Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.
Elektronatting is het effect waarmee de contacthoek van een druppel die aan een oppervlaktelading wordt blootgesteld, wordt gewijzigd. Elektrowetting-on-diëletrische (EWOD) maakt gebruik van de diëlektrische eigenschappen van dunne isolatorfilms om de ladingsdichtheid te verbeteren en zo het elektrowetting-effect te stimuleren. De aanwezigheid van lasten resulteert in een elektrisch geïnduceerde verspreiding van de druppel die doelbewuste manipulatie over een hydrofoob oppervlak mogelijk maakt. Hier demonstreren we ewod-gebaseerd protocol voor monsterverwerking en detectie van vier categorieën antigenen, met behulp van een geautomatiseerd platform voor oppervlaktebediening, via twee varianten van een Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methoden. De ELISA wordt uitgevoerd op magnetische kralen met geïmmobiliseerde primaire antilichamen die kunnen worden geselecteerd om een specifiek antigeen te richten. Een antilichaam dat aan HRP wordt geconjugeerd bindt aan het antigeen en wordt gemengd met H2O2/Luminol voor kwantificering van de gevangen ziekteverwekkers. Testvoltooiingstijden van tussen 6 en 10 min werden bereikt, terwijl minuscule volumes reagentia werden gebruikt.
De voorgestelde methode heeft tot doel de geautomatiseerde monstervoorbereiding voor ELISA te vergemakkelijken met kwantitatieve detectie van antigenen met behulp van ewod-gebaseerde benadering met digitale microfluidica (DMF) en magnetophoretische scheiding. Voor meerdere biologische toepassingen is aangetoond dat DMF in combinatie met magnetophorese een interessant alternatief is voor vloeistofbehandelingstoepassingen1. Meer in het bijzonder is de opsporing van ziekteverwekkers een impliciet aspect in veel sectoren, variërend van gezondheidszorg2 tot landbouw en milieu3,4 tot nationale veiligheid5. Een detectietechnologie die in staat is de bedreigingen van ziekteverwekkers aan te pakken, moet beschikken over een hoge doorvoer (bijvoorbeeld korte testtijd), efficiëntie (lage detectielimiet – LoD – en hoge gevoeligheid) en specificiteit (voor het type doelpathogene ziekteverwekker) om functioneel te zijn6.
Voorheen is EWOD-gebaseerde DMF met succes geïmplementeerd voor Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), detectie van een antibioticaresistente ziekteverwekker (Methicilline-resistente Staphylococcus aureaus of MRSA), M.pneumonia en C.albicans met behulp van een low-budget, print-circuit-board chip en magnetophorese7. De techniek werd ook toegepast voor de detectie van deoxyribonucleic zuur (DNA) mutaties door middel van pyrosequencing en chemiluminescente detectie8. EWOD-gebaseerde platforms breiden hun functionaliteit ook uit naar immunoassay-toepassingen, waardoor gelijktijdig monsterherstel en -detectie mogelijk zijn, allemaal binnen één geïntegreerd platform. Zo werd een enkel EWOD-chipontwerp met succes gedemonstreerd met een DMF-platform voor point-of-care-testen voor beide op kraalgebaseerde immunoassays van cardiale troponine I uit een bloedmonster en als apart experiment RT-PCR voor MRSA-detectie2. Die chip maakt gebruik van olie-vuller, die verdamping van de druppels voorkomt en vergemakkelijkt de betrouwbare geautomatiseerde manipulatie van nanoliter volumes. Veelzijdige biotoepassingen werden onderzocht met de implementatie van soortgelijke DMF-benaderingen voor kwantitatieve homogene en heterogene immunoassays9,10 inclusief het ontwerp van experimenten (DoE) studies voor testparameteroptimalisatie11.
Ondanks de duidelijke verdiensten voor het verwerken van intensivering als gevolg van minuscule werkvolumes, kan een met olie gevulde DMF-platform een uitdaging zijn en vereist een zekere mate van expertise om te werken. Oliegevulde systemen, omdat ze een gesloten onderdeel nodig hebben, zijn niet ideaal voor bepaalde toepassing in het veld waar systeemtransportbaarheid belangrijk is. Bovendien zou een op olie gebaseerd systeem zeer moeilijk, zo niet onmogelijk te gebruiken zijn voor sommige specifieke toepassingen die gebruik maken van de verzameling van droog materiaal op een oppervlak zoals voorgesteld door Zhao en Cho12, Jönsson-Niedziółka et al.13, en Foat et al.14. Olievrije systemen zijn daarentegen eenvoudig te integreren en hebben het voordeel dat ze een eenvoudige chip-to-chip monstervertaling bieden. Om deze redenen werd de voorgestelde methode ontwikkeld om een immunoassay op basis van EWOD op DMF te verstrekken die geen olie nodig zou hebben, waardoor de werking van het apparaat effectief werd vereenvoudigd.
In deze bijdrage rapporteren we over het gebruik van een op maat gemaakt, vrijstaand, volledig geautomatiseerd DMF-platform voor immunoassays, en werken we het protocol voor de snelle detectie van biomoleculen uit, namelijk: eiwitten, vegetatieve bacteriën, bacteriële sporen en virussen. Combinatie van EWOD-chip met magnetische deeltjes voor geautomatiseerde monstervoorbereiding en immunoneerslag is al aangetoond met een extra off-line MS-meting15. Onlangs, in-field diagnostische tegen mazelen en rodehond IgG is aangetoond in afgelegen Noordwesten Kenia’s bevolking door de Wheeler groep16. Zowel Wheeler’s als ons systeem, die transporteerbaar, op zichzelf staand, volledig geautomatiseerd met meegeleverde on-chip, real-time chemiluminescentmetingen behoren misschien wel tot de meest geavanceerde DMF biodetectiesystemen die beschikbaar zijn.
De twee systemen zijn ontworpen met zeer verschillende toepassingen in het achterhoofd. Wheeler’s systeem richt zich op biomarker om biomedische diagnostiek bij patiënten mogelijk te maken, terwijl ons biodetectiesysteem is gebouwd rond de defensie-eis voor directe detectie van ziekteverwekkers die eerder uit de lucht werden bemonsterd. De overeenkomst tussen de twee is het onderliggende principe van druppelactuatie, dat het brede scala van levensbeïnvloedende sectoren aantoont die de op ewod-gebaseerde technologie kan beïnvloeden. Namelijk, de DMF-gebaseerde detectie platform en bijbehorende EWOD systeem zou kunnen vinden belangrijke implicatie in de gezondheid (biomedische diagnostiek); militaire en civiele bescherming (dreigingsdetectie); Agri-tech (gewasmonitoring) en arbeidsveiligheid (gecontroleerde milieubewaking)
De prestaties van ons DMF-platform worden beoordeeld aan de hand van volledig geautomatiseerde detectie van menselijke serumalbumine (HSA, een bolvormig eiwit), Escherichia coli (E. coli, een vegetatieve bacterie), Bacillus atrophaeus (BG, een bacteriële spore) en MS2 (een bacteriofaagvirus). Wat nog belangrijker is, is de voorgestelde Methode DMF uiterst veelzijdig in de betekenis dat de vangstantilichamen zouden kunnen worden geruild om de opsporing van andere antigenen te richten verschillend van vier die in dit artikel worden overwogen. Afgezien van de antilichaam-gebaseerde sensing volledig, de DMF platform zou kunnen bouwen aan een potentiële toepassing op basis van aptamer biosensing, waar de magnetische kralen voeren specifieke aptamers voor het vastleggen en / of detectie van nucleotiden. Het ontwerp en de realisatie van de verschillende componenten die het geïntegreerde, volledig op zichzelf staande DMF-platform vormen, inclusief de hoogspanningsgolfgenerator en aandrijfelektronica wordt elders bekendgemaakt6.
Het EWOD immunoassay protocol is flexibel en kan een aantal laboratoriumunitoperaties omvatten (bijvoorbeeld afvangantigeen, mengen, incubatie, kraalextractie, wassen) afhankelijk van het type reagens, stabiliteits- en gebruiksvereisten gedefinieerd door het testprotocol. Als bewijs van principes worden in het huidige artikel twee immunoassayprotocollen beschouwd als het tonen van de implementatie van acht of tien LuOs (figuur 4) met de beschreven EWOD-chip. Een dergelijke miniaturisatie verdient uit de microliter, discrete volumes reagentia/analyt die de werkzaamheid van de ELISA verhogen door zowel het verbruik van reagentia te verminderen, de tijd die nodig is per operatie, in wezen de totale experimentele tijd (6 tot 10 min). Bovendien wordt de test geautomatiseerd met getimede manipulatie van de druppels die variaties vermindert en de precisie van de immunoassayverbetert 17. In het huidige formaat, het experiment omvat handmatige behandeling van druppels aan het begin van elke test, dat is een punt voor verdere discussie in de volgende sectie.
Een kritieke stap in de huidige DMF-methode is het uitdelen van de druppels op het oppervlak van de EWOD-chip. Typisch, een micropipette met een wegwerptip wordt gebruikt om het exacte volume te meten en te laden. Het kan echter een uitdaging worden om de druppel op het hydrofobe oppervlak van de actuatieplaat te immobiliseren vanwege interacties tussen de druppel en het geladen oppervlak van de wegwerppunt. Als gevolg hiervan kan de druppel omhoog schieten na het buitenoppervlak van de punt in plaats van op de plaat te blijven. Om dit te voorkomen, moet de micropipet in een rechte positie worden gehouden, loodrecht op het spaanoppervlak, zonder het aan te raken, dan kan de druppel op het laadpad worden uitgedeeld door het in contact te brengen met het oppervlak. Mocht de druppel vasthouden aan de pipet tip, terug te keren naar de voorraad oplossing, de tip te wisselen en een verse druppel te storten. Bij de verdere ontwikkeling van het huidige proof-of-concept systeem kan worden overwogen om automatisch druppelen te leveren.
Een andere kritieke stap, alvorens de test uit te voeren, is het sluiten van het deksel van de parallelle plaatassemblage. Zoals eerder in het protocol vermeld, moet het deksel bovenop de aanweidheidsplaat worden geschoven. Het hydrofobe oppervlak van het deksel voorkomt de vervorming en verplaatsing van de druppels die op de aanzetplaat zitten. Om de soepele beweging van de druppel te garanderen, is het ten zeerste aan te raden om ongerepte actuatieplaat, correcte belasting van de druppels en spaanassemblage te gebruiken. Herbruikbaarheid van de aanzetplaten is mogelijk; het aantal cycli is echter afhankelijk van de aanloktijdsspanningen (figuur 3) en de analyte/reagent depositie op het oppervlak, ook wel biofouling. Het gepresenteerde platform maakte gebruik van chroomgeprinte EWOD-chip, die betrouwbaar kon worden hergebruikt voor opeenvolgende metingen tot vier keer bij bedrijfsspanning van 120 V en tussentijdse plaatreiniging na elk experiment. Platen werden gerecycled, om de kosten per experiment te verlagen, door het ontsmetten (borstelen van het oppervlak met onverdund reinigingsmiddel voor grondig spoelen) de biofouled amorfe fluorpolymeren(Tabel van materialen)coating en spin-coating een verse op de top van de plaat. Voor het recyclen van actuatieplaat’s is echter handmatige behandeling, kostbare reagentia (amorfe fluorpolymeren(Tabel met materialen))en gespecialiseerde apparatuur (spin-coater) vereist. Alternatieve EWOD-chips worden met succes onderzocht met kostenefficiënte substraten zoals papier19,acetaatfolies of printplaten (PCB’s)20,21. Dergelijke wegwerpverbruiksartikelen kunnen een betrouwbaar en betaalbaar gebruik van het DMF-platform vergemakkelijken en kunnen middelen bieden om het biofoulingprobleem te omzeilen.
Biofouling is de belangrijkste beperking van EWOD voor biologische toepassingen22,23. Eerdere studies over DMF hebben twee mechanismen geïdentificeerd die bijdragen aan biofouling, namelijk passieve adsorptie als gevolg van hydrofobe interacties, en een elektrostatisch gedreven adsorptie die zich manifesteert wanneer een elektrisch veld wordt toegepast24. De bevindingen in het huidige artikel komen overeen met deze theorie omdat het werd gedocumenteerd de actuatieplaatherbruikbaarheid vermindert bij hoge actuatiespanningen. Een mogelijke verklaring is dat eiwitten adsorberen gemakkelijk op fluorpolymeer-gecoate (Teflon-achtige) oppervlakken en ze aggregaat sneller op vervuild in vergelijking met ongerepte oppervlakken24. Als gevolg hiervan zijn eiwitgerelateerde tests op DMF moeilijk te kwantificeren en kunnen ze verlies van analyt, kruisbesmetting en verminderde precisieervaren 17. Het worst-case scenario is wanneer een kritische hoeveelheid eiwit adsorbs waardoor het apparaat nutteloos. Om de biofouling tot een minimum te beperken, zijn verschillende benaderingen onderzocht, van het minimaliseren van de verblijfstijd van de druppel op de chip, via coatings23, tot additieven (d.w.z. oppervlakteactieve stoffen of pluronzuur) in de met biomateriaal beladen druppels6,22. Vandaar dat een belangrijk aspect van de immunoassay-test op EWOD is om anti-biofouling strategieën te kiezen die compatibel zijn met het specifieke protocol bij de hand.
Het geautomatiseerde DMF-platform is ontworpen om een enkele sandwich ELISA-test per run uit te voeren terwijl het gebruik van microlitervolumes voor zowel reagentia als analyte. Wanneer het nodig is, conventionele sandwich ELISA kits bestaan op basis van voorgecoate 96-well of 384-well platen die in combinatie met hulplaboratoriumapparatuur resulteren in een hogere doorvoer per run; gebaseerd op reagentia prijs alleen, de geschatte kosten per assay / goed is 6,04 USD (580 USD/96) en 0,33 USD (2 × 580 USD/384) respectievelijk. Dit maakt de conventionele ELISA-methoden ideaal voor een groot aantal monsters die doorgaans worden verwerkt door opgeleid technisch personeel in gecentraliseerde laboratoriumfaciliteiten. Op afgelegen locaties bleek echter uit de gedetailleerde kostenanalyse van ELISA voor milieumonitoring dat toen de kapitaalkosten (d.w.z. de bedrijfskosten van het laboratorium, terugkerende kosten, monstervervoer, leveringen en personeel) waren opgenomen, de werkelijke prijs per ELISA 60 USD bedroeg, waarvan 34 USD voor leveringen per monster25. In tegenstelling, de voorgestelde DMF-platform is draagbaar, vereist minimale training te bedienen en met pre-coated kralen kan monster-to-answer analyse in enkele minuten. Daarom kan de gepresenteerde technologie worden ingezet op punt-van-behoefte locaties en aanvulling analyses anders beschikbaar in gecentraliseerde laboratoria.
In de sectie representatieve resultaten werd het geautomatiseerde DMF immunoassay-platform gebruikt voor directe detectie van ziekteverwekkers voor verdedigingstoepassing. Andere mogelijke toepassingen voor het DMF-platform omvatten, maar zijn niet beperkt tot biodiagnostische, continue monitoring en geautomatiseerde bemonstering. Mogelijk kan de DMF gevolgen hebben voor diverse sectoren, van point-of-care voor gepersonaliseerde gezondheidszorg, evenals gecontroleerde milieumonitoring voor de bescherming van patiënten van ziekenhuisinfectie in de lucht, tot gewasmonitoringsysteem voor landbouw en voedselproductie.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de bijdrage van onze collega’s van de Microfluidic & Microengineering Research Group erkennen voor hun werk aan het mechanische ontwerp en systeemintegratie. De auteurs willen Dstl Porton Down bedanken voor hun onschatbare steun en financiële bijdrage, aan eerdere en lopende projecten die de DMF-technologie en de toepassingen verder ontwikkelen.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |