Summary
इलेक्ट्रोवेटिंग-आधारित डिजिटल माइक्रोफ्लूइडिक एक तकनीक है जो इसके हेरफेर को सुविधाजनक बनाने के लिए माइक्रोलीटर-वॉल्यूम ड्रॉपलेट के स्पष्ट संपर्क कोण में वोल्टेज-चालित परिवर्तन का उपयोग करती है। कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों के साथ इसका संयोजन एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके रोगजनकों की नमूना तैयारी और पहचान के लिए कई प्रयोगशाला इकाई संचालन के एकीकरण को सक्षम बनाता है।
Abstract
इलेक्ट्रोवेटिंग वह प्रभाव है जिसके द्वारा सतह आवेश के संपर्क में आने वाली बूंद के संपर्क कोण को संशोधित किया जाता है। इलेक्ट्रोवेटिंग-ऑन-डाइइलेक्ट्रिक (ईडब्ल्यूओडी) चार्ज घनत्व को बढ़ाने के लिए पतली इंसुलेटर फिल्मों के डाइइलेक्ट्रिक गुणों का शोषण करता है और इसलिए इलेक्ट्रोवेटिंग प्रभाव को बढ़ावा देता है। आरोपों की उपस्थिति के परिणामस्वरूप बूंद का विद्युत रूप से प्रेरित प्रसार होता है जो हाइड्रोफोबिक सतह पर उद्देश्यपूर्ण हेरफेर की अनुमति देता है। यहां, हम एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) विधियों के दो रूपों के माध्यम से, एक स्वचालित सतह एक्टयूशन प्लेटफॉर्म का उपयोग करके, एंटीजन की चार श्रेणियों के नमूना प्रसंस्करण और पता लगाने के लिए EWOD-आधारित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। एलिसा स्थिर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय मोतियों पर किया जाता है जिसे एक विशिष्ट एंटीजन को लक्षित करने के लिए चुना जा सकता है। एचआरपी के लिए एक एंटीबॉडी एंटीजन को बांधता है और कब्जा किए गए रोगजनकों की मात्रा के लिए एच2ओ 2/लुमिनोल के साथ मिलाया जाता है । 6 और 10 मिन के बीच की परख पूरा होने के समय को प्राप्त किया गया था, जबकि अभिकर्मकों की मामूली मात्रा का उपयोग किया गया था।
Introduction
प्रस्तावित विधि का उद्देश्य डिजिटल माइक्रोफ्लूइडिक्स (डीएमएफ) और मैग्नेटोफोरेटिक पृथक्करण के साथ ईडब्ल्यूओडी-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके एंटीजन का मात्रात्मक पता लगाने के साथ एलिसा के लिए स्वचालित नमूना तैयारी की सुविधा प्रदान करना है। कई जैविक अनुप्रयोगों के लिए यह प्रदर्शित किया गया है कि मैग्नेटोफोरेसिस के संयोजन में डीएमएफ तरल हैंडलिंग अनुप्रयोगों के लिए एक दिलचस्प विकल्प है1। विशेष रूप से, रोगजनकों का पता लगाना कई क्षेत्रों में एक अंतर्निहित पहलू है, जिसमें हेल्थकेयर2 से लेकर कृषि और पर्यावरण3,4 से लेकर राष्ट्रीय सुरक्षा5तक शामिल हैं । रोगजनकों से खतरों को संबोधित करने में सक्षम एक डिटेक्शन तकनीक में उच्च-थ्रूपुट (जैसे कम परख का समय), दक्षता (डिटेक्शन की कम सीमा- LoD - और उच्च संवेदनशीलता) और विशिष्टता (लक्ष्य रोगजनक प्रकार तक) की सुविधा होनी चाहिए ताकि यह कार्यात्मक6हो।
इससे पहले, EWOD आधारित DMF को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जो एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगजनक (Methicillin प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस या MRSA), एम निमोनिया और सी एल्बिकैन का कम बजट, मुद्रित-सर्किट-बोर्ड चिप और मैग्नेटोफोरसिस7का उपयोग करके पता लगाया गया है । इस तकनीक को पाइरोसेक्नेसिंग और केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन8के माध्यम से डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) म्यूटेशन का पता लगाने के लिए भी लागू किया गया था । ईडब्ल्यूओडी-आधारित प्लेटफ़ॉर्म इम्यूनोसे अनुप्रयोगों की दिशा में अपनी कार्यक्षमता का विस्तार करते हैं, जिससे एक साथ नमूना वसूली और एक एकल, एकीकृत मंच के भीतर सभी का पता लगाने में सक्षम होता है। उदाहरण के लिए, एक पूरे रक्त नमूने से हृदय ट्रोपोनिन I के मनका आधारित इम्यूनोअस के लिए पॉइंट-ऑफ-केयर परीक्षण के लिए एक डीएमएफ प्लेटफॉर्म के साथ एक डीईडब्ल्यूओडी-चिप डिजाइन का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था और एमआरएसए डिटेक्शन2के लिए एक अलग प्रयोग आरटी-पीसीआर के रूप में। यह चिप तेल भराव का उपयोग करती है, जो बूंदों के वाष्पीकरण को रोकती है और नैनोलीटर वॉल्यूम के विश्वसनीय स्वचालित हेरफेर की सुविधा प्रदान करती है । बहुमुखी जैव अनुप्रयोगों की जांच इसी तरह के डीएमएफ दृष्टिकोणों के कार्यान्वयन के साथ की गई थी जिसमें मात्रात्मक सजातीय और विषम इम्यूनोअस कहते हैं9,10 परख पैरामीटर अनुकूलन11के लिए प्रयोगों (डीओई) अध्ययनों के डिजाइन सहित शामिल हैं।
काम करने की मात्रा को कम करने के कारण गहनता को संसाधित करने के लिए इसके स्पष्ट गुणों के बावजूद, तेल से भरा डीएमएफ मंच चुनौतीपूर्ण हो सकता है और इसे संचालित करने के लिए विशेषज्ञता के एक निश्चित स्तर की आवश्यकता होती है। तेल से भरे सिस्टम, क्योंकि उन्हें सीलबंद घटक की आवश्यकता होती है, कुछ इन-फील्ड एप्लिकेशन के लिए आदर्श नहीं हैं जहां सिस्टम परिवहनता महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक तेल आधारित प्रणाली बहुत मुश्किल होगा अगर कुछ विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए असंभव नहीं है जैसे झाओ और चो12,Jönsson-Niedziółka एट अल द्वारा प्रस्तावित के रूप में एक सतह पर शुष्क सामग्री संग्रह का लाभ लेने के लिए13,और Foat एट अल14। इसके विपरीत, तेल मुक्त सिस्टम को एकीकृत करने के लिए सरल कर रहे है और आसान चिप से चिप नमूना अनुवाद प्रदान करने का लाभ है । इन कारणों से, प्रस्तावित विधि को DMF पर ईडब्ल्यूओडी आधारित इम्यूनोसे प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था जिसमें तेल की आवश्यकता नहीं होगी, प्रभावी रूप से डिवाइस ऑपरेशन को सरल बनाया जा सकेगा।
इस योगदान में, हम इम्यूनोअकहके लिए एक बेस्पोक, फ्री-स्टैंडिंग, पूरी तरह से स्वचालित डीएमएफ प्लेटफॉर्म का उपयोग करने पर रिपोर्ट करते हैं, और हम जैव अणुओं का तेजी से पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के बारे में विस्तार से बताते हैं, अर्थात्: प्रोटीन, वनस्पति बैक्टीरिया, जीवाणु बीजाणु और वायरस। स्वचालित नमूना तैयारकरने और इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए चुंबकीय कणों के साथ ईडब्ल्यूओडी-चिप का संयोजन पहले से ही अतिरिक्त ऑफ-लाइन एमएसमापन 15के साथ प्रदर्शित किया गया है। हाल ही में, खसरा और रूबेला IgG के खिलाफ क्षेत्र में नैदानिक व्हीलर समूह16द्वारा दूरदराज के पश्चिमोत्तर केंया की आबादी में प्रदर्शन किया गया है । व्हीलर और हमारी प्रणाली दोनों, परिवहनीय, आत्म-निहित, पूरी तरह से स्वचालित होने के साथ शामिल ऑन-चिप, वास्तविक समय केमिल्यूमिनेसेंट माप यकीनन उपलब्ध सबसे उन्नत डीएमएफ बायोडिटेक्शन सिस्टम में से हैं।
दोनों सिस्टम को ध्यान में रखकर बहुत अलग अनुप्रयोगों के साथ डिजाइन किया गया है । व्हीलर की प्रणाली रोगियों पर बायोमेडिकल डायग्नोस्टिक्स की अनुमति देने के लिए बायोमार्कर को लक्षित करती है जबकि हमारी बायोडिटेक्शन प्रणाली पहले हवा से नमूना रोगजनक का प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए रक्षा आवश्यकता के आसपास बनाई गई है। दोनों के बीच समानता बूंद एक्टयूशन का अंतर्निहित सिद्धांत है, जो जीवन को प्रभावित करने वाले क्षेत्रों की व्यापक श्रृंखला को दर्शाता है जिसे ईडब्ल्यूओडी आधारित प्रौद्योगिकी प्रभावित कर सकती है । अर्थात्, डीएमएफ आधारित डिटेक्शन प्लेटफॉर्म और संबद्ध ईडब्ल्यूओडी प्रणाली स्वास्थ्य (बायोमेडिकल डायग्नोस्टिक) में महत्वपूर्ण निहितार्थ पा सकती है; सैन्य और नागरिक सुरक्षा (खतरे का पता लगाना); कृषि तकनीक (फसल निगरानी) और कार्य सुरक्षा (नियंत्रित पर्यावरण निगरानी)
हमारे डीएमएफ प्लेटफॉर्म के प्रदर्शन का मूल्यांकन मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए, एक गोलाकार प्रोटीन), एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई,एक वनस्पति बैक्टीरिया), बैसिलस एट्रोफेयस (बीजी,एक जीवाणु बीजाणु) और एमएस 2 (एक बैक्टीरियोफेज वायरस) का पूरी तरह से स्वचालित पता लगाने के खिलाफ किया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रस्तावित DMF-विधि इस अर्थ में बेहद बहुमुखी है कि कैप्चर एंटीबॉडी का आदान-प्रदान इस लेख में माने जाने वाले चार से अलग अन्य एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। एंटीबॉडी आधारित संवेदन को पूरी तरह से साइडस्टेप करना, डीएमएफ प्लेटफॉर्म इप्टामर बायोसेंसिंग के आधार पर एक संभावित आवेदन का निर्माण कर सकता है, जहां चुंबकीय मोती न्यूक्लियोटाइड्स को पकड़ने और/या पता लगाने के लिए विशिष्ट आप्टामर्स ले जाते हैं । उच्च वोल्टेज तरंग जनरेटर और ड्राइव इलेक्ट्रॉनिक्स सहित एकीकृत, पूरी तरह से आत्म निहित DMF मंच का गठन विभिन्न घटकों के डिजाइन और प्राप्तिकहींऔर 6 का खुलासा किया है ।
Protocol
1. परख के लिए आवश्यक प्रारंभिक कदम
नोट (महत्वपूर्ण): संदूषण से बचने के लिए बाँझ वातावरण में सभी प्रारंभिक कदम उठाए जाने चाहिए। सोडियम एजाइड का उपयोग भंडारण के लिए नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह सहिजन पेरोक्सिड (एचआरपी) एंजाइम की गतिविधि को रोकदेगा।
- रनिंग बफर (100 mM HEPES, पीएच 7.5), (4-(2-हाइड्रोक्सेटिट्हाइल) पिट्राज़िन-1-एथेनेसल्फोनिक एसिड का उपयोग करके, और ट्वीन 80 को 0.01% (v/v) की एकाग्रता में जोड़ें।
- आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करके एनएचएस-सक्रिय चुंबकीय माइक्रोमोतियों की सतह पर प्राथमिक एंटीबॉडी (कैप्चर एंटीबॉडी) को स्थिर करें। संक्षेप में, चुंबकीय आईपी/सह-आईपी किट(सामग्री की तालिका)प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण शामिल हैं ।
- अलीकोट 0.2 मिलीग्राम मोतियों (2 मिलीग्राम) को प्लास्टिक ट्यूब में और सुपरनेट ेंट को हटा दें।
- बर्फ-ठंड 1 एमएम एचसीएल के 1 मिलील डालकर मोतियों को धोएं।
- चयनित एंटीबॉडी (एंटी-ह्यूमन सीरम एल्बुमिन [15C7], आरबी एंटी-बीजी पॉलीक्लोनल, आरबीएंटी-ई-कोलाई एमआरई 162 पॉलीक्लोनल या बकरी एंटी-एमएस2 पॉलीक्लोनल), 67 एमएम बोरेट बफर में 40 μg/mL, 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए 1 एच के लिए मोतियों को सहसंयोजकीय करें। तालिका 1 में वर्तमान प्रोटोकॉल और एंटीजन रोगजनक6के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी एंटीबॉडी की सूची शामिल है।
- एल्यूटियन बफर के 0.8 mL के साथ दो बार अनबाउंड एंटीबॉडी धोएं।
- 1 घंटे के लिए शमन बफर के 1 mL के साथ प्रतिक्रिया बुझाें ।
- मोतियों को एक बार संशोधित बोरेट बफर के साथ और एक बार आईपी लिसिस/वॉश बफर के साथ धोएं ।
- आईपी Lysis/वॉश बफर के ०.५ mL में मोतियों को फिर से निलंबित करें और उपयोग के लिए आवश्यक होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, माइक्रोमोतियों का एक ताजा बैच ईडब्ल्यूओडी-अलगाव और एलिसा ऑन-चिप से एक दिन पहले एंटीबॉडी के साथ युग्मित होता है। हालांकि, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मिलकर माइक्रोमोतियों को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। समूह होना चाहिए, वर्षा को तोड़ने के लिए शीशी पर टैप करें और समाधान में मोतियों को फिर से निलंबित करें। - माइक्रोमोतियों के साथ माइक्रोमोतियों को रातोंरात ब्लॉक करें, माइक्रोमोतियों के लिए अंतिम एकाग्रता 4 मिलीग्राम/mL का उपयोग करके, 100 मीटर फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) में ब्लॉकर कैसिन (1% डब्ल्यू/वी) में।
नोट: अवरुद्ध कदम हमेशा बायोडिटेक्शन परख चलाने से पहले दिन आयोजित किया जाता है । - चुंबक का उपयोग करके ब्लॉकर कैसिन से मोतियों को अलग करें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
- रनिंग बफर के 1 mL में फिर से सस्पेंड करें और 1 मिन के लिए मिक्स करें।
- चुंबक का उपयोग कर मोतियों को अलग करें और अधिनेत को हटा दें।
- उपरोक्त धोने के चरण (1.2.10 और 1.2.11) को दो बार दोहराएं।
नोट: सतह पर मोतियों के आसंजन को कम करने और बूंद की मुक्त आवाजाही को सुविधाजनक बनाने के लिए तीन वाशिंग स्टेप पर्याप्त हैं। - 2.5 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पर चल रहे बफर में मोतियों को फिर से निलंबित करें। माइक्रोमोतियों का यह समाधान ईडब्ल्यूओडी चिप के साथ उपयोग करने के लिए तैयार है।
- न्यूट्राविडिन कंजुगरींशी पेरोक्सिड (एचआरपी) और सेकेंडरी बायोटिनेटेड एंटीबॉडी का समाधान तैयार करें, जो रनिंग बफर (बीजी डिटेक्शन6के लिए इस्तेमाल किया जाता है) में 1 μg/mL में से प्रत्येक के लिए अंतिम एकाग्रता के लिए ।
नोट: एंटीजन(टेबल 1)को लक्षित करने के लिए माध्यमिक बायोटिनेटेड एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता, ०.५ से ४.० μg/mL तक सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया । - परख चलाने से ठीक पहले हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ ल्यूमिनॉल की बराबर मात्रा मिलाएं
नोट: लुमिनोल का उपयोग एचआरपी एंजाइम के आधार पर बाध्यकारी घटनाओं की संख्या को निर्धारित करने के लिए किया जाता है जो माध्यमिक एंटीबॉडी से सहसंयोजकीय रूप से बाध्य होता है जो एंटीजन (उदाहरण के लिए, रोगजनक) को लक्षित करता है। हालांकि, विभिन्न रिपोर्टिंग अणु और रणनीतियों का उपयोग केमिल्यूमिनेसेंस और ल्यूमिनोल के बजाय17 का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
2. ईडब्ल्यूओडी चिप घटकों का विनिर्माण और सतह उपचार
नोट: EWOD चिप में पैटर्न वाले क्रोमियम इलेक्ट्रोड के साथ एक एक्ट्युशन प्लेट होती है ताकि बूंदों की ऊंचाई को परिभाषित करने के लिए एक बूंद के स्पष्ट संपर्क कोण और एक कवर प्लेट को वैकल्पिक किया जा सके।
- मानक सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इलेक्ट्रोड और कनेक्टर के डिजाइन को 2D में ड्रा करें। इस्तेमाल सॉल्वैंट्स(चित्रा 1)को स्टोर करने के लिए 5 x 5 मिमी2 के आयामों के साथ अपशिष्ट संग्रह पैड भी शामिल करें।
नोट: बूंदों में हेरफेर करने के लिए हम 47 इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, प्रत्येक 1.7 x 1.7 मिमी2के आयामों के साथ। यह इलेक्ट्रोड आकार 1.5 माइक्रोन से 3 माइक्रोन (500 माइक्रोन गैप के लिए) तक की बूंद की मात्रा को समायोजित करता है। अनुभव से, 500 माइक्रोन गैप के साथ काम करते समय, 1.5 माइक्रोन न्यूनतम बूंद आकार है जिसे एक्टूएट किया जा सकता है। यह मोटे तौर पर ड्रॉपलेट (अनुमानित) समोच्च से मेल खाती है जो स्क्वायर पैड पर घिरा हुआ है। हालांकि, तरल पदार्थ के शरीर के प्रतिरोध (घर्षण) के कारण आकार में कोई सैद्धांतिक सीमा नहीं है। फिर भी, यह सिफारिश की जाती है कि 500 माइक्रोन गैप का उपयोग करके विश्वसनीय एक्टयूशन के लिए मात्रा 3 माइक्रोन से अधिक नहीं होती है। इलेक्ट्रोड को 48-चैनल इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा संबोधित किया जाता है।
नोट: पैड के डिजाइन आयाम और आकार अभीष्ट मात्रा और प्रयोगशाला इकाई संचालन (LUOs) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं जिसमें प्रोटोकॉल शामिल है। - एक ग्लास सब्सट्रेट पर क्रोमियम मास्क मुद्रण के लिए एक मुखौटा विनिर्माण सेवा के लिए डिजाइन ड्राइंग भेजें । क्रोमियम परत की मोटाई 100 एनएम है।
नोट: EWOD चिप के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल फोटोमास्क पर क्रोमियम परत परिभाषा, अपारदर्शी द्वारा है । हमारे प्रत्येक इलेक्ट्रोड के डिजाइन में अर्ध-पारदर्शिता सुनिश्चित करने के लिए एक ग्रिड लेआउट शामिल है। - एक सटीक सीएनसी Dicing/काटने देखा के साथ ५६ x ५६ मिमी2 के आकार के लिए थाली काट ।
- दो कोटिंग चरणों के दौरान उन्हें अलग करने के लिए बिजली के संपर्कों पर मास्किंग टेप चिपकाएं।
- प्लेट क्रोमियम-ग्लास प्लेट को इसकी सतह पर 6 माइक्रोन पैरालीन-सी जमा करके एक डाइइलेक्ट्रिक लेयर के साथ कोट करें। गोर्हम प्रक्रिया18 का उपयोग पैरालीन जमाव प्रणाली(टेबल ऑफ मैटेरियल)में 7.4 ग्राम डीपीएक्स-सी के साथ किया जाता है।
- स्पिन-कोट असंगत फ्लोरोपॉलिमर(सामग्री की तालिका)प्लेट के शीर्ष पर 30 एस के लिए 1500 आरपीएम पर स्पिन-कोटर का उपयोग करके और 30 मिन के लिए इसे 140 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
नोट: यह सतह हाइड्रोफोबिक प्रदान करता है। कोई भी इस बात को मान्य कर सकता है कि सतह पर पानी की एक बूंद रखकर कोटिंग को सफलतापूर्वक जमा किया गया है या नहीं। बूंद और थाली के बीच संपर्क कोण 110º के क्षेत्र में होना चाहिए। - बिजली के संपर्कों से मास्किंग टेप निकालें।
- स्पिन-कोट असंगत फ्लोरोपॉलिमर(सामग्री की तालिका)4-इन सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर 30 एस के लिए 1500 आरपीएम पर स्पिन-कोटर का उपयोग करके और 30 मिन के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर इसे बेक करें।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि परख के दौरान असतत बूंदों की सुचारू आवाजाही को सुगम बनाने के लिए एक्ट्युएशन और कवर प्लेट्स की दोनों सतहें हाइड्रोफोबिक हैं।
3. डीएमएफ प्लेटफॉर्म पर लोडिंग, असेंबली और ईडब्ल्यूओडी चिप का संचालन
नोट: EWOD चिप एक समानांतर प्लेट और चालू, जमीन कवर प्लेट के बीच एक ठीक परिभाषित अंतर ०.५ मिमी के साथ समानांतर प्लेट विन्यास का उपयोग कर संचालित करता है । इस सैंडविच विधानसभा वर्तमान खंड में वर्णित है।
- डीएमएफ प्लेटफॉर्म6 से ढक्कन निकालें और बेंच पर रखें।
नोट: एक अंधेरे फैराडे पिंजरे कक्ष, पता लगाने के दौरान आवारा प्रकाश और विद्युत चुंबकीय हस्तक्षेप को रोकने के लिए आवश्यक है। ढक्कन पर कोई इंटरलॉक नहीं है, इसलिए, मंच हमें बूंदों के आंदोलन का निरीक्षण करने की अनुमति देता है। - घूर्णन चरण पर एक साफ एक्ट्युएशन प्लेट रखें, क्रोमियम ऊपर की ओर सामना कर रहा है। प्लेट को अवकाश चरण के ऊपरी बाएं कोने(चित्रा 2ए)के साथ गठबंधन करने की आवश्यकता है।
- 47 संपर्क पिन के साथ पैनल का उपयोग करके शीर्ष से एक्टुएशन प्लेट को क्लैंप करें। यह प्लेट को जगह में सुरक्षित करता है और संपर्क पिन के साथ संरेखण की सुविधा प्रदान करता है।
- 0.5 मिमी शिम और 2 मिमी पॉलीमेथिलमेथक्रिलेट (पीएमएमए) विभाजक को घूर्णन चरण पर रखें, ताकि एक्पुशन और कवर प्लेटों के बीच नियंत्रित अंतर प्रदान किया जा सके।
नोट: वैकल्पिक रूप से, अगले चरण से पहले बूंदों को बहाना करने से पहले कचरे के निपटान पैड पर बाती कागज रखा जा सकता है। परख आय के रूप में, अपशिष्ट सीधे कागज है कि परख के अंत में हटाया जा सकता है में अवशोषित कर लिया है । - प्रस्तावित लोडिंग पैड(चित्रा 1)पर बूंदों लोड करें।
- Aliquot चार २.५-μL बूंदों पर चल बफर से बी-, ए-, आर-, ई-denote पैड, प्रत्येक पैड पर एक बूंद ।
- लुमिनॉल के अलीकोट 2.5 माइक्रोन: एच2ओ2 (1:1, v/v) डी-डिनोट पैड पर समाधान।
- एलिकोट 2.5 माइक्रोन न्यूट्राविडिन के एफ-डिनोट पैड पर एचआरपी (1 μg/mL) को संयुग्मित किया गया है।
- अलीकोट जी-निरूपित पैड पर बायोटिनेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी (1 μg/mL) का 2.5 माइक्रोन।
- अलीकोट 2.5 माइक्रोमोतियों के माइक्रोमोतियों के साथ संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी (2.5 मिलीग्राम/mL) आई-निरूपित पैड पर जाते हैं।
- अलीकोट सी-डिनोट पैड पर अज्ञात नमूने का 2.5 माइक्रोन।
नोट: प्रस्तावित लोडिंग पैटर्न एक प्रयोगात्मक लेआउट का केवल एक उदाहरण है, हालांकि, लोडिंग पैटर्न को उपयोगकर्ताओं की जरूरतों से मेल खाने के लिए बदला जा सकता है, जब तक कि वे परिवर्तन सॉफ्टवेयर(पूरक फ़ाइल 1)में परिभाषित अनुक्रम से मेल खाते हैं।
- कवर प्लेट को गोल अवकाश क्षेत्र के अलावा रिग की सतह पर रखें, और इसे बाद में अवकाश में और एक्ट्युशन प्लेट(चित्रा 2बी)के शीर्ष पर स्लाइड करें।
- कवर प्लेट के शीर्ष पर स्थायी चुंबक रखो और दो कुंडी फिसलने से इसे सुरक्षित(चित्रा 2सी)।
- 180 डिग्री से मंच घुमाएं और नेत्रहीन निरीक्षण करें यदि लोडेड बूंदें अभी भी जगह में हैं(चित्रा 1सी)।
नोट: पारदर्शी चरण और एक्टुशन प्लेट(चित्रा 2डी)के पीछे के माध्यम से बूंदों की स्थिति और आकार को आंखों की पुतली करने में सक्षम होना चाहिए। परख चलाने के लिए तैयार है अगर गोल बूंदों लोडिंग इलेक्ट्रोड पैड के शीर्ष पर देखा जा सकता है । मामले में, एक बूंद विस्थापित है एक चुंबक और कवर प्लेट को हटा सकते हैं, तो एक साफ पिपेट के साथ विस्थापित बूंद ठीक है और यह लोडिंग पैड पर फिर से जगह है । - जांच लें कि प्रत्येक बूंद के लिए लोडिंग की स्थिति सॉफ्टवेयर में प्रोग्राम किए गए एक्टुएशन अनुक्रम से मेल खाती है (सॉफ्टवेयर पर विवरण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
नोट: नेत्रहीन बूंदों की स्थिति की जांच करने में सक्षम होने के लिए, फोटोडिटेक्टर को उतारने की आवश्यकता है(चित्रा 2डी)। - स्थिति फोटोडिटेक्टर घूर्णन चरण के स्लॉट में "कर सकते हैं" की जांच की।
नोट: फोटोडिटेक्शन सिस्टम एक फोटोडायोड के चारों ओर धुरी है, जिसमें अतिरिक्त प्रकाशिकी के बिना प्रकाश संग्रह को अधिकतम करने के लिए एक बड़ा संग्रह क्षेत्र (10 x 10 मिमी2)है, साथ ही शोर6को कम करने के लिए एक ट्रांस-इम्पॉर्टेंट एम्पलीफायर है। हालांकि, सिस्टम बेहद संवेदनशील है और मिनट सिग्नल इकट्ठा कर सकता है। शोर के स्तर को कम करने के लिए, इलेक्ट्रॉनिक्स आधारित रणनीतियों की एक संख्या को लागू किया गया (उदाहरण के लिए, फोटोडिटेक्शन सिस्टम को फैराडे पिंजरे में डालकर संरक्षित किया गया था, एक धातु आवरण जिसे जांच "कर सकते हैं" के रूप में जाना जाता है)। - केबल को फोटोडिटेक्टर से कनेक्ट करें "कर सकते हैं"।
नोट: एक बार EWOD चिप फोटोडिटेक्टर के साथ गठबंधन किया है, DMF मंच पूरी तरह से इकट्ठा हो गया है और अब काम करने के लिए तैयार है । - डीएमएफ प्लेटफॉर्म पर ढक्कन रखें और हर्टफोर्डशायर विश्वविद्यालय में विकसित सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग करके प्रोग्राम अनुक्रम शुरू करें।
नोट: अतिरिक्त सॉफ्टवेयर पढ़ने और एक CSV फ़ाइल में समय के एक समारोह के रूप में बूंद से ल्यूमिनेसेंस रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है (पूरक फ़ाइल 2देखें) ।- सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम किए गए अनुक्रम (पूरक फ़ाइल 1देखें) ऑपरेटर को सूचित करने के लिए इंटरफ़ेस पर त्वरित संदेश दिखाई देते हैं कि "ल्यूमिनॉल ड्रॉपलेट निकाले गए चुंबकीय मोतियों को इकट्ठा करने के लिए तैयार है" या "डिटेक्शन ड्रॉपलेट को डिटेक्शन साइट पर ले जाने के लिए तैयार है। दोनों ही मामलों में, ऑपरेटर से पुष्टि अनुक्रम के साथ आगे बढ़ने के लिए आवश्यक है।
4. दृश्य मोड में परिचालन (प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए वैकल्पिक)
नोट: यदि वांछित है, तो हर बूंद-आधारित ऑपरेशन की कल्पना करने के लिए, परख को चरण 3.10-3.12 लंघन करके और निम्नलिखित अभियानों द्वारा उनकी जगह ले सकते हैं।
- सॉफ्टवेयर इंटरफेस का उपयोग कर प्रोग्राम अनुक्रम शुरू करें।
नोट: विजुअल मोड में काम करते समय ड्रॉपलेट मूवमेंट देखा जा सकता है, जो प्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान उपयोगी होता है। सबसे पहले, चुंबकीय पृथक्करण ऑपरेशन की प्रजनन क्षमता की जांच करने के लिए। उदाहरण के लिए, यदि उपयोग किए जाने वाले मोतियों की मात्रा बहुत कम है, तो चुंबकीय अलगाव नहीं होगा, इसके विपरीत, यदि मोतियों की मात्रा बहुत अधिक है, तो मड पैलेट द्वारा बूंद को स्थिर किया जा सकता है। दूसरे, एक नई परख की विश्वसनीयता का पता लगाने के लिए कुछ बूंद निर्माण के रूप में एकता हानि है कि अवलोकन द्वारा पता लगाया जा सकता है पैदा कर सकता है । - फोटोडिटेक्टर की जांच की "कर सकते हैं" घूर्णन चरण के भट्ठा में माउंट, जब प्रेरित किया ।
- सॉकेट में पिन डालकर केबल को फोटोडिटेक्टर से कनेक्ट करें "कर सकते हैं"।
- डीएमएफ प्लेटफॉर्म के ऊपर ढक्कन रखें और परख फिर से शुरू करें।
नोट: सीएसवी फ़ाइल में समय के एक समारोह के रूप में बूंद से ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने और रिकॉर्ड करने के लिए अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (पूरक फ़ाइल 2देखें)
5. तरल कचरे को हटाना और चिप की सफाई
सावधानी: सुनिश्चित करें कि उपकरण बंद कर दिया है और बिजली स्रोतों (कंप्यूटर, मुख्य) से काट दिया सफाई से पहले । चिप से जैविक नमूनों को हटाते समय दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट और चश्मे सुरक्षात्मक ग्लास (पीपीई) पहनें!
- इलेक्ट्रोड और एक्चुएशन प्लेट पर इस्तेमाल किए गए सॉल्वैंट्स तक पहुंचने के लिए डीएमएफ प्लेटफॉर्म ढक्कन खोलें और स्टेज को 180 डिग्री घुमाएं ।
- चुंबक आवरण को अनहिंग करें, चुंबक को घूर्णन चरण से हटा दें और इसे बेंच पर रखें।
- कवर प्लेट, सिलिकॉन वेफर को चिमटी की एक जोड़ी के साथ भट्ठा से निकालें, इसे डीआई पानी से कुल्लाकरें, इसे संकुचित हवा के साथ सुखाएं और इसे पेट्री डिश में रखें, जहां वेफर को संग्रहित और पुन: उपयोग किया जा सकता है।
- सतह को छुए बिना पैड से तरल कचरे को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें।
- शोषक कागज (फिल्टर सामग्री) का उपयोग करके एक्टयूशन प्लेट से तरल को बंद करके सतह को साफ करें।
नोट: सतह को अक्षुण्ण रखने से एक्ट्युशन प्लेट की दीर्घायु बढ़ जाएगी, जो कई उपयोगों की अनुमति देता है। - एक साफ पिपेट का उपयोग करके एक साफ DI पानी की बूंद के साथ इलेक्ट्रोड की सतह को धीरे से व्यापक करके एक्ट्युशन प्लेट को साफ करें। फिर बाती कागज (फिल्टर सामग्री) के साथ बूंद निकालें।
सावधानी: ऊतकों, कागजात, पिपेट युक्तियों और दस्ताने है कि जैव अपशिष्ट बिन में जैविक सामग्री के साथ दूषित कर रहे है का निपटान । - एक अलग परख के लिए एक्क्यूशन प्लेट का उपयोग करें या भंडारण या रीसाइक्लिंग के लिए डीएमएफ प्लेटफॉर्म से इसे हटा दें।
Representative Results
एक्ट्युएशन वोल्टेज प्रभाव की जांच की गई ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि परखों को करने के लिए इष्टतम स्थितियां क्या थीं। बफर से एक बूंद विभिन्न एक्ट्युएशन वोल्टेज पर संचालित किया गया था और इसकी गति दर्ज की गई थी। निष्कर्षों का प्रदर्शन किया(चित्रा 3)एक संबंध रूट मतलब वर्ग एक्ट्युशन वोल्टेज (वीआरएमएस)और औसत वेग के बीच मौजूद था । हालांकि, वीआरएमएस के लिए उच्च मूल्यों का उपयोग किए जाने पर एक एक्ट्युशन प्लेट की दीर्घायु कम हो गई थी। इनपरिणामों के आधार पर, 105 वी आरएमएस को मानक एक्ट्युएशन वोल्टेज के रूप में चुना गया था, 120 वीआरएमएस को एच2ओ2/लुमिनॉल ड्रॉपलेट के लिए सबसे अच्छा काम करने के लिए पाया गया था और निष्कर्षण लुओ के लिए 165 वीआरएमएस लागू किया गया था। इन वोल्टेज को ऑटोमेटेड प्रोग्रामिंग सीक्वेंस(सप्लीमेंट्री फाइल 1)में शामिल किया गया था ।
दो इम्यूनोअकह(चित्रा 4)को चार अलग-अलग रोगजनकों(तालिका 1)के लिए डीएमएफ प्लेटफॉर्म के साथ ईडब्ल्यूओडी चिप का सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया। ईडब्ल्यूओडी चिप ने लोडिंग पैड से मिक्सिंग क्षेत्र और अंत में कचरे के लिए बूंदों की लगातार आवाजाही की सुविधा प्रदान की। एलिसा को पूरा करने के लिए पूरे प्रोटोकॉल में दो बुनियादी एलओओ दोहराए गए थे। पहला निष्कर्षण LUO था; संक्षेप में यहां वर्णित है, निलंबित मोतियों युक्त बूंद मिश्रण क्षेत्र के बीच में जुदाई साइट के लिए प्रेरित किया गया था, चुंबक स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए चिप दृष्टिकोण और एक गोली में चुंबकीय मोती पूल(चित्र5)। इसके बाद, बूंद अपशिष्ट पैड की ओर ले जाया गया था, जो मोतियों को एक्ट्युक्शन प्लेट पर छोड़ रहा था, इस प्रकार निष्कर्षण लुओ को समाप्त करता था। मिश्रण EWOD चिप पर जगह लेने के लिए अगले प्रमुख LUO था । रोगजनकों की एक अज्ञात एकाग्रता के साथ एनालाइट नमूना इलेक्ट्रोवेटिंग द्वारा मोतियों पर ले जाया गया था। फिर मोतियों को मिश्रण क्षेत्र (कुल 10 पैड) पर झुरमुट मोतियों के साथ बूंद ले जाकर फिर से निलंबित कर दिया गया। ये दोनों एलओ आवश्यक थे क्योंकि उन्होंने 6 से 10 मिन में रोगजनकों का लगातार पता लगाने के साथ एक लघुकृत, तेजी से और प्रजनन योग्य नमूना प्रसंस्करण की सुविधा प्रदान की। चित्र6 ईडब्ल्यूओडी चिप के साथ पूरा किए गए इम्यूनोसे से LUOs के पूर्ण अनुक्रम को दर्शाता है।
स्वचालन के वांछित स्तरों को पूरा करने के लिए, प्रोटोकॉल में भिन्नता शुरू की जा सकती है। उदाहरण के लिए, मोतियों को एंटीजन समाप्त बूंद से अलग किया गया था, जिसे तब अपशिष्ट पैड में स्थानांतरित कर दिया गया था, बुनियादी निष्कर्षण LUO दोहरा रहा था। इस स्तर पर, प्रोटोकॉल इस आधार पर शाखा सकता है कि क्या पता लगाने वाले एंटीबॉडी को पहले से ही एचआरपी के लिए संयुग्मित किया गया था, विभिन्न एंटीजन(चित्रा 7ए-सी)का पता लगाने के लिए कुल आठ एलयूओ का प्रभावी ढंग से उपयोग कर रहा था। इन मामलों में, डिटेक्शन एंटीबॉडी के साथ बूंद को मोतियों में लाया गया था और फिर ऐक्टिवेशन द्वारा मिलाया गया था। वैकल्पिक रूप से, न्यूट्राविडिन-एचआरपी संजूगेट के लिए पता लगाने वाले एंटीबॉडी को ईडब्ल्यूओडी चिप पर सीटू में क्रमिक रूप से किया जा सकता है, क्योंकि इसे ई कोलाई (चित्रा 7डी)के परिमाणीकरण के लिए प्रदर्शित किया गया था। दोनों प्रोटोकॉल, आठ और दस कदम एलिसा(चित्रा 4),एंटीजन का पुन: उत्पादन योग्य पता लगाया ।
ऊष्मायन समय और संयुगक सांद्रता को परख के लिए प्रयोगात्मक रूप से इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए भिन्न थे(चित्र7ए)। यह पाया गया कि १६० एस के ऊष्मायन समय और 2 μg/mL की एकाग्रता संजोना संकेत शक्ति की ३६% वृद्धि और पृष्ठभूमि शोर के स्तर में वस्तुतः कोई परिवर्तन के साथ शोर अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत हासिल किया । प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले सभी आंकड़ों और आंकड़ों को पहले के कार्य6से संशोधित किया गया था ।
| प्राथमिक/कैप्चर एंटीबॉडी | एंटीबॉडी का पता लगाना | Antigen |
| एंटी ह्यूमन सीरम एल्बुमिन [15C7] (विरोधी एचएसए, Abcam ab10241) | हॉर्स मूली Peroxidase (HRP) विरोधी HSA टैग [1A9] (Abcam ab24438) | मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए, एबीसीएएम) |
| आरबी एंटी-बीजी पॉलीक्लोनल | बायोटिनेटेड आरबी एंटी-बीजी पॉलीक्लोनल | बी ग्लोबी (बीजी) बीजाणु |
| आरबी एंटी-ई.कोलाई एमआरई 162 पॉलीक्लोनल | बायोटिनेटेड आरबी एंटी-ई.कोलाई 162 एमआरई पॉलीक्लोनल | ई. कोलाई एमआरई 162 |
| बकरी विरोधी MS2 पॉलीक्लोनल | बायोटिनीटेड आरबी एंटी-एमएस 2 पॉलीक्लोनल | MS2 बैक्टीरियोफेज वायरस |
तालिका 1: इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किए गए एंटीजन और एंटीबॉडी। डीएमएफ प्लेटफॉर्म के साथ ईडब्ल्यूओडी चिप की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए चार प्रकार के रोगजनक एंटीजन का उपयोग किया गया था।
चित्रा 1: EWOD प्लेट का डिजाइन। (क)कनेक्टर (वर्ग, शीर्ष) के साथ ईडब्ल्यूओडी एक्टुएशन प्लेट का योजनाबद्ध नोटेशन जो इलेक्ट्रोड (वर्ग, नीचे) से जुड़े हुए हैं।' प्रत्येक पैड को एक नंबर सौंपा जाता है और इसे सॉफ्टवेयर कोड(सप्लीमेंट्री फाइल 1)से संबोधित किया जा सकता है। लोडिंग इलेक्ट्रोड पैड तीर द्वारा चिह्नित किए जाते हैं और प्रत्येक पैड के ऊपर या नीचे एक पूंजी पत्र द्वारा चिह्नित होते हैं। डीएमएफ प्लेटफॉर्म के लिए एक प्रमुख विशेषता मिश्रण क्षेत्र है जिसमें दस पैड (नंबर 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47) शामिल हैं। एक दृश्य गाइड के रूप में, मिश्रण क्षेत्र एक लाल आयत के साथ चिह्नित किया गया है। (ख)पैड के माइक्रोग्रिड डिजाइन का माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: डिजिटल माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम (डीएमएफ) असेंबली के लिए घटक और प्रमुख चरण। (क) ईडब्ल्यूओडी एक्टुएशन प्लेट को ठीक करें, शिम को घूर्णन चरण पर रखें और बूंदों को लोड करें । (ख) कवर प्लेट की स्थिति । (ग) चुंबक मामले को माउंट करें, लैच जकड़ें और चरण को 180 डिग्री घुमाएं। (ग) स्वचालित चुंबक नीचे की ओर इशारा कर रहा है । बूंदों की स्थिति और आकार का निरीक्षण करें, जांच ें कि मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) पिन ईडब्ल्यूओडी चिप पर संपर्कों के साथ गठबंधन कर रहे हैं, फोटोडिटेक्टर कनेक्ट करें और इसे फोटोडिटेक्टर स्लॉट में रखें। कंट्रोल इलेक्ट्रॉनिक्स को कंप्यूटर से जोड़ने के बाद सिस्टम परख चलाने को तैयार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एक्ट्युएशन प्लेटों का दोहराव उपयोग और एक्टुएशन वोल्टेज पर प्रभाव। चल रहे बफर से एक बूंद का औसत वेग एक्ट्युएशन वोल्टेज (नीले घेरे) के एक समारोह के रूप में और तीन स्वतंत्र माप (एन = 3) से मानक विचलन के रूप में साजिश रची जाती है। यहां प्रति प्लेट परखों की संख्या (ग्रे बार) उच्च वोल्टेज पर सतह के बढ़े हुए क्षय को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र4: इम्यूनोअस का आरेख EWOD के साथ परीक्षण किया गया। इस आरेख में प्रत्येक सर्कल EWOD चिप पर लोड 2.5 μL की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। पहला प्रोटोकॉल (बाएं हाथ की ओर) प्रीमिक्स्ड एंटीबॉडी-एचआरपी कॉन्जूगेट का उपयोग करके आठ एलओओ दिखाता है; जबकि, दूसरे प्रोटोकॉल में दस एलयूओ शामिल हैं, जो बायोटिनेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी, मनका निष्कर्षण और न्यूट्राविडिन-एचआरपी कॉन्जूगेट के लगातार बंधन को अलग से जोड़ते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: चुंबकीय मनका निष्कर्षण। इस प्रक्रिया को (ए-सी) में टूट गया है मिश्रण क्षेत्र (पैड नंबर 33), (डी, ई) चुंबक के बीच में चुंबकीय जुदाई स्थल के लिए निलंबित चुंबकीय मोतियों के साथ बूंद अभिनय मोती ध्यान केंद्रित स्थिति में जा रहा है, (एफ, जी, एच) मोती चुंबकीय बल द्वारा जगह में आयोजित कर रहे हैं, जबकि ड्रॉपलेट अपशिष्ट पैड (पैड नहीं 41) की ओर EWOD द्वारा दूर actuated है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: EWOD का उपयोग करके पूर्ण इम्यूनोसे अनुक्रम, अभिकर्मकों, नमूना लोडिंग और प्रयोगशाला इकाई संचालन दिखा। प्रत्येक पंक्ति में एक बूंद पर विशिष्ट संचालन से नमूना छवियों का एक अनुक्रम होता है। संचालन को कॉलम में विभाजित किया गया है। मिश्रण निलंबन में मोतियों के लिए प्रदर्शन नहीं किया जाता है, एक काली टूटी हुई लाइन द्वारा प्रस्तुत किया जाता है। बूंद दिशाओं नीले तीर से संकेत मिलरहे हैं, मोती एक नारंगी तीर से छवियों में से एक में प्रकाश डाला जाता है । ग्रे बॉक्स (नीचे सही कोने) दो छवियों है कि आंदोलन और पता लगाने के क्षेत्र में स्थिति का प्रतिनिधित्व अलग, टूटी हुई लाइन सर्कल का पता लगाने क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: डीएमएफ प्लेटफॉर्म के साथ ईडब्ल्यूओडी चिप पर आयोजित इम्यूनोअस से कैलिब्रेशन घटता है। जैसा कि पहले रिपोर्ट6 आउटपुट वोल्टेज (एमवी) बनाम सांद्रता के लिए दिखाया गया है: (ए) मानव सीरम एल्बुमिन, जिसका उपयोग संयुग्मन एंटीबॉडी एकाग्रता [सी] और ऊष्मायन समय के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, टीइंक,निष्कर्षण लुओ तक ज्ञात एनालेट के साथ मोतियों के मिश्रण से मापा जाता है, (बी) बी एट्रोफेयस (बीजी) बी बी इम्यूनोसे की प्रजनन क्षमता दिखाते हैं, (सी) एमएस 2 बैक्टीरियोफेज इम्यूनोसे, और (Dd) दस-एलओओ ई. कोलाई। संक्षिप्त रूप: कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू), पट्टिका बनाने वाली इकाइयां (पीएचएफओ), स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या (एन), प्रयोगशाला इकाई संचालन (एलओओ)। पिछले प्रकाशन6से संशोधित आंकड़ा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फ़ाइल 1: न्यूट्राविडिन-एचआरपी के साथ स्वचालित एलिसा परख के लिए डीएमएफ प्लेटफॉर्म को संजोने के रूप में चलाने के लिए पूरा अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 2: केमिल्यूमिनेसेंस माप नप के लिए जीयूआई और सॉफ्टवेयर के साथ माप से एक उदाहरण दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
EWOD इम्यूनोसे प्रोटोकॉल लचीला है और इसमें विभिन्न संख्या में प्रयोगशाला इकाई संचालन (जैसे, एंटीजन, मिश्रण, ऊष्मायन, माक निष्कर्षण, धोने) शामिल हो सकते हैं, जो परख प्रोटोकॉल द्वारा परिभाषित अभिएजेंट प्रकार, स्थिरता और उपयोग आवश्यकताओं के आधार पर है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, वर्तमान लेख में, दो इम्यूनोसे प्रोटोकॉल को वर्णित ईडब्ल्यूओडी चिप के साथ आठ या दस LUOs(चित्रा 4)के कार्यान्वयन को दिखाने पर विचार किया जाता है। माइक्रोलीटर से इस तरह के लघुकरण गुण, अभिकर्मकों की असतत मात्रा/एनालिट जो अभिकर्मकों की खपत, प्रति ऑपरेशन आवश्यक समय, अनिवार्य रूप से कुल प्रायोगिक समय (6 से 10 न्यूनतम) को कम करके एलिसा की प्रभावकारिता को बढ़ाते हैं । इसके अलावा, परख बूंदों के समय पर हेरफेर के साथ स्वचालित है जो विविधताओं को कम करता है और इम्यूनोसे17की सटीकता में सुधार करता है। अपने वर्तमान प्रारूप में, प्रयोग प्रत्येक परख की शुरुआत में बूंदों की मैनुअल हैंडलिंग शामिल है, जो अगले खंड में आगे चर्चा के लिए एक बिंदु है ।
वर्तमान DMF विधि में एक महत्वपूर्ण कदम EWOD चिप की सतह पर बूंदों वितरण है । आमतौर पर, डिस्पोजेबल टिप वाले माइक्रोपाइपेट का उपयोग सटीक मात्रा को मापने और इसे लोड करने के लिए किया जाता है। हालांकि, बूंद और डिस्पोजेबल टिप की आवेशित सतह के बीच बातचीत के कारण एक्क्यूशन प्लेट की हाइड्रोफोबिक सतह पर बूंद को स्थिर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। नतीजतन, बूंद थाली पर शेष के बजाय टिप की बाहरी सतह के बाद शूट कर सकते हैं । इससे बचने के लिए, माइक्रोपाइपेट को एक ईमानदार स्थिति में रखा जाना चाहिए, चिप सतह पर लंबवत, इसे छूने के बिना, फिर बूंद को सतह के संपर्क में लाकर लोडिंग पैड पर तिरस्कृत किया जा सकता है। क्या बूंद को पिपेट टिप से चिपकजाना चाहिए, इसे स्टॉक समाधान पर वापस करना चाहिए, टिप का आदान-प्रदान करना चाहिए और एक ताजा बूंद को फिर से जमा करना चाहिए। वर्तमान प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट सिस्टम के एक और विकास में, बूंद के स्वचालित वितरण की परिकल्पना की जा सकती है ।
परख चलाने से पहले एक और महत्वपूर्ण कदम, समानांतर प्लेट असेंबली के ढक्कन को बंद कर रहा है। जैसा कि प्रोटोकॉल में पहले कहा गया है, ढक्कन को एक्ट्युएशन प्लेट के शीर्ष पर गिरावट होनी चाहिए। ढक्कन की हाइड्रोफोबिक सतह एक्क्यूशन प्लेट पर बैठी बूंदों की विकृति और विस्थापन को रोकती है। बूंद के चिकनी आंदोलन की गारंटी देने के लिए, प्राचीन एक्ट्यूएशन प्लेट, बूंदों और चिप असेंबली की सही लोडिंग का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। ऐक्टिवेशन प्लेट्स की पुन: प्रयोज्यता संभव है; हालांकि, चक्रों की संख्या एक्ट्युएशन वोल्टेज(चित्रा 3)और सतह पर एनालाइट/रिएजेंट बयान, उर्फ बायोफाउलिंग पर निर्भर करती है । प्रस्तुत मंच क्रोम मुद्रित EWOD चिप का उपयोग किया है, जो प्रत्येक प्रयोग के बाद १२० वी और मध्यवर्ती प्लेट सफाई के ऑपरेटिंग वोल्टेज पर लगातार माप के लिए मज़बूती से पुन: उपयोग किया जा सकता है । प्लेटों को पुनर्नवीनीकरण किया गया था, प्रति प्रयोग लागत को कम करने के लिए, दूषित (अच्छी तरह से रिंसिंग से पहले बिना पतला सफाई एजेंट के साथ सतह को ब्रश करना) बायोफाउल असंगत फ्लोरोपॉलिमर(सामग्री की तालिका)कोटिंग और स्पिन-कोटिंग प्लेट के शीर्ष पर एक ताजा एक। हालांकि, एक्क्यूशन प्लेट रीसाइक्लिंग के लिए मैनुअल हैंडलिंग, महंगे रिएजेंट्स (असंगत फ्लोरोपॉलिमर(सामग्री की तालिका)और विशेष उपकरण (स्पिन-कोटर) की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक ईडब्ल्यूओडी चिप्स की सफलतापूर्वक जांच की जाती है जैसे कि पेपर19,एसीटेट फिल्में या मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी)20,21जैसे लागत कुशल सब्सट्रेट्स। इस तरह के डिस्पोजेबल उपभोग्य सामग्री DMF मंच के विश्वसनीय और किफायती उपयोग की सुविधा कर सकते हैं और बायोफाउलिंग मुद्दे को टालने के साधन प्रदान कर सकते हैं।
बायोफाउलिंग जैविक अनुप्रयोगों के लिए ईडब्ल्यूओडी की मुख्य सीमाहै 22,23। डीएमएफ पर पहले के अध्ययनों में दो तंत्रों की पहचान की गई है जो हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के कारण बायोफाउलिंग में योगदान देते हैं, और एक विद्युत क्षेत्र24लागू होने पर इलेक्ट्रोस्टैटिकरूप से संचालित सोखने का प्रकट होता है। वर्तमान लेख में निष्कर्ष इस सिद्धांत के अनुरूप हैं क्योंकि यह प्रलेखित किया गया था कि उच्च एक्ट्युएशन वोल्टेज पर एक्ट्युएशन प्लेट पुन: प्रयोज्य कम हो जाता है। एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि फ्लोरोपॉलिमर-लेपित (टेफ्लॉन जैसी) सतहों पर प्रोटीन आसानी से एसोर्ब होता है और वे प्राचीन सतहों24की तुलना में फाउल पर तेजी से कुल मिलते हैं। नतीजतन, DMF पर प्रोटीन से संबंधित परखों की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल है और एनालिएट, पार संदूषण और कम परिशुद्धता17की हानि का अनुभव हो सकता है । सबसे खराब स्थिति तब होती है जब प्रोटीन एसोर्ब्स की एक महत्वपूर्ण मात्रा इस प्रकार डिवाइस को बेकार कर देती है। बायोफाउलिंग को कम करने के लिए, चिप पर बूंद के निवास के समय को कम करने से विभिन्न दृष्टिकोणों की जांच की गई है, कोटिंग्स23के माध्यम से, योजक (यानी, सर्फेक्टेंट या प्लोरोनिक एसिड) को बायोमटेरियल से लदी बूंदों6,22में। इसलिए EWOD पर इम्यूनोअसे परख का एक महत्वपूर्ण पहलू विरोधी बायोफाउलिंग रणनीतियों का चयन करना है जो हाथ में विशिष्ट प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं।
स्वचालित डीएमएफ प्लेटफॉर्म को प्रति रन एक सैंडविच एलिसा परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि दोनों अभिकर्मकों और एनालिएट के लिए माइक्रोलीटर वॉल्यूम का उपयोग करते हैं। जब इसकी आवश्यकता होती है, तो पारंपरिक सैंडविच एलिसा किट पूर्व-लेपित 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी प्लेटों के आधार पर मौजूद होती है जो सहायक प्रयोगशाला उपकरणों के संयोजन में प्रति रन उच्च थ्रूपुट में परिणाम देती है; केवल अभिकर्मकों की कीमत के आधार पर, परख/अच्छी तरह से अनुमानित लागत क्रमशः 6.04 अमरीकी (580 अमरीकी डॉलर/96) और 0.33 अमरीकी डॉलर (2 × 580 अमरीकी डॉलर/384) है। यह केंद्रीकृत प्रयोगशाला सुविधाओं में प्रशिक्षित तकनीकी कर्मियों द्वारा आम तौर पर संसाधित नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए पारंपरिक एलिसा विधियों को आदर्श बनाता है। हालांकि, दूरदराज के स्थानों में, पर्यावरण निगरानी के लिए एलिसा के विस्तृत लागत विश्लेषण से पता चला है कि जब पूंजी गत लागत (यानी, प्रयोगशाला परिचालन लागत, आवर्ती लागत, नमूना परिवहन, आपूर्ति और कार्मिक) को शामिल किया गया था एलिसा प्रति वास्तविक मूल्य 60 अमरीकी था जिसमें से 34 अमरीकी प्रति नमूना25की आपूर्ति के लिए थे। इसके विपरीत, प्रस्तावित डीएमएफ प्लेटफॉर्म पोर्टेबल है, इसे संचालित करने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और पूर्व-लेपित मोतियों के साथ मिनटों में नमूना-से-उत्तर विश्लेषण प्रदान कर सकता है। इसलिए, प्रस्तुत प्रौद्योगिकी को बिंदु की जरूरत स्थानों और पूरक विश्लेषण अंयथा केंद्रीकृत प्रयोगशालाओं में उपलब्ध करने के लिए तैनात किया जा सकता है ।
प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, स्वचालित DMF इम्यूनोसे मंच का उपयोग रक्षा आवेदन के लिए रोगजनकों का प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए किया गया था। डीएमएफ प्लेटफॉर्म के लिए अन्य संभावित अनुप्रयोगों में शामिल है लेकिन बायोडायग्नोस्टिक, निरंतर निगरानी और स्वचालित नमूने तक सीमित नहीं हैं। संभावित रूप से DMF व्यक्तिगत स्वास्थ्य देखभाल के लिए बिंदु की देखभाल से विविध क्षेत्रों को प्रभावित कर सकता है, साथ ही हवाई अस्पताल अधिग्रहीत संक्रमण से रोगियों की सुरक्षा के लिए नियंत्रित पर्यावरण निगरानी, खेती के लिए फसल निगरानी प्रणाली के लिए और खाद्य उत्पादन।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम मैकेनिकल डिजाइन और सिस्टम एकीकरण पर उनके काम के लिए माइक्रोफ्लूइडिक एंड माइक्रोइंजीनियरिंग रिसर्च ग्रुप के अपने सहयोगियों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक अपने अमूल्य समर्थन और वित्तीय योगदान के लिए डीएसटीएल पोर्टन डाउन को धन्यवाद देना चाहते हैं, अतीत और चल रही परियोजनाओं के लिए जो डीएमएफ प्रौद्योगिकी और उसके अनुप्रयोगों को और विकसित करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
| Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
| B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
| CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
| Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
| E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
| Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
| Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
| Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
| MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
| Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
| Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
| Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
| SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
| Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
| Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
| SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
| Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |
References
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