Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.
Elektrowetting, yüzey yüküne maruz kalan bir damlacık kontak açısının değiştirildiği etkidir. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) yük yoğunluğunu artırmak ve dolayısıyla elektrowetting etkisini artırmak için ince yalıtkan filmlerin dielektrik özelliklerinden yararlanır. Yüklerin varlığı, hidrofobik bir yüzeyde kasıtlı manipülasyona izin veren damlacıkların elektriksel olarak yayılmasına neden olabilir. Burada, enzime bağlı İmmünosorbent (ELISA) yöntemlerinin iki varyasyonu aracılığıyla otomatik bir yüzey harekete geçme platformu kullanarak dört kategoride antijenin numune işlenmesi ve saptanması için EWOD tabanlı protokol gösteriyoruz. ELISA belirli bir antijenhedef seçilebilir immobilize primer antikorlar ile manyetik boncuklar üzerinde yapılır. HRP’ye konjuge bir antikor antijene bağlanır ve yakalanan patojenlerin sayısallaştırılması için H2O2/Luminol ile karıştırılır. 6 ile 10 dk arasında bir araştırma tamamlanma süreleri elde edilirken, küçük hacimlerde reaktif kullanıldı.
Önerilen yöntem, dijital mikroakışkanlar (DMF) ve manyetoforetik ayırma ile EWOD tabanlı yaklaşım kullanarak antijenlerin kantitatif tespiti ile ELISA için otomatik numune hazırlamayı kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu manyetoforez ile birlikte DMF sıvı işleme uygulamaları1ilginç bir alternatif olduğunu birden fazla biyolojik uygulamalar için gösterilmiştir. Daha spesifik olarak, patojenlerin tespiti sağlık2 tarım ve çevre3,4 ulusal güvenlik5arasında değişen birçok sektörde örtük bir yönüdür. Patojenlerden gelen tehditleri ele alabilen bir algılama teknolojisi,fonksiyonelolması için yüksek verim (örn. kısa çalışma süresi), verimlilik (düşük Algılama Limiti – LoD – ve yüksek hassasiyet) ve özgüllük (hedef patojen tipine) içermelidir 6 .
Daha önce, EWOD tabanlı DMF, ters transkripsiyon polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR), antibiyotiğe dirençli patojen (Metisiline dirençli Staphylococcus aureaus veya MRSA), M.pneumonia ve C.albicans düşük bütçeli, baskılı devre-kart çipi ve manyetophorez 7 kullanılarak başarıyla uygulanmıştır. Bu teknik aynı zamanda piroksatik ve kemilüminesans tespiti ile deoksiribonükleik asit (DNA) mutasyonlarının saptanması için de uygulanmıştır8. EWOD tabanlı platformlar aynı zamanda immunoassay uygulamalarına yönelik işlevselliklerini genişleterek, tek bir entegre platformda eşzamanlı numune geri kazanımı ve tespitine olanak sağlar. Örneğin, tek bir EWOD-chip tasarım başarıyla bir tam kan örneği kardiyak troponin I boncuk tabanlı immünoassays için bakım noktası testi için bir DMF platformu ile gösterilmiştir ve MRSA algılama için ayrı bir deney RT-PCRolarak 2. Bu çip, damlacıkların buharlaşmasını önleyen ve nanolitre hacimlerinin güvenilir otomatik manipülasyonuna olanak sağlayan yağ dolgusu kullanır. Çok yönlü biyouygulamalar, kantitatif homojen ve heterojen immünoassays 9 kapsayan benzer DMF yaklaşımlarının uygulanması ile araştırıldı9,10 tahlil parametre optimizasyonu için deneylerin tasarımı da dahil olmak üzere (DoE) çalışmalar11.
Küçük çalışma hacimleri nedeniyle yoğunlaşmayı işlemek için bariz yararları rağmen, bir yağ dolu DMF platformu zor olabilir ve çalışması için uzmanlık belirli bir düzeyde gerektirir. Yağ dolu sistemler, kapalı bileşen gerektirdiğinden, sistem taşınabilirliğinin önemli olduğu belirli saha içi uygulamalar için ideal değildir. Buna ek olarak, bir yağ tabanlı sistem zhao ve Cho12, Jönsson-Niedziółka ve ark.13tarafından önerilen bir yüzeyüzerinde kuru malzeme toplama yararlanarak bazı özel uygulamalar için kullanmak imkansız değilse çok zor olurdu , ve Foat et al.14. Buna karşılık, yağsız sistemlerin entegre sayılması kolaydır ve kolay yongadan çipe numune çevirisi sağlama avantajına sahiptir. Bu nedenlerden dolayı, önerilen yöntem, dmf üzerinde yağ gerektirmeyen ewod tabanlı bir immünoassay sağlamak ve cihazın çalışmasını etkili bir şekilde basitleştirmek için geliştirilmiştir.
Bu katkıda, immünoasiler için ısmarlama, serbest duran, tam otomatik bir DMF platformu kullanarak rapor ve biyomoleküllerin hızlı tespiti için protokol üzerinde ayrıntılı, yani: proteinler, bitkisel bakteriler, bakteriyel sporlar ve virüsler. Otomatik numune hazırlama ve immünoprepitasyon için manyetik parçacıklar ile EWOD-çip kombinasyonu ek bir off-line MS ölçümü ile zaten gösterilmiştir15. Son zamanlarda, kızamık ve kızamıkçık IgG karşı alan tanı Wheeler grup16tarafından uzak Northwestern Kenya nüfusunda gösterilmiştir . Hem Wheeler’s ve sistemimiz, taşınabilir olmak, kendi kendine yeten, tam otomatik çip dahil, gerçek zamanlı kemilüminesan ölçümler ilerlemiş en gelişmiş DMF biyoalgılama sistemleri arasında tartışmasız.
Bu iki sistem çok farklı uygulamalar düşünülarak tasarlanmıştır. Wheeler’ın sistemi, hastalar üzerinde biyomedikal tanıya izin vermek için biyobelirteci hedeflerken, biyoalgılama sistemimiz daha önce havadan örneklenmiş patojenin doğrudan tespiti için savunma gereksinimi etrafında inşa edilmiştir. İkisi arasındaki benzerlik, EWOD tabanlı teknolojinin etkileyebileceği çok çeşitli yaşamı etkileyen sektörleri gösteren damlacık harekete geçmenin temel prensibidir. Yani, DMF tabanlı algılama platformu ve ilgili EWOD sistemi sağlık (biyomedikal tanı) önemli ima bulabilir; askeri ve sivil koruma (tehdit tespiti); Tarım teknolojisi (mahsul izleme) ve iş güvenliği (kontrollü çevre izleme)
Bizim DMF platformunun performansı insan serum albumin (HSA, bir küresel protein), Escherichia coli (E. coli, bir vegetatif bakteri), Bacillus atrophaeus (BG, bir bakterispor) ve MS2 (bir bakteriyofaj virüsü) tam otomatik tespitine karşı değerlendirilir. Daha da önemlisi, önerilen DMF-yöntemi yakalama antikorları bu makalede kabul edilen dört farklı diğer antijenlerin tespitini hedef olarak değiştirilebilir anlamında son derece çok yönlüdür. Antikor bazlı algılamayı tamamen kenara atan DMF platformu, manyetik boncukların nükleotitlerin yakalanması ve/veya tespiti için spesifik aptamerler taşıdığı aptamer biosensing’e dayalı potansiyel bir uygulamaya neden olabilir. Yüksek gerilim dalga formu jeneratörü ve sürücü elektroniği de dahil olmak üzere entegre, tamamen bağımsız DMF platformu oluşturan farklı bileşenlerin tasarımı ve gerçekleştirilmesibaşkabir yerde 6 açıklanmıştır.
EWOD immünoassay protokolü esnektir ve test protokolü tarafından tanımlanan reaktif tipine, stabilitesine ve kullanım gereksinimlerine bağlı olarak çeşitli laboratuvar birimi operasyonlarını (örn. antijen yakalama, karıştırma, kuluçka, boncuk çıkarma, yıkama) içerebilir. Prensip kanıtı olarak, mevcut makalede, iki immünoassay protokolleri açıklanan EWOD çip ile sekiz veya on LUOs(Şekil 4)uygulanmasını gösteren kabul edilir. Bu tür minyatürleştirme, elisa’nın etkinliğini azaltarak reaktiflerin tüketimini, operasyon başına gereken süreyi, aslında toplam deneysel süreyi (6 ila 10 dk) azaltarak artıran mikrolitre, ayrık hacimli reaktif/analyte’den elde edilir. Ayrıca, titreç varyasyonları azaltır ve immünoassay17hassasiyetini artırır damlacıkların zamanlanmış manipülasyon ile otomatiktir. Mevcut biçiminde, deneme, bir sonraki bölümde daha fazla tartışma noktası olan her bir tdenemenin başında damlacıkların manuel olarak işlenmesini içerir.
Mevcut DMF yönteminin kritik adımlarından biri damlacıkları EWOD çipinin yüzeyine dağıtmaktır. Tipik olarak, tek kullanımlık uçlu bir mikropipet tam hacmi ölçmek ve yüklemek için kullanılır. Ancak, damlacık ve tek kullanımlık ucu şarj yüzeyi arasındaki etkileşimler nedeniyle aktüasyon plakasının hidrofobik yüzeyinde damlacık immobilize etmek zor olabilir. Sonuç olarak, damlacık plaka üzerine kalmak yerine ucun dış yüzeyini takip ateş edebilirsiniz. Bunu önlemek için, mikropipet yonga yüzeyine dik bir konumda, dokunmadan tutulmalıdır, daha sonra damlacık yüzeyle temas ederek yükleme yastığı üzerine dağıtılabilir. Damlacık pipet ucuna yapışırsa, onu hisse senedi çözümüne geri verin, ucu değiştirin ve yeni bir damlacık yeniden yatırın. Mevcut kavram kanıtı sisteminin daha da geliştirilmesinde, damlacık otomatik teslimat öngörülebilir.
Bir diğer kritik adım, tsedayı çalıştırmadan önce paralel plaka tertibatının kapağını kapatmaktır. Protokolde daha önce belirtildiği gibi, kapak aktüasyon plakasının üzerine kaydırılmalıdır. Kapağın hidrofobik yüzeyi, aktüasyon plakası üzerinde oturan damlacıkların bozulmasını ve yer değiştirmesini önler. Damlacık pürüzsüz hareketini garanti etmek için, son derece bozulmamış aktüasyon plakası kullanılması tavsiye edilir, damlacıkları ve yonga montaj doğru yükleme. Aktüasyon plakalarının yeniden kullanılabilirliği mümkündür; ancak, çevrim sayısı aktüasyon gerilimlerine(Şekil 3)ve yüzeye analit/reaktif birikimine, diğer adıyla biofouling’e bağlıdır. Sunulan platform, her deneyden sonra 120 V çalışma geriliminde dört kata kadar art arda ölçümler ve ara plaka temizliği için güvenilir bir şekilde yeniden kullanılabilen krom baskılı EWOD yongasını kullanmaktadır. Plakalar, deney başına maliyetini azaltmak için, biofouled amorf floropolimerler(Malzeme Tablosu)kaplama ve plaka üstüne taze bir spin kaplama (iyice durulama önce seyreltilmemiş temizlik maddesi ile yüzey fırçalama) tarafından geri dönüştürüldü. Ancak, aktüasyon plakageri dönüşüm manuel kullanım gerektirir, pahalı reaktifler (amorf floropolimerler(Malzeme Tablosu)) ve özel ekipman (spin-coater). Alternatif EWOD yongaları kağıt19,asetat filmleri veya baskılı devre kartları (PCBs)20,21gibi maliyet-etkin yüzeyler ile başarıyla araştırılır. Bu tür tek kullanımlık sarf malzemeleri, DMF platformunun güvenilir ve uygun fiyatlı kullanımını kolaylaştırabilir ve biyofaulleme sorununu ortadan katmak için araçlar sağlayabilir.
Biofouling biyolojik uygulamalar için EWOD ana sınırlama22,23. DMF üzerinde daha önceki çalışmalarda biyofouling katkıda iki mekanizma tespit ettik, yani, hidrofobik etkileşimleri nedeniyle pasif adsorpsiyon, ve bir elektrik alanı uygulandığında tezahür elektrostatik tahrikli adsorpsiyon24. Mevcut makalede elde edilen bulgular, yüksek aktüasyon gerilimlerinde aktüasyon plakasının yeniden kullanılabilirliğinin azaldığı belgelenmiştir. Bir olası açıklama proteinler fluoropolimer kaplı (Teflon gibi) yüzeylerde kolayca adsorb ve bozulmamış yüzeylere göre kirlenmiş daha hızlı agrega24. Sonuç olarak, DMF üzerinde protein ile ilgili tahliller ölçmek zordur ve analit kaybı yaşayabilir, çapraz kontaminasyon ve azalmış hassasiyet17. En kötü durum senaryosu, kritik miktarda protein adsorblarının böylece cihazı işe yaramaz hale getirmeleridir. Biyofouling en aza indirmek için, çeşitli yaklaşımlar çip üzerinde damlacık ikamet süresini en aza indirmek, kaplamalar aracılığıyla23, katkı maddeleri (yani, yüzey aktif maddeler veya pluronik asit) içine biyomalzeme yüklü damlacıklar6,22. Bu nedenle EWOD üzerinde immünoassay test önemli bir yönü eldeki özel protokol ile uyumlu anti-biofouling stratejileri seçmektir.
Otomatik DMF platformu, hem reaktifler hem de analit için mikrolitre hacimleri kullanırken her çalışma başına tek bir sandviç ELISA testi gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır. Gerektiğinde, konvansiyonel sandviç ELISA kitleri, yardımcı laboratuvar ekipmanları ile birlikte çalışan başına daha yüksek iş artışı sağlayan önceden kaplanmış 96-iyi veya 384-kuyu plakalar dayalı mevcuttur; sadece reaktif fiyatına göre, test/kuyu başına yaklaşık maliyet sırasıyla 6,04 USD (580 USD/96) ve 0,33 USD (2×580 USD/384) olup. Bu, merkezi laboratuvar tesislerinde eğitimli teknik personel tarafından tipik olarak işlenen çok sayıda numune için geleneksel ELISA yöntemlerini ideal hale getirir. Ancak, uzak yerlerde, çevresel izleme için ELISA ayrıntılı maliyet analizi sermaye maliyetleri (yani, laboratuvar işletme maliyetleri, tekrarlayan maliyetler, numune taşıma, malzeme ve personel) dahil edildiğinde ELISA başına gerçek fiyat 60 USD olan 34 USD örnek25başına tedarik için olduğunu gösterdi . Buna karşılık, önerilen DMF platformu taşınabilir, çalışması için minimum eğitim gerektirir ve önceden kaplanmış boncuklar ile dakika içinde örnek-to-cevap analizi sağlayabilir. Bu nedenle, sunulan teknoloji ihtiyaç noktalarına dağıtılabilir ve merkezi laboratuvarlarda kullanılabilir tamamlayıcı analizler.
Temsili sonuçlar bölümünde, savunma uygulaması için patojenlerin doğrudan tespiti için otomatik DMF immünoassay platformu kullanılmıştır. DMF platformu için diğer olası uygulamalar biyodiagnostik, sürekli izleme ve otomatik örneklemeyi kapsar ancak bunlarla sınırlı değildir. Potansiyel olarak DMF, kişiselleştirilmiş sağlık hizmetleri için bakım noktasından, hastaların havadaki Hastane Edinilmiş Enfeksiyondan korunması için kontrollü çevre izlemeden tarım ve tarım için mahsul izleme sistemine kadar çeşitli sektörleri etkileyebilir. gıda üretimi.
The authors have nothing to disclose.
Mikroakışkan ve Mikromühendislik Araştırma Grubu’ndaki meslektaşlarımızın mekanik tasarım ve sistem entegrasyonu konusundaki çalışmalarına olan katkılarını kabul etmek isteriz. Yazarlar, DMF teknolojisini ve uygulamalarını daha da geliştiren geçmiş ve devam eden projelere paha biçilmez destekleri ve finansal katkıları için Dstl Porton Down’a teşekkür etmek isterler.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |