Elektrofuktningsbaserad digital mikrofluidisk är en teknik som använder en spänningsdriven förändring i den skenbara kontaktvinkeln hos en mikrolitervolymdropp för att underlätta dess manipulering. Genom att kombinera detta med funktionella magnetiska pärlor möjliggör integrering av flera laboratorieenhetsoperationer för provberedning och identifiering av patogener med enzymanknuten immunosorbent assay (ELISA).
Elektrofuktning är den effekt med vilken kontaktvinkeln för ett dropp som utsätts för en ytladdning ändras. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) utnyttjar de dielektriska egenskaperna hos tunna isolatorfilmer för att förbättra laddningstätheten och därmed öka elektrofuktningseffekten. Förekomsten av avgifter resulterar i en elektriskt inducerad spridning av droppen som tillåter målmedveten manipulation över en hydrofoba yta. Här demonstrerar vi EWOD-baserade protokoll för provbearbetning och detektion av fyra kategorier av antigener, med hjälp av en automatiserad ytaktiveringsplattform, via två varianter av metoder för enzymrelaterad immunsorbent assay (ELISA). ELISA utförs på magnetiska pärlor med immobiliserade primära antikroppar som kan väljas för att rikta ett specifikt antigen. En antikropp som konjugeras till HRP binder till antigenet och blandas med H2O2/Luminol för kvantifiering av de fångade patogenerna. Analys avslutningstider på mellan 6 och 10 min uppnåddes, medan minimala volymer av reagenser utnyttjades.
Den föreslagna metoden syftar till att underlätta automatiserad provberedning för ELISA med kvantitativ upptäckt av antigener med hjälp av EWOD-baserad metod med digital mikrofluidik (DMF) och magnetoforesitisk separation. Det har visats för flera biologiska tillämpningar att DMF i kombination med magnetofores är ett intressant alternativ till flytande hanteringsapplikationer1. Mer specifikt är upptäckten av patogener en implicit aspekt inom många sektorer, från hälso-och sjukvård 2 till jordbruk och miljö3,4 till nationell säkerhet5. En detektionsteknik som kan ta itu med hoten från patogener måste innehålla hög genomströmning (t.ex. kort analystid), effektivitet (låg detektionsgräns – LoD – och hög känslighet) och specificitet (för målpatogentyp) för att den ska fungera6.
Tidigare har EWOD-baserade DMF genomförts framgångsrikt för Omvänd transkription Polymeraskedjereaktion (RT-PCR), upptäckt av en antibiotikaresistent patogen (Meticillinresistentstaphylococcus aureaus eller MRSA), M.pneumonia och C.albicans med en låg budget, tryckt kretskortschip och magnetofos7. Tekniken tillämpades också för detektion av deoxyribonukleinsyra (DNA) mutationer genom pyrosekvensering och chemiluminescent upptäckt8. EWOD-baserade plattformar utökar också sin funktionalitet mot immunassay applikationer, vilket möjliggör samtidig provåtervinning och detektering inom en enda, integrerad plattform. Till exempel visades en enda EWOD-chip design framgångsrikt med en DMF plattform för point-of-care testning för både bead-baserade immunoassays av hjärt troponin I från ett helblodprov och som ett separat experiment RT-PCR för MRSA upptäckt2. Det chipet använder oljefyllmedel, vilket förhindrar avdunstning av dropparna och underlättar tillförlitlig automatiserad manipulering av nanolitersvolymer. Mångsidiga biotillämpningar undersöktes med genomförandet av liknande DMF-metoder som omfattar kvantitativhomogena och heterogena immunanalyser9,10 inklusive utformning av experiment (DoE) studier för analys parameteroptimering11.
Trots sina uppenbara meriter att bearbeta intensifiering på grund av miniscule arbetsvolymer, en oljefylld DMF plattform kan vara utmanande och kräver en viss nivå av expertis för att fungera. Oljefyllda system, eftersom de kräver förseglade komponenter, är inte idealiska för vissa in-field tillämpning där systemet transportability är viktigt. Dessutom skulle ett oljebaserat system vara mycket svårt om inte omöjligt att använda för vissa specifika tillämpningar som utnyttjar torrmaterialinsamling på en yta som föreslagits av Zhao och Cho12, Jönsson-Niedziółka m.fl.13, och Foat et al.14. Däremot är oljefria system enkla att integrera och har fördelen av att ge enkel chip-to-chip provöversättning. Av dessa skäl har den föreslagna metoden utvecklats för att tillhandahålla en EWOD-baserad immunanalys på DMF som inte skulle kräva olja, vilket effektivt förenklar enhetens drift.
I detta bidrag rapporterar vi om att använda en skräddarsydd, fristående, helt automatiserad DMF-plattform för immunoassays, och vi utvecklar protokollet för snabb upptäckt av biomolekyler, nämligen proteiner, vegetativa bakterier, bakteriesporer och virus. Kombination av EWOD-chip med magnetiska partiklar för automatiserad provberedning och immunfällning har redan visats med ytterligare en off-line MS-mätning15. Nyligen har in-field diagnostik mot mässling och röda hund IgG visats i avlägsna nordvästra Kenyas befolkning av Wheeler grupp16. Både Wheelers och vårt system, som är transportbara, fristående, helt automatiserade med medföljande på chip, realtid chemiluminescent mätningar är utan tvekan bland de mest avancerade DMF biodetection system som finns tillgängliga.
De två systemen har utformats med mycket olika applikationer i åtanke. Wheelers system riktar biomarkör för att tillåta biomedicinsk diagnostik på patienter medan vårt biodetekteringssystem är uppbyggt kring försvarskrav för direkt detektering av patogen som tidigare provats från luft. Likheten mellan de två är den underliggande principen om droppaktivering, som visar det breda spektrum av life-influencing sektorer att ewod-baserad teknik kan påverka. Nämligen dmf-baserade detektionsplattformen och tillhörande EWOD-system kan finna en viktig inverkan på hälsan (biomedicinsk diagnostik); militärt och civilt skydd (hotdetektering). Agri-tech (övervakning av grödor) och arbetssäkerhet (kontrollerad miljöövervakning)
Utförandet av vår DMF plattform bedöms mot helt automatiserad upptäckt av mänskliga serum albumin (HSA, en klotformig protein), Escherichia coli (E. coli, en vegetativ atrophaeus(BG, en bakteriell spor) och MS2 (en bacteriophage virus). Ännu viktigare är den föreslagna DMF-metoden extremt mångsidig i den meningen att fånga antikroppar kan utbytas för att rikta upptäckten av andra antigener som skiljer sig från de fyra som beaktas i denna artikel. Kringgå antikroppsbaserade avkänning helt, dmf-plattformen kan bygga till en potentiell tillämpning baserad på aptamer biosensing, där de magnetiska pärlorna bär specifika aptamers för fångst och / eller upptäckt av nukleotider. Utformningen och förverkligandet av de olika komponenterna som utgör den integrerade, helt fristående DMF-plattformen, inklusive högspänningsvågformgeneratorn och drivelektroniken avslöjas någonannanstans 6.
EWOD-immunoassayprotokollet är flexibelt och kan omfatta ett annat antal laboratorieoperationer (t.ex. fånga antigen, blandning, inkubation, beadutvinning, tvättning) beroende på de reagenstyp, stabilitets- och användningskrav som definieras av analysprotokollet. Som ett principbevis anses två immunoassayprotokoll i den aktuella artikeln visa genomförandet av åtta eller tio luos(figur 4)med EWOD-chippet som beskrivs. Sådana miniatyrisering fördelar från mikroliter, diskreta volymer av reagenser/ analyt som ökar effekten av ELISA genom att minska både förbrukningen av reagenser, den tid som krävs per operation, i huvudsak den totala experimentella tiden (6 till 10 min). Dessutom är analysen automatiserad med tidssänkad manipulering av droppar som minskar variationer na och förbättrar precisionen i immunoassay17. I sitt nuvarande format innebär experimentet manuell hantering av droppar i början av varje analys, vilket är en punkt för vidare diskussion i nästa avsnitt.
Ett kritiskt steg i den nuvarande DMF-metoden är att dela ut dropparna på Ytan av EWOD-chippet. Vanligtvis används en micropipett e med en engångsspets för att mäta den exakta volymen och ladda den. Det kan dock bli svårt att immobilisera droppen på den hydrofoba ytan av aktiveringsplattan på grund av interaktioner mellan droppen och den laddade ytan på engångsspetsen. Som ett resultat kan droppen skjuta upp efter den yttre ytan av spetsen istället för att stanna kvar på plattan. För att undvika detta måste mikropipetten hållas i upprätt läge, vinkelrätt mot spånytan, utan att röra vid den, kan droppen lämnas ut på lastplattan genom att den kommer i kontakt med ytan. Om droppen fastnar på pipettspetsen, returnera den till lagerlösningen, byt tipset och sätt tillbaka en ny dropp. I en vidareutveckling av det nuvarande proof-of-concept-systemet kan automatisk leverans av dropp planeras.
Ett annat kritiskt steg, innan du kör analysen, stänger locket på parallellplattan satt. Som tidigare nämnts i protokollet måste locket glidas ovanpå aktiveringsplattan. Lockets hydrofoba yta förhindrar förvrängning och förskjutning av dropparna som sitter på manövrerplattan. För att garantera droppens smidiga rörelse rekommenderas det starkt att använda orörd aktiveringsplatta, korrekt lastning av dropparna och spånmonteringen. Det är möjligt att återanvändbara för aktiveringsplattorna. Antalet cykler beror dock på aktiveringsspänningarna (figur 3)och analyt/reagensnedsättning på ytan, aka biofouling. Den presenterade plattformen utnyttjade kromtryckt EWOD-chip, som skulle kunna återanvändas på ett tillförlitligt sätt för på varandra följande mätningar upp till fyra gånger vid driftspänning på 120 V och mellanplattsrengöring efter varje experiment. Plattorna återvanns, för att minska kostnaden per experiment, genom att dekontaminera (borsta ytan med outspäddrengöringsmedel innan de sköljde noggrant) den biofouled amorfa fluorpolymerer(Table of Materials)beläggning och spin-beläggning en ny ovanpå plattan. Manövrering plattan återvinning kräver manuell hantering, kostsamma reagenser (amorfa fluorpolymerer(Table of Materials)) och specialiserad utrustning (spin-coater). Alternativa EWOD-chips undersöks framgångsrikt med kostnadseffektiva substrat som papper19,acetatfilmer eller kretskort (PCB)20,21. Sådana engångsförbrukningsvaror kan underlätta tillförlitlig och prisvärd användning av DMF-plattformen och kan ge medel för att kringgå biofouling frågan.
Biofouling är den huvudsakliga begränsningen av EWOD för biologiska tillämpningar22,23. Tidigare studier på DMF har identifierat två mekanismer som bidrar till biofouling, nämligen passiv adsorption på grund av hydrofoba interaktioner, och en elektrostatiskt driven adsorption manifesteras när ett elektriskt fält appliceras24. Resultaten i den aktuella artikeln är förenliga med denna teori eftersom det dokumenterades aktiveringsplattan återanvändbarhet minskar vid höga aktiveringsspänningar. En möjlig förklaring är att proteiner adsorb lätt på Fluoropolymer-belagda (Teflon-liknande) ytor och de aggregerar snabbare på fouled i jämförelse med orörda ytor24. Som en följd av detta är proteinrelaterade analyser på DMF svåra att kvantifiera och kan uppleva förlust av analyt, korskontaminering och minskad precision17. Det värsta scenariot är när en kritisk mängd protein adsorbs vilket gör enheten värdelös. För att minimera biofouling, olika metoder har undersökts från att minimera uppehållstiden för droppen på chipet, genom beläggningar23, till tillsatser (dvs. ytaktiva ämnen eller pluronsyra) i biomaterial-lastade droppar6,22. Därför en viktig aspekt av immunoassay analysen på EWOD är att välja anti-biofouling strategier som är kompatibla med det specifika protokollet till hands.
Den automatiserade DMF-plattformen är utformad för att utföra en enda smörgås ELISA-test per körning när du använder mikrolitervolymer för både reagenser och analyt. När det krävs finns konventionellsmörgås ELISA-satser baserade på förbelagda 96-brunns- eller 384-brunnsplattor som i kombination med hjälplaboratorieutrustning resulterar i högre genomströmning per körning. baserat på reagenser pris endast, den ungefärliga kostnaden per analys / brunn är 6,04 USD (580 USD/96) och 0,33 USD (2 × 580 USD/384) respektive. Detta gör de konventionella ELISA-metoderna idealiska för ett stort antal prover som bearbetas vanligtvis av utbildad teknisk personal vid centraliserade laboratorieanläggningar. På avlägsna platser visade dock ELISA:s detaljerade kostnadsanalys för miljöövervakning att när kapitalkostnaderna (dvs. laboratoriedriftskostnader, återkommande kostnader, provtransport, förnödenheter och personal) ingick det faktiska priset per ELISA var 60 USD var 34 USD för leveranser per urval25. Däremot är den föreslagna DMF-plattformen bärbar, kräver minsta utbildning för att fungera och med förbelagda pärlor kan ge prov-till-svar-analys på några minuter. Därför kan den presenterade tekniken användas till behovsplatser och komplettera analyser som annars finns i centraliserade laboratorier.
I avsnittet representativa resultat användes den automatiserade DMF-immunoassay-plattformen för direkt detektering av patogener för försvarsapplikation. Andra möjliga tillämpningar för DMF-plattformen omfattar men är inte begränsade till, biodiagnostisk, kontinuerlig övervakning och automatiserad provtagning. Potentiellt dmf kan påverka olika sektorer från point-of-care för personlig hälso-och sjukvård, samt kontrollerad miljöövervakning för skydd av patienter från luftburna sjukhus förvärvade infektion, till gröda övervakningssystem för jordbruk och livsmedelsproduktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill uppmärksamma våra kollegors bidrag från den mikrofluidiska forskargruppen för deras arbete med mekanisk design och systemintegration. Författarna vill tacka Dstl Porton Down för deras ovärderliga stöd och ekonomiska bidrag, till tidigare och pågående projekt som vidareutvecklar DMF-tekniken och dess tillämpningar.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |