Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.
Een fijne balans van quiescentie, zelf vernieuwing en differentiatie is de sleutel om de hematopoietische stamcel (HSC) pool te behouden en levenslange productie van alle volwassen bloedcellen te handhaven. In de afgelopen jaren is cellulaire metabolisme ontstaan als een cruciale regulator van HSC functie en het lot. We hebben eerder aangetoond dat modulatie van mitochondriale metabolisme invloed heeft op HSC Fate. Met name door chemisch ontkoppelen van de elektronentransport keten konden we de HSC-functie behouden in cultuuromstandigheden die normaliter een snelle differentiatie veroorzaken. Het beperken van HSC-nummers verzet zich echter vaak tegen het gebruik van Standaardtesten om het HSC-metabolisme te meten en daarom hun functie te voorspellen. Hier rapporteren we een eenvoudige Flowcytometrie assay die betrouwbare meting van het mitochondriale membraan potentieel en mitochondriale massa in schaarse cellen zoals HSCs mogelijk maakt. We bespreken de isolatie van HSCs van muis beenmerg en meting van de mitochondriale massa en membraan potentiële post ex vivo cultuur. Als voorbeeld tonen we de modulatie van deze parameters in HSCs via behandeling met een metabole modulator. Bovendien verlengen we de toepassing van deze methodologie op menselijk perifeer bloed-afgeleide T-cellen en humane tumor infiltrerende lymfocyten (TILs), met dramatische verschillen in hun mitochondriale profielen, mogelijk weerspiegelen verschillende T-cel Functionaliteit. Wij geloven dat deze assay kan worden gebruikt in screenings om modulatoren van mitochondriale metabolisme in verschillende celtypen in verschillende contexten te identificeren.
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn een kleine populatie van cellen die zich in het beenmerg bevinden en zorgen voor bloed productie en homeostase gedurende de levensduur van een organisme. HSCs bemiddel dit proces door de aanleiding te geven tot voor ouders die op hun beurt terminaal gedifferentieerde rijwaarden van volwassen bloedcellen produceren via verschillende ronden celdeling en goed georkestreerde differentiatie stappen1. Belangrijker, HSCs produceren hun energie via anaerobe glycolyse. In tegenstelling, meer geëngageerde en actieve hematopoietische voor ouders schakelen hun metabolisme naar mitochondriale metabolisme2,3,4. Deze verschillende metabole toestand wordt verondersteld om de hscs beschermen tegen cellulaire schade toegebracht door reactieve zuurstof soorten (Ros) geproduceerd door actieve mitochondriën, waardoor hun lange termijn in vivo functie5,6,7,8. Directe meting van de metabole toestand van HSC is uitdagend en vaak een lage doorvoer vanwege hun beperkte aantallen. Hier beschrijven we een flow cytometrie-gebaseerde assay voor robuuste meting van het Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) met behulp van tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) fluorescentie en mitochondriale massa met behulp van een groene fluorescerende mitochondriale vlek (Mitotracker Green) in HSCs. We hebben eerder aangetoond dat low ΔΨm een bona fide functionele marker is van zeer gezuiverde hscs9 en metabole modulatoren die in staat zijn om ΔΨm Verbeter hscs functie9,10te verlagen. Hier stellen we voor om gebruik te maken van onze methode op HSCs mitochondriale profilering als strategie om nieuwe moleculen te identificeren die in staat zijn om het Long-term bloed reconstitutie potentieel van de HSCs te verbeteren.
Als voorbeeld tonen we aan dat deze assay de verlaging van HSC ΔΨm op betrouwbare wijze meet bij blootstelling aan vitamine B3 analoge Nicotinamide riboside (NR). Dienovereenkomstig, in onze onlangs gepubliceerde studie laten we zien dat NR sterk verbetert bloed herstel posttransplantatie in zowel muis en gehumaniseerd muis systemen door direct te verbeteren hematopoietische stam en voorlopercellen functies10. De capaciteit van dergelijke metabole modulatoren is van grote klinische waarde gezien het feit dat een 25% sterftecijfer is gekoppeld aan vertraging in bloed en immuun herstel bij postgetransplanteerde patiënten11,12.
Bovendien leveren wij bewijs dat deze methodologie kan worden toegepast voor de karakterisering van het metabolische profiel en de functie van menselijke T-cellen. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van adoptie celtherapie (ACT) met behulp van autologe tumor infiltrerende lymfocyten (TILs) de meest effectieve aanpak geworden voor bepaalde vormen van gevorderde kanker met extreem ongunstige prognose (bijv. gemetastaseerd melanoom, waarbij > 50% van de patiënten op de behandeling reageert en tot 24% van de patiënten volledige regressie heeft)13. Echter, TILs harkotteren voldoende antitumorale activiteit zijn moeilijk te genereren14. De uitgebreide proliferatie en stimulatie die TILs ondergaan tijdens de ex-vivo-expansie veroorzaken T-cel uitputting en senescentie die de antitumorale respons van de T-cel drastisch aantasten15. Belangrijk is dat de antitumorele capaciteit van de tils nauw verbonden is met hun metabolisme16,17 en benaderingen die gericht zijn op het moduleren van metabolisme door de remming van het PI3K/Akt-traject, positieve resultaten hebben opgeleverd18,19. Om deze reden vergelijken we de ΔΨm van T-cellen die zijn afgeleid van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en TILs die afkomstig zijn van de patiënt, en laten zien dat minder gedifferentieerde PBMC-afgeleide T-cellen een lagere ΔΨm en mitochondriale massa hebben in vergelijking met terminaal gedifferentieerde TILs.
We stellen voor dat deze test kan worden gebruikt om nieuwe metabole modulatoren te identificeren die de functie HSC en T Cell verbeteren via de modulatie van ΔΨm.
Een strakke regulering van de HSC-functie is belangrijk om stabiele hematopoiese te handhaven tijdens de levensduur van een organisme. Net als verschillende andere celtypen in het lichaam, een belangrijke component die bijdraagt aan de regulering van de functie HSC is cellulaire metabolisme. Eerdere studies van ons lab9 en anderen2,3 hebben het belang van mitochondriën betrokken bij het handhaven van een duidelijke metabole toestand in hs…
The authors have nothing to disclose.
We danken de UNIL flow Cytometry core faciliteit voor hun ondersteuning, vooral Dr. Romain bedel. Dit werk werd gesteund door de Kristian Gerhard Jebsen Stichting Grant aan N. V en AG
5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |