microfluidic الرقمية القائمة على الكهربية هي تقنية تستخدم تغييرًا مدفوعًا بالجهد في زاوية الاتصال الظاهرة لقطرة بحجم ميكرولتر لتسهيل التلاعب بها. الجمع بين هذا مع الخرز المغناطيسي وظيفية تمكن من دمج عمليات وحدة مختبرية متعددة لإعداد عينة وتحديد مسببات الأمراض باستخدام الانزيم المرتبطة المناعة الاختزال (ELISA).
الكهربية هو التأثير الذي يتم من خلاله تعديل زاوية الاتصال للقطرة المعرضة لشحنة سطحية. Electrowetting على عازل (EWOD) يستغل خصائص عازلة من الأفلام رقيقة عازل لتعزيز كثافة الشحن ، وبالتالي تعزيز تأثير الكهربية. ويؤدي وجود الشحنات إلى انتشار القطرة الناجمة عن ذلك بالكهرباء مما يسمح بالتلاعب الهادف عبر سطح مسعور. هنا، نُظهر بروتوكولًا قائمًا على EWOD لمعالجة العينات والكشف عن أربع فئات من المستضدات، باستخدام منصة تشغيل سطحية آلية، من خلال نوعين مختلفين من طرق الفحص المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA). يتم تنفيذ ELISA على الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة الأولية المشلولة التي يمكن اختيارها لاستهداف مستضد معين. يرتبط الجسم المضاد المترافق مع HRP بالمستضد ويتم خلطه مع H2O2/Luminol للقياس الكمي لمسببات الأمراض التي تم التقاطها. تم تحقيق أوقات الانتهاء من الدراسة بين 6 و 10 دقيقة ، في حين تم استخدام كميات ضئيلة من الكواشف.
وتهدف الطريقة المقترحة إلى تسهيل إعداد العينات الآلية لـ ELISA من خلال الكشف الكمي عن المستضدات باستخدام النهج القائم على EWOD مع الموائع الدقيقة الرقمية (DMF) والفصل المغناطيسي. وقد ثبت للتطبيقات البيولوجية المتعددة أن DMF في تركيبة مع magnetophoresis هو بديل مثير للاهتمام لتطبيقات التعامل مع السائل1. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الكشف عن مسببات الأمراض هو جانب ضمني في العديد من القطاعات، بدءا من الرعاية الصحية2 إلى الزراعة والبيئة3،4 إلى الأمن القومي5. يجب أن تتميز تقنية الكشف القادرة على التصدي للتهديدات الناجمة عن مسببات الأمراض بإنتاجية عالية (مثل وقت إجراء تحليل قصير) وكفاءة (الحد المنخفض للكشف – LoD – والحساسية العالية) وخصوصية (لنوع مسببات الأمراض المستهدفة) لتكون وظيفية6.
سابقا، وقد تم تنفيذ DMF EWOD المستندة بنجاح لالنسخ العكسي البوليمرات سلسلة التفاعل (RT-PCR)، والكشف عن مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية (Methicillin مقاومة المكورات العنقودية أو MRSA)، M.pneumonia و C.albicans باستخدام منخفضة الميزانية، وطباعة الدوائر الكهربائية رقاقة والمغناطيسيوفوريس7. تم تطبيق هذه التقنية أيضا للكشف عن الحمض النووي deoxyribonucleic (الحمض النووي) الطفرات من خلال البيروالتسلسل والكشف chemiluminescent8. كما تعمل المنصات القائمة على EWOD على توسيع وظائفها نحو تطبيقات المناعة ، وبالتالي تمكين استرداد العينات واكتشافها في وقت واحد جميعًا داخل منصة واحدة متكاملة. على سبيل المثال ، تم إثبات تصميم واحد لرقاقة EWOD بنجاح مع منصة DMF لاختبار نقطة الرعاية لكل من الاختبارات المناعية المستندة إلى الحبوب من تروبونين القلب الأول من عينة دم كاملة وكتجربة منفصلة RT-PCR للكشف عن MRSA2. هذه الشريحة تستخدم حشو الزيت، الذي يمنع تبخر القطرات ويسهل التلاعب الآلي الموثوق به لأحجام النانولتر. تم التحقيق في التطبيقات الحيوية المتعددة الاستخدامات مع تنفيذ نهج DMF مماثلة تغطي الاختبارات المناعية الكمية المتجانسة وغير المتجانسة9،10 بما في ذلك تصميم الدراسات التجارب (DoE) لتحسين معلمة التحليل11.
على الرغم من مزاياه الواضحة لمعالجة التكثيف بسبب أحجام العمل الضئيلة ، فإن منصة DMF المليئة بالنفط يمكن أن تكون صعبة وتتطلب مستوى معينًا من الخبرة للعمل. الأنظمة المملوءة بالنفط، لأنها تتطلب مكونًا مختومًا، ليست مثالية لتطبيق معين في الميدان حيث تكون قابلية نقل النظام مهمة. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون من الصعب جداً، إن لم يكن من المستحيل، استخدام نظام قائم على النفط في بعض التطبيقات المحددة التي تستفيد من جمع المواد الجافة على سطح مثل ما اقترحه تشاو وتشو12،ويونسون – نيدزيولكا وآخرون13،وفوات وآخرون14. في المقابل ، أنظمة خالية من النفط بسيطة لدمج ولها ميزة توفير سهلة رقاقة إلى رقاقة الترجمة عينة. ولهذه الأسباب، تم تطوير الطريقة المقترحة لتوفير عملية تقييم للمناعة المستندة إلى EWOD على DMF والتي لا تتطلب النفط، مما يبسط عملية الجهاز بشكل فعال.
في هذه المساهمة ، نقدم تقريرًا عن استخدام منصة DMF مخصصة وقائمة بذاتها ومؤتمتة بالكامل للاختبارات المناعية ، ونوضح بروتوكول الكشف السريع للجزيئات الحيوية ، وهي: البروتينات والبكتيريا النباتية والجراثيم البكتيرية والفيروسات. وقد ثبت بالفعل مزيج من رقاقة EWOD مع الجسيمات المغناطيسية لإعداد العينة الآلي والهطول المناعي مع قياس MS إضافية خارج الخط15. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات التشخيص الميداني ضد الحصبة والحصبة الألمانية IgG في سكان شمال غرب كينيا النائية من قبل مجموعة ويلر16. كل من ويلر ونظامنا ، ويجري نقلها ، مكتفية ذاتيا ، مؤتمتة بالكامل مع وشملت على رقاقة ، والقياسات chemiluminescent في الوقت الحقيقي يمكن القول من بين أنظمة DMF الكشف الحيوي الأكثر تقدما المتاحة.
وقد تم تصميم النظامين مع تطبيقات مختلفة جدا في الاعتبار. يستهدف نظام ويلر العلامات الحيوية للسماح بالتشخيص الطبي الحيوي على المرضى في حين أن نظام الكشف الحيوي لدينا مبني حول متطلبات الدفاع للكشف المباشر عن مسببات الأمراض التي تم أخذ عينات منها سابقًا من الهواء. والتشابه بين الاثنين هو المبدأ الأساسي لتشغيل القطرات، الذي يبين النطاق الواسع للقطاعات المؤثرة على الحياة التي يمكن أن تؤثر فيها التكنولوجيا القائمة على EWOD. وعلى وجه التحديد، يمكن لمنصة الكشف القائمة على حركة الدوحة للأمراض ونظام EWOD المرتبط بها أن تجد آثاراً رئيسية في مجال الصحة (التشخيص الطبي الحيوي)؛ الحماية العسكرية والمدنية (الكشف عن التهديدات)؛ التكنولوجيا الزراعية (رصد المحاصيل) وسلامة العمل (مراقبة البيئة الخاضعة للرقابة)
يتم تقييم أداء منصة DMF لدينا مقابل الكشف الآلي بالكامل عن الزلال المصل البشري (HSA ، بروتين كروي) ، Escherichia coli (E. coli، بكتيريا نباتية) ، عصيات atrophaeus (BG، بوغ بكتيري) و MS2 (فيروس البكتريا). والأهم من ذلك ، فإن طريقة DMF المقترحة متعددة الاستخدامات للغاية بمعنى أنه يمكن تبادل الأجسام المضادة للالتقاط لاستهداف اكتشاف مستضدات أخرى مختلفة عن الأربعة التي يتم النظر فيها في هذه المقالة. تجنب الاستشعار القائم على الأجسام المضادة تماما، يمكن أن منصة DMF بناء لتطبيق محتمل على أساس الاستشعار عن الموجات aptamer، حيث الخرز المغناطيسي تحمل aptamers محددة لالتقاط و / أو الكشف عن النيوكليوتيدات. يتم الكشف عن تصميم وتحقيق المكونات المختلفة التي تشكل منصة DMF متكاملة ومكتفية ذاتياً تمامًا ، بما في ذلك مولد الموجي عالي الجهد وإلكترونيات القيادة في مكان آخر6.
بروتوكول EWOD المناعة مرنويمكن أن تشمل عددا ً من عمليات الوحدات المختبرية (على سبيل المثال، التقاط المستضد، والاختلاط، والحضانة، واستخراج الخرز، والغسيل) اعتماداً على نوع الكاشف، والاستقرار ومتطلبات الاستخدام المحددة من قبل بروتوكول الفحص. كدليل على المبدأ ، في المادة الحالية ، يعتبر بروتوكولان مناعيين يظهران تنفيذ ثمانية أو عشرة من الـ LUOs(الشكل 4)مع شريحة EWOD الموصوفة. مثل هذه المزايا miniaturization من microliter، مجلدات منفصلة من الكواشف / analyte التي تزيد من فعالية ELISA عن طريق الحد من كل من استهلاك الكواشف، والوقت اللازم لكل عملية، أساسا، الوقت التجريبي الكلي (6 إلى 10 دقيقة). وعلاوة على ذلك، يتم إجراء اختبار الآلي مع التلاعب في الوقت المناسب من قطرات مما يقلل من الاختلافات ويحسن دقة مناعي17. تتضمن التجربة في شكلها الحالي معالجة يدوية للقطرات في بداية كل عملية اختبار، وهي نقطة لمزيد من المناقشة في القسم التالي.
خطوة واحدة حاسمة في طريقة DMF الحالية هو الاستغناء عن قطرات على سطح رقاقة EWOD. عادة، يتم استخدام ميكروبيبيت مع طرف المتاح لقياس حجم الدقيق وتحميله. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح من الصعب شل القطرة على سطح الكاره للماء من لوحة التشغيل بسبب التفاعلات بين القطرة والسطح المشحون للطرف القابل للتصرف. ونتيجة لذلك، يمكن أن تقذف قطرات متابعة السطح الخارجي للطرف بدلاً من البقاء على لوحة. لتجنب هذا ، يجب أن تعقد micropipette في وضع تستقيم ، عمودي على سطح رقاقة ، دون لمسها ، ثم يمكن الاستغناء عن قطرات على لوحة التحميل عن طريق جعلها في اتصال مع السطح. وينبغي أن عصا قطرات إلى طرف ماصة، وإعادته إلى حل الأسهم، وتبادل تلميح وإعادة إيداع قطرة جديدة. وفي تطور آخر لنظام إثبات المفهوم الحالي، يمكن تصور التسليم التلقائي للقطرات.
خطوة أخرى حاسمة، قبل تشغيل الحسب، هو إغلاق غطاء التجميع لوحة متوازية. كما ذكر سابقا في البروتوكول، يجب أن ينزلق الغطاء على رأس لوحة التشغيل. يمنع السطح الكاره للماء للغطاء تشويه وإزاحة القطرات الجالسة على لوحة التشغيل. لضمان الحركة السلسة للقطرات ، يوصى بشدة باستخدام لوحة التشغيل البكر ، والتحميل الصحيح للقطرات وتجميع الشرائح. إمكانية إعادة استخدام لوحات التشغيل ممكن; ومع ذلك ، فإن عدد الدورات يعتمد على الفولتية الفولتية الفولتية(الشكل 3)وترسب analyte / كاشف على السطح ، ويعرف أيضا باسم biofouling. استخدمت المنصة المقدمة رقاقة EWOD المطبوعة بالكروم ، والتي يمكن إعادة استخدامها بشكل موثوق للقياسات المتتالية تصل إلى أربع مرات في الجهد التشغيلي من 120 V وتنظيف اللوحة المتوسطة بعد كل تجربة. تم إعادة تدوير لوحات، للحد من تكلفة التجربة الواحدة، عن طريق إزالة التلوث (تنظيف السطح بالتنظيف مع عامل التنظيف غير مخفف قبل الشطف بدقة) وbiofouled المفلورة غير متبلور(جدول المواد)طلاء وتدور طلاء واحد جديد على رأس لوحة. ومع ذلك ، يتطلب إعادة تدوير لوحة التشغيل مناولة يدوية ، وكواشف مكلفة (البوليمرات الفلورية غير المتبلور(جدول المواد))والمعدات المتخصصة (spin-coater). يتم التحقيق في رقائق EWOD البديلة بنجاح مع ركائز فعالة من حيث التكلفة مثل الورق19، أفلام خلات أو لوحات الدوائر المطبوعة (PCBs)20،21. ويمكن لهذه المواد الاستهلاكية التي يمكن التخلص منها أن تيسر الاستخدام الموثوق والميسور التكلفة لمنصة DMF ويمكن أن توفر وسائل لتجنب مسألة القاذورات البيولوجية.
القذورات الحيوية هو القيد الرئيسي لEWOD للتطبيقات البيولوجية22,23. وقد حددت الدراسات السابقة على DMF آليتين تساهمان في القاذورات الحيوية ، وهما الامتزاز السلبي بسبب التفاعلات الكارهة للماء ، والامتزاز الذي يحركه امتالية كهربائية ثابتة تظهر عند تطبيق حقل كهربائي24. النتائج في المادة الحالية تتسق مع هذه النظرية كما تم توثيق لوحة قابلية الاستخدام يقلل من الفولتية تشغيل عالية. أحد التفسيرات الممكنة هو أن البروتينات الممتزة بسهولة على أسطح فلووبوليمر المغلفة (مثل تفلون) والتجميع بشكل أسرع على كريهة بالمقارنة مع الأسطح البكر24. ونتيجة لذلك، من الصعب تحديد الاختبارات المتعلقة بالبروتين على DMF وقد تواجه فقدان تحليل النفس والتلوث المتبادل والدقة المتضائلة17. السيناريو الأسوأ هو عندما كمية حرجة من امتصاص البروتين مما يجعل الجهاز عديم الفائدة. لتقليل القذورات الحيوية ، تم التحقيق في العديد من النهج من تقليل وقت الإقامة للقطرة على الشريحة ، من خلال الطلاء23، إلى المواد المضافة (أي المواد السطحية أو حمض البلوروينك) في قطرات المواد الحيوية المحملة6،22. ومن ثم فإن أحد الجوانب الهامة في عملية إجراء المناعة على EWOD هو اختيار استراتيجيات مضادة للقاذورات الحيوية التي تتوافق مع البروتوكول المحدد في متناول اليد.
تم تصميم منصة DMF الآلية لإجراء اختبار ELISA واحد لكل شوط من السندويشات مع استخدام وحدات تخزين ميكرولتر لكل من الكواشف وanalyte. عندما يكون مطلوبا، ساندويتش التقليدية مجموعات ELISA موجودة على أساس لوحات مغلفة مسبقا 96-well أو 384-well التي تؤدي إلى تركيبة مع معدات المختبرات المساعدة في إنتاجية أعلى لكل شوط؛ على أساس سعر الكواشف فقط ، فإن التكلفة التقريبية للكمية / البئر هي 6.04 دولار أمريكي (580 دولارأمريكي / 96) و 0.33 دولار أمريكي (2 × 580 دولارأمريكي / 384) على التوالي. وهذا يجعل أساليب ELISA التقليدية مثالية لعدد كبير من العينات التي يتم معالجتها عادة من قبل الموظفين التقنيين المدربين في مرافق المختبرات المركزية. غير أنه في المواقع النائية، أظهر التحليل التفصيلي لتكاليف ELISA للرصد البيئي أنه عندما أدرجت التكاليف الرأسمالية (أي تكاليف التشغيل المختبرية، والتكاليف المتكررة، ونقل العينات، والإمدادات، والأفراد) كان السعر الفعلي لكل ELISA 60 دولارا من دولارات الولايات المتحدة منها 34 دولارا للإمدادات لكل عينة25. في المقابل ، فإن منصة DMF المقترحة محمولة ، وتتطلب الحد الأدنى من التدريب للعمل ، ومع الخرز المغلف مسبقًا يمكن أن يوفر تحليلًا من عينة إلى إجابة في دقائق. ومن ثم، يمكن نشر التكنولوجيا المعروضة في مواقع نقاط الاحتياج واستكمال التحليلات المتاحة في المختبرات المركزية.
في قسم النتائج التمثيلية ، تم استخدام منصة المناعة DMF الآلية للكشف المباشر عن مسببات الأمراض من أجل التطبيقات الدفاعية. وتشمل التطبيقات المحتملة الأخرى لمنصة DMF على سبيل المثال لا الحصر التشخيص الحيوي والرصد المستمر وأخذ العينات الآلية. من المحتمل أن يؤثر صندوق التنمية المستدامة على قطاعات متنوعة من نقطة الرعاية للرعاية الصحية الشخصية ، وكذلك مراقبة البيئة الخاضعة للرقابة لحماية المرضى من العدوى المكتسبة من المستشفى المحمولة جواً ، إلى نظام مراقبة المحاصيل للزراعة و إنتاج الغذاء.
The authors have nothing to disclose.
نود أن ننوه بمساهمة زملائنا من مجموعة أبحاث Microfluidic والهندسة الدقيقة لعملهم في التصميم الميكانيكي وتكامل النظام. ويود المؤلفون أن يشكروا شركة Dstl Porton Down على دعمهم الذي لا يقدر بثمن ومساهمتهم المالية، للمشاريع السابقة والجارية التي تزيد من تطوير تقنية DMF وتطبيقاتها.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |