Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Summary

Præsenteret her er en protokol for hele mount in situ RNA hybridisering analyse i zebrafisk og rør dannelse assay i patient-afledt induceret pluripotente stamceller-afledte endotelceller til at studere den rolle, endoglin i vaskulær dannelse.

Abstract

Vaskulær udvikling bestemmes af det sekventielle udtryk for specifikke gener, som kan undersøges ved at udføre in situ hybridiseringsanalyser i zebrafisk i forskellige udviklingsstadier. At undersøge den rolle, endoglin (eng) i fartøj dannelse under udviklingen af arvelige hemorrhagic telangiectasia (HHT), morpholino-medieret målrettet knockdown af eng i zebrafisk bruges til at studere sin tidsmæssige udtryk og tilknyttede funktioner. Her anvendes hel-mount in situ RNA hybridisering (WISH) til analyse af eng og dens nedstrømsgener i zebrafiskembryer. Også, rør dannelse assays udføres i HHT patient-afledt induceret pluripotente stamceller-differentierede endotelceller (iPSC-ECs; med eng mutationer). Et specifikt signal forstærkesystem ved hjælp af hele mængden In Situ Hybridization – WISH giver højere opløsning og lavere baggrundsresultater sammenlignet med traditionelle metoder. For at opnå et bedre signal justeres efterfikseringstiden til 30 min efter sondehybridering. Da fluorescensfarvning ikke er følsom i zebrafiskembryer, erstattes den med diaminobezidiin (DAB) farvning her. I denne protokol differentieres HHT-patientafledte iPSC-linjer, der indeholder en engmutation, til endotelceller. Efter belægning af en plade med kældermembranmatrix i 30 min ved 37 °C såes iPSC-ECs som monolag i brønde og holdes ved 37 °C i 3 timer. Derefter beregnes rørlængden og antallet af grene ved hjælp af mikroskopiske billeder. Således, med denne forbedrede WISH protokol, er det vist, at reduceret eng udtryk påvirker endotel stamfader dannelse i zebrafisk embryoner. Dette bekræftes yderligere af tube dannelsesanalyser ved hjælp af iPSC-ECs fra en patient med HHT. Disse analyser bekræfter den rolle, som eng i den tidlige vaskulære udvikling.

Introduction

Der er rapporteret en enkelt mutation på eng (CD105) hos patienter med HHT. Mutationen fører til øget spredning af EF og reduceret flowmedieret EF-forlængelse^1,2. Det er også tidligere blevet rapporteret, at ENG-mangel reducerer endotel markører udtryk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i zebrafisk³. Endoglin, hovedsageligt udtrykt i endotelceller, er en transmembrane glycoprotein og fungerer som en co-receptor for at omdanne vækstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det dirigerer BMP9 bindende på celleoverfladen til at regulere downstream genet, herunder Id1 udtryk, at fremkalde stamcelle differentiering mod ECs⁴. Således eng genet spiller vigtige roller i vaskulogenese og human vaskulær sygdom^5,6. Vi har tidligere undersøgt virkningerne af endoglin knockdown på fartøjsdannelse i zebrafiskembryer, efterfulgt af analyse af iPSCs-afledte ECs erhvervet fra en HHT-patient, der bærer en eng mutation⁷. Denne protokol viser virkningerne af ENG-mangel på endotelprogenitormarkør udtryk og rørdannelse, som er en kvantificerbar metode til måling af in vitro angiogenese.

For at studere eng rumlige og tidsmæssige udtryk, ER WISH ansat til at opdage genekspression in vivo⁸. In situ hybridisering (ISH) er en metode til at anvende mærkede sonder med komplementsekvenser af målnukleinsyrer (DNA eller mRNA) til at detektere og visualisere målnukleinsyre hybrider i en fast prøve. Processen forstærker genekspressionssignaler in vivo og bruges til at detektere ekspression af gener ved mikroskopi. WISH har været meget udbredt i forskellige model dyr, især i zebrafisk⁹. Det bruges også til at erhverve følgende data: 1) gen rumlige / tidsmæssige udtryk mønstre, som giver oplysninger om genfunktion og klassificering; og 2) specifikt udtrykt genmarkører, der anvendes i høj-throughput stof eller mutant screening¹⁰.

Kromogene sonder nedbrydes let med traditionel kromosom in situ hybridisering (CISH), hvilket resulterer i høj baggrundsstøj og uspecifikke signaler^11,12. WISH-metoden bruger to uafhængige dobbelte Z-sonder, som er designet til at hybridisere for at målrette RNA-sekvenser. Hver sonde indeholder en 18-25 sekvens som supplement til målet RNA og en 14 base hale sekvens (konceptualiseret som Z). Målsonderne anvendes i et par (dobbelt Z). De to halesekvenser udgør tilsammen et 28 base hybridiseringssted for forforstærkeren, som indeholder 20 bindingssteder for forstærkeren. Forstærkeren indeholder til gengæld 20 bindingssteder for etiketsonden og kan teoretisk give op til 8.000 etiketter for hver mål-RNA-sekvens.

Denne avancerede teknologi letter samtidig signalforstærkning og baggrundsundertrykkelse for at opnå visualisering med et enkelt molekyle, samtidig med at vævsmorfologien^{bevares 13}. Yderligere ændring af WISH metoder er baseret på tidligere forskning¹⁴, herunder ekstra fiksering og DAB farvning. Forudsat her er en forbedret WISH protokol, der kan arbejde, selv om målet RNA er delvist reduceret eller nedbrudt. Fordele omfatter, at det kan udfyldes i 24 timer uden RNase-fri betingelser. Signaler kan også registreres samtidigt gennem flere kanaler fra flere mål, og resultaterne er konsistente og kompatible med resultater fra forskellige automatiseringsplatforme med høj overførselshastighed.

Resultater fra dyremodeller afspejler ikke det samme fænomen, der forekommer hos mennesker. ENG indeholder to par konserverede cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i forældreløse områder. For yderligere at undersøge eng’s rolle hos HHT-patienter er der udført tubedannelsesanalyser med iPSCs afledt af HHT-patienter i celler uden/med eng mutationer (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Efter Kubota et al. første rapporterede røret dannelse eksperiment¹⁶, analysen er blevet udviklet på flere måder. Det har været brugt til at identificere angiogene eller antiangiogenic faktorer, definere signalering veje i angiogenese, og identificere gener, der regulerer angiogenese¹⁷.

Før tilgængeligheden af patient-afledte iPSC-ECs, forskere, der primært anvendes europæiske selskaber til at studere angiogense¹⁶. Men for endotelceller er det en teknisk udfordring at transduce eksogene gener med en virus, på grund af det begrænsede passage nummer, som ECs kan gennemgå. Dette skyldes, at der næppe er nok cellulære materiale, der skal indsamles fra menneskelige fartøjer enten fra kirurgi eller matchede godkendte donorer. Med opfindelsen af iPSC generation teknik af Shinya Yamanaka, menneskelige ECs stammer fra iPSCs kan anvendes pålideligt i in vitro eksperimenter, som rapporteret tidligere¹⁸.

Brug af viralt transkucerede ECs med et begrænset antal og passager kan være tilstrækkeligt til signaling undersøgelser, men for funktionelle undersøgelser, er det bedre at generere mutant pluripotente stamcellelinjer, (enten iPSCs eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCs), derefter differentiere dem i ECs for angiogenese undersøgelser, der bruger dannelse rør assays¹⁹. Rørdannelse kan bruges til at vurdere funktionen af endotelceller, der bærer mutationer. Denne protokol beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plade, som er en nem, omkostningseffektiv og reproducerbar metode.

Protokollen nedenfor giver en pålidelig og systemisk metode til at studere de specifikke geners rolle i vaskulær dannelse sammen med oplysninger om in vivo-ekspressionsmønster og in vitro-funktionel kvantificering til modellering af sygdomme hos mennesker.

Protocol

Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den forskningsetiske komité på Zhejiang University school of medicine. 1. Hel-mount in situ hybridisering Zebrafisk linje opdræt og reproduktion Fodre og opdrætte alle voksne zebrafisk ved 26-28 °C i et recirkulerende akvakultursystem med 14 timers lys/10 h mørk cyklus for hver dag. Brug AB (vildtype) zebrafisklinjer til følgende procedurer. Sæt et lag af småsten i bunden af avlskassen som et krisecenter for æg….

Representative Results

Hele mount in situ hybridisering er baseret på et princip svarende til fluorescens resonans energioverførsel. Det er designet til at forbedre både følsomhed og specificitet i zebrafisk ISH samt forstærke målspecifikke signaler uden at påvirke baggrundssignalet. I 24 hk zebrafisk embryoner, er endoglin stærkt udtrykt i den bageste kardinal vene (PCV), intersegmental fartøjer (ISVs), og blod øer<sup class="xref"…

Discussion

Denne protokol anvendte en forbedret hel-mount in situ RNA analyseplatform for zebrafisk og rør dannelse assays på iPSC-ECs stammer fra en HHT patient. Den traditionelle ISH-metode kræver en længere eksperimentel cyklus med ekstra eksperimentelle trin. Protokollen har nogle vigtige forbedringer, brugen af uafhængige dobbelt Z sonder og iPSCs stammer fra en patient med HHT, der blev anvendt i WISH assays og rør dannelse, henholdsvis. Disse forbedringer er afgørende for at øge detektionsfølsomheden sammenlignet me…

Materials

µ-Slide Angiogenesis	ibidi	81506	Cell culture
Amp 1-FL	ACD	SDS 320852	Signal Amplification
Amp 2-FL	ACD	SDS 320853	Signal Amplification
Amp 3-FL	ACD	SDS 320854	Signal Amplification
Amp 4 Alt B-FL	ACD	SDS 320856	Signal Amplification
Corning Matrigel Matrix	Corning	354234	Growth factor-reduced Matrigel
DEPC	Sigma	D5758	RNAase-free Water
Human Endothelial-SFM	Thermofisher	11111044	Cell culture
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed embryos
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Fixed Cells
Protease K	ACD	SDS 322337	Digest tissue
Sodium Citrate	Sigma	6132-04-3	SSCT solution: Wash Buffer
VEGF-165	STEMCELL Technologies	78073	Growth factor