Her beskriver vi en pålidelig metode til måling af mitokondriel masse og membran potentiale i ex vivo kulturperler hæmatopoietiske stamceller og T-celler.
En fin balance mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering er nøglen til at bevare den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) pulje og opretholde livslang produktion af alle modne blodlegemer. I de seneste år cellulære metabolisme er dukket op som en afgørende regulator af HSC funktion og skæbne. Vi har tidligere påvist, at graduering af mitokondrie metabolisme påvirker HSC skæbne. Specifikt ved kemisk frakobling af elektrontransportkæden var vi i stand til at opretholde HSC-funktion under kulturforhold, der normalt inducerer hurtig differentiering. Begrænsning af HSC-numre udelukker imidlertid ofte brugen af standard analyser til måling af HSC-metabolisme og forudser derfor deres funktion. Her rapporterer vi en simpel flow flowcytometri assay, der giver pålidelig måling af mitokondriel membran potentiale og mitokondrie masse i knappe celler som hscs. Vi diskuterer isolering af HSCs fra mus knoglemarv og måling af mitokondrie masse og membran potentiel post ex vivo kultur. Som et eksempel viser vi moduleringen af disse parametre i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Desuden udvider vi anvendelsen af denne metode på humane perifere blod afledte T-celler og humane tumor infiltrerende lymfocytter (TILs), der viser dramatiske forskelle i deres mitokondrielle profiler, der muligvis afspejler forskellige T-celle Funktionalitet. Vi mener, at denne analyse kan anvendes i screeninger til at identificere modulatorer af mitokondrie metabolisme i forskellige celletyper i forskellige sammenhænge.
Hæmatopoietiske stamceller (HSCs) er en lille population af celler bosat i knoglemarven sikre blod produktion og homøostase i hele organismens levetid. Hscs mægle denne proces ved at give anledning til stamceller, der igen producerer terminalt differentieret modne blodlegemer nedstamningens via flere runder af celledeling og godt orkestreret differentiering trin1. Det er vigtigt, at HSCs producerer deres energi via anaerob glycolyse. I modsætning hertil, mere engagerede og aktive hæmatopoietiske progenitorer skifte deres stofskifte mod mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne særskilte metaboliske tilstand menes at beskytte hscs fra cellulære skader påført af reaktive oxygenarter (ros) produceret af aktive mitokondrier, og derved opretholde deres langsigtede in vivo funktion5,6,7,8. Direkte måling af HSC metaboliske tilstand er udfordrende og ofte lav gennemløb på grund af deres begrænsede antal. Her beskriver vi en flow cytometry-baseret analyse for robust måling af mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) ved hjælp af tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) Fluorescens, og mitokondrie masse ved hjælp af en grøn fluorescerende mitokondrie bejdset (Mitotracker grøn) i HSCs. Vi har tidligere påvist, at Low ΔΨm er en bona fide funktionel markør af højt rensede hscs9 og metaboliske modulatorer, der kan sænke ΔΨm forbedre hscs funktion9,10. Her foreslår vi brug af vores metode på hscs mitokondrie profilering som strategi til at identificere nye molekyler, som kan forbedre hscs ‘ langsigtede potentiale for rekonstitution af blodet.
Som et eksempel viser vi, at denne analyse pålideligt måler sænkningen af HSC ΔΨm ved udsættelse for vitamin B3 analog nicotinamid riboside (NR). Derfor viser vi i vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, at NR kraftigt forbedrer blod genvinding efter transplantation i både mus og humaniseret muse systemer ved direkte at forbedre hæmatopoietisk stilk og progenitorfunktioner10. Kapaciteten af sådanne metaboliske modulatorer er af stor klinisk værdi i betragtning af, at en 25% dødelighed er forbundet med forsinkelse i blod og immun opsving i posttransplanterede patienter11,12.
Desuden, vi fremlægger bevis for, at denne metode kan anvendes til karakterisering af den metaboliske profil og funktion af humane T-celler. I de seneste år, udvikling af adoptivcelle terapi (ACT) ved hjælp af autologt tumor infiltrerende lymfocytter (TILs) er blevet den mest effektive tilgang til visse typer af fremskreden kræft med ekstremt ugunstig prognose (f. eks metastatisk melanom, hvor > 50% af patienterne reagerer på behandling og op til 24% af patienterne har fuldstændig regression)13. Men, tils husly tilstrækkelig antitumoraktivitet er vanskelige at generere14. Den omfattende spredning og stimulering, som TILs undergår under ex vivo-ekspansion, forårsager T-celle udmattelse og-senescens, der dramatisk hæmmer T-cellens antitumor respons15. Det er vigtigt, at tils ‘ antitumoralske kapacitet er tæt knyttet til deres metabolisme16,17 og tilgange, der har til formål at moduere metabolismen gennem hæmning af PI3K/akt-vejen, har resulteret i opmuntrende resultater18,19. Af denne grund sammenligner vi ΔΨm af T-celler afledt af mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) og patient afledte TILs, og viser, at mindre differentierede PBMC-afledte T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til terminalt differentierede TILs.
Vi forestiller, at denne analyse kan bruges til at identificere nye metaboliske modulatorer, der forbedrer HSC og T celle funktion via modulering af ΔΨm.
En stram regulering af HSC-funktionen er vigtig for at opretholde stabil hæmatopoiese under en organismes levetid. Ligesom forskellige andre celletyper i kroppen, en nøglekomponent, der bidrager til reguleringen af HSC funktion er cellulære metabolisme. Tidligere undersøgelser fra vores Lab9 og andre2,3 har impliceret betydningen af mitokondrier i at opretholde en distinkt metabolisk tilstand i hscs. på grund af det ekstremt lave anta…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker UNIL flow cytometry Core-faciliteten for deres støtte, især Dr. Romain Bedel. Dette arbejde blev støttet af Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant til N. V og O.N.
5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |