
Detta protokoll beskriver odling av sena foster tarm organoider för långvarig tid att efterlikna Suckling till avvänjning övergång in vitro-. Mognaprocessen är lika med tempot in vivo och avslutas efter en månad i kulturen. Nedströms analys av denna kultur med hjälp av kvantitativa RNA och protein tekniker är detaljerade.
I detta protokoll används primära tarmceller från E18-E20 mus embryon. Den utvecklingsstadium av primära musceller som används för att generera organoider för detta protokoll är särskilt viktigt. Använda tidigare utvecklingsstadiet kommer att resultera i generering av intestinal spheroids som upprätthåller deras specifika foster genuttryck under en längre tid med begränsad övergång till vuxna organoider15,16. Endast sena fosterstadiet spheroids är kapabla att transitera till vuxna organoider in vitro-10. För att maximera fönstret av möjligheter med avseende på effekterna av extrinsic faktorer på Gut mognad, tarmar från sena fosterstadiet rekommenderas och inte tarmarna från födda ungar som har utsatts för mikrober och modersmjölk. Det rapporteras att vissa bakteriella metaboliter och mjölk komponenter kan fungera som modifierare av mogningen processen17.
För att få tillräckliga mängder av celler för att bibehålla kulturen i en månad för att studera hela mogningen från födseln upp till vuxen ålder, medan insamling av proverna för nedströms analyser, tarmarna från 6-8 embryon bör användas som utgångsmaterial. Det är att föredra att använda embryon från samma utvecklingsstadiet för att skapa kulturen. Vi rekommenderar inte att samla olika kullar som små skillnader i utvecklingsstadiet kan påverka uttrycket av mognads gener.
Det protokoll som beskrivs här står för Organoid generation från proximala och distala tunntarmen för att bibehålla utvecklingsfunktioner i olika segment av tarmen. Som ett alternativ, hela tarmen kan användas för att undersöka övergripande mognad med avseende på öka/minska uttrycket av de specifika markörer. I det senare fallet skulle färre embryon kunna användas för att isolera tarmceller för att starta kulturen.
Detta protokoll är utvecklat med hjälp av tredimensionell Organoid kulturer. Som organoider genomgår dynamisk tillväxt i kulturen, är det viktigt att samla in prover för nedströms analyser på samma gång punkt efter passaging. I detta protokoll har vi valt dag 3 efter passage, eftersom det representerar medellång tid mellan två splittringar där organoider innehåller robusta knoppar och lite eller ingen celldöd. En alternativ tidspunkt efter passaging kan användas, men det bör vara konsekvent under hela experimentet. Vi rekommenderar inte växande organoider i mer än 7 dagar efter en passage, som ökning av död celler i Organoid lumen kan påverka resultaten.
I våra experiment har vi använt dexametason som ett exempel på en extrinsic faktor som visas och bäst studeras i litteraturen för att påskynda intestinal mognad in vivo9,18. Dexametason utövar sina effekter via både genomiska och icke-genomiska vägar. Till exempel, på nivån för genomisk reglering, en brådmogen ökning av SIS mRNA nivåer kan observeras. På en icke-genomisk nivå, vi Observera förändringar i aktiviteten av matsmältningsenzymer såsom trehalase. Båda är i enlighet med beskrivna specifika aspekter av dexametason på eller sukras genaktivering och icke-genomisk aktiverande effekt på intestinal borste gräns enzymer observerade in vivo19. Det faktum att extrinsic faktorer, som syntetiska glukokortikoider, kan modulera vissa aspekter av Suckling till avvänjning övergång i Organoid kulturen, på samma sätt som beskrivs i vivo, ytterligare etablerar mus fetala tarm organoider som en modell för utredning av olika typer av modulatorer av Gut mognad.
Även om den morfologiska mogningen av mänskligt intestinal epitel är avslutad i livmodern vid graviditetsdiabetes skede av 22 veckor, den tarmbarriären funktionen mognar till barndomen i en nära relation med vilken typ av utfodring, utveckling av bakterieflora och Immunsvar. På grund av den begränsade tillgången på mänskliga vävnader i dessa utvecklingsstadier, det translationella värdet av in vitro murina modell ligger i möjligheten att hög genomströmning skärmar av faktorer som kan modulera intestinal mognad, en process bevarad bland diande däggdjur.
Viktigast av allt, när det gäller djur etik inom forskningen, kan denna modell bidra till förfining av djurförsök eftersom det inte omfattar interventioner som utförs på djur. Antalet djur kan minskas ytterligare genom att omdesigna forskningsfrågor till en eller två tidspunkter av kultur som gör det möjligt att testa flera komponenter inom en kultur.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |