Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/60498
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 1, 3, 1,2
1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

عرض هنا هو بروتوكول لكامل جبل في الموقع الحمض النووي الريبي تحليل التهجين في حمار وحشي وأنبوب تشكيل القول في المريض المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الخلايا الانبوبية لدراسة دور endoglin في تكوين الأوعية الدموية.

Abstract

يتم تحديد تطور الأوعية الدموية من خلال التعبير التسلسلي لجينات محددة ، والتي يمكن دراستها من خلال إجراء معينات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي خلال مراحل النمو المختلفة. للتحقيق في دور endoglin (eng) في تكوين الأوعية أثناء تطوير telangiectasia النزفية الوراثية (HHT) ، يتم استخدام الضربة القاضية المستهدفة التي تم التوصل إليها بوساطة مورفولينو من المهندس في سمك الحمار الوحشي لدراسة التعبير الزمني والوظائف المرتبطة بها. هنا، يتم استخدام كامل جبل في الموقع التهجين الحمض النووي الريبي (ويش) لتحليل المهندس وجيناته المصب في أجنة حمار وحشي. أيضا، يتم تنفيذ المقالات تشكيل أنبوب في HHT المستمدة من المرضى المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية الخلايا الانبوبية المتمايزة (iPSC-ECs؛ مع الطفرات المهندس). نظام تضخيم إشارة محددة باستخدام كامل المبلغ في التهجين في الموقع - يوفر WISH دقة أعلى ونتائج خلفية أقل مقارنة بالطرق التقليدية. للحصول على إشارة أفضل، يتم ضبط وقت ما بعد التثبيت إلى 30 دقيقة بعد التهجين التحقيق. لأن تلطيخ الفلورليسين ليس حساسًا في أجنة الحمار الوحشي ، يتم استبداله بتلطيخ diaminobezidine (DAB) هنا. في هذا البروتوكول، يتم تمييز خطوط IPSC المشتقة من المرضى HHT التي تحتوي على طفرة في الهندسة في الخلايا الانهوائية. بعد طلاء لوحة مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، يتم زرع iPSC-ECs كطبقة أحادية في الآبار وتبقى عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. ثم يتم حساب طول الأنبوب وعدد الفروع باستخدام الصور المجهرية. وهكذا، مع هذا البروتوكول ويش المحسنة، فمن مبين أن انخفاض التعبير المهندس يؤثر على تكوين السلف النهويلي في أجنة حمار وحشي. وهذا ما تؤكده كذلك المقالات التي تستخدم تشكيل الأنبوب باستخدام iPSC-ECs المشتقة من مريض مصاب بHHT. هذه المقالات تؤكد دور المهندس في التنمية الوعائية في وقت مبكر.

Introduction

وقد تم الإبلاغ عن طفرة واحدة على المهندس (CD105) في المرضى الذين يعانون من HHT. الطفرة يؤدي إلى زيادة انتشار المفوضية الأوروبية والحد من التدفق بوساطة EC الإطالة1,2. كما تم الإبلاغ سابقا أن نقص ENG يقلل من التعبير علامات الانثيلية (أي kdrl، cdh5، hey2)في حمار وحشي3. إندوغلين، وأعرب أساسا في الخلايا البطانة ، هو بروتين الجليكوبروتين عبر الغشاء ويعمل كمستقبلات المشاركة لتحويل عامل النمو α (TGF-α) أفراد الأسرة. وهو يوجه BMP9 ملزمة على سطح الخلية لتنظيم الجين المصب، بما في ذلك التعبير Id1، للحث على تمايز الخلايا الجذعية نحو ECs4. وهكذا، فإن الجين المهندس يلعب أدوارا هامة في تكوين الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية البشرية5,6. لقد درسنا في السابق آثار الضربة القاضية endoglin على تكوين السفينة في أجنة حمار وحشي ، تليها تحليل ECs المشتقة من iPSCs المكتسبة من مريض HHT تحمل طفرة المهندس 7. يوضح هذا البروتوكول آثار نقص ENG على تعبير علامة السلف البطاني وتكوين الأنبوب ، وهو طريقة قابلة للقياس الكمي للقياس في تولد الأوعية في المختبر.

لدراسة التعبير المكانية والزمنية ، يتم توظيف WISH للكشف عن التعبير الجيني في الجسم الحي8. في التهجين في الموقع (ISH) هو وسيلة لاستخدام المسابير المسمى مع تسلسل تكملة من الأحماض النووية المستهدفة (الحمض النووي أو مرنا) للكشف عن وتصور الهجينة الحمض النووي الهدف في عينة ثابتة. تعمل العملية على تضخيم إشارات التعبير الجيني في الجسم الحي وتستخدم للكشف عن تعبير الجينات عن طريق المجهر. وقد تم استخدام ويش على نطاق واسع في مختلف الحيوانات نموذج, خاصة في حمار وحشي9. كما أنها تستخدم للحصول على البيانات التالية: 1) أنماط التعبير المكاني/الزماني الجينية، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني و 2) أعرب على وجه التحديد علامات الجينات التي تستخدم في المخدرات عالية الإنتاجية أو الكشف متحولة10.

يتم تدهور المجسات الكروموجينية بسهولة مع الكروموسوم التقليدي في التهجين في الموقع (CISH) ، مما يؤدي إلى ضوضاء خلفية عالية وإشارات غير محددة11،12. تستخدم طريقة WISH مسبارين مستقلين مزدوجين من Z، تم تصميمهما للتهجين لاستهداف تسلسلات الحمض النووي الريبي. يحتوي كل مسبار على تسلسل 18-25 مكملًا للRNA المستهدف وتسلسل ذيل أساسي 14 (تصور يُنظر إليه على أنه Z). يتم استخدام المسابير المستهدفة في زوج (Z مزدوج). تشكل تسلسلات الذيل معاً موقع تهجين أساسي 28 للمكبر اتّفاً، والذي يحتوي على 20 موقع ربط للمكبر للصوت. مكبر للصوت، بدوره، يحتوي على 20 مواقع ملزمة للتحقيق التسمية ويمكن أن تسفر نظريا ما يصل إلى 8000 تسميات لكل تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف.

تسهل هذه التقنية المتقدمة تضخيم الإشارة في وقت واحد وقمع الخلفية لتحقيق التصور أحادي الجزيء مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة13. ويستند مزيد من التعديل من أساليب WISH على البحوث السابقة14، بما في ذلك تثبيت اضافية وتلطيخ DAB. المنصوص عليها هنا هو بروتوكول ويش المحسنة التي يمكن أن تعمل حتى لو انخفض جزئيا الجيش الملكي النيبالي الهدف أو المتدهورة. وتشمل المزايا أنه يمكن إكماله في 24 ساعة دون ظروف خالية من RNase. يمكن أيضًا اكتشاف الإشارات في وقت واحد من خلال قنوات متعددة من أهداف متعددة ، وتكون النتائج متسقة ومتوافقة مع النتائج من منصات أتمتة عالية الإنتاجية مختلفة.

النتائج من النماذج الحيوانية لا تعكس الضرورية نفس الظاهرة التي تحدث في البشر. ENG يحتوي على اثنين من أزواج من السيستينات المحفوظة، C30-C207 و C53-C182، والتي تشكل جسور الكبريتيد في المناطق اليتيمة. لمزيد من الدراسة دور المهندس في المرضى HHT، وقد أجريت المقالات تشكيل أنبوب مع iPSCs المستمدة من المرضى HHT في خلايا دون / مع الطفرات المهندس (Cys30Arg، C30R)15. بعد أن أبلغ كوبوتا وآخرون لأول مرة عن تجربة تشكيل الأنبوب16، تم تطوير السب في عدة طرق. وقد استخدم لتحديد العوامل الوعائية أو المضادة للأنجيوجيوجينية، وتحديد مسارات الإشارات في تولد الأوعية، وتحديد الجينات التي تنظم تولد الأوعية17.

قبل توافر iPSC-ECs المشتقة من المريض، استخدم الباحثون في المقام الأول ECs المستزرعة لدراسة الانجيوجينز16. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا الداخلية ، فإنه يشكل تحديًا تقنيًا للجينات الخارجية العابرة مع الفيروس ، بسبب عدد المرور المحدود الذي يمكن أن تخضع له ECs. وذلك لأنه لا يكاد يكون هناك ما يكفي من المواد الخلوية التي يمكن جمعها من الأوعية البشرية إما من الجراحة أو المتبرعين المعتمدين المتطابقة. مع اختراع تقنية توليد iPSC من قبل شينيا ياماناكا ، يمكن استخدام ECs البشرية المشتقة من iPSCs بشكل موثوق في التجارب المختبرية ، كما ورد سابقًا18.

باستخدام ECs المستحثة فيروسيا مع أعداد محدودة والممرات قد تكون كافية لدراسات الإشارات, ولكن بالنسبة للدراسات الوظيفية, فمن الأفضل لتوليد خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات متحولة, (إما iPSCs أو كريسبر / Cas9-المستهدفة hESCs), ثم تمييزها في ECs لدراسات تولد الأوعية التي تستخدم تشكيل أنبوب المقالات19. يمكن استخدام تشكيل الأنبوب لتقييم وظيفة الخلايا الانبوبية التي تحمل طفرات. يصف هذا البروتوكول أيضًا تكوين الأنبوب على لوحة تولد الأوعية الشرائح، وهي طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.

يوفر البروتوكول أدناه طريقة موثوقة ومنهجية لدراسة دور جينات محددة في تكوين الأوعية الدموية ، إلى جانب تفاصيل في نمط التعبير الحي وفي المختبر الكمي الوظيفي لنمذجة الأمراض البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت لجنة اخلاقيات الابحاث بكلية الطب بجامعة تشجيانغ على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة .

1. كله جبل في التهجين الموقع

  1. تربية خطوط الحمار الوحشي والتكاثر
    1. تغذية ورفع جميع سمك الحمار الوحشي البالغ في 26-28 درجة مئوية في نظام تربية الأحياء المائية إعادة تدوير مع 14 ساعة ضوء / 10 ساعة دورة مظلمة لكل يوم. استخدم خطوط سمك الحمار الوحشي AB (البرية) للإجراءات التالية.
    2. وضع طبقة من الحصى في الجزء السفلي من مربع تربية كمأوى للبيض. مجموعة الأسماك الأبوية في نسبة 2:1 (أي اثنين من الإناث وواحد من الذكور) في كل مربع. اسمحوا الأسماك الإناث تفرخ لمدة يوم واحد. في نهاية التفريخ، قم بإزالة السمك ة الأم على الفور لمنعهم من تناول البيض.
    3. حقن 2 نانوغرام من مورومولينوس و 500 pg من مرنا في الأجنة مرحلة خلية واحدة باستخدام نظام حقن فيمتو جت تحت المجهر (تسلسل endoglin-MOs: 5'-GATGAACTACAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair التحكم MOs تسلسل: 5'-AAACAGACCACATCCTCTCTCCTC-3').
    4. احتضان الزيجوت في مياه البحر الحمضية في 27 درجة مئوية لحوالي 48 ساعة.
  2. جمع وتثبيت أجنة سمك الحمار الوحشي
    1. استخدام ماصة نقل البلاستيك لجمع 20-40 أجنة حمار وحشي من المياه نظام تعميم (درجة الحموضة = 5.0) في أنبوب 1.5 مل عندما يتم dechorionated وتصل إلى فترة محددة من التنمية. أضف 1 مل من محلول PFA معد حديثًا بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: وتستند الفترة التي يتم فيها اختيار الجنين على الغرض من التجربة. ويبين الجدول 1 وقت التثبيت اللازم لمختلف الفترات الجنينية.
    2. إزالة محلول التثبيت، وغسل الأجنة مع محلول الفوسفات المخزنة مؤقتا مع Tween-20 (PBST، تمييع 1 مل من Tween إلى 1000 مل من محلول PBS) 3x لمدة 5 دقيقة لكل منها في RT.
    3. تجفيف الأجنة من خلال الحضانة في سلسلة من 25٪ 50٪ و 75٪ الميثانول (المخفف في PBST) لمدة 5 دقيقة لكل منهما. نقل الأجنة إلى الميثانول 100٪ لمدة 5 دقيقة واستبدالها بالميثانول الطازج. تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو لفترة أطول.
  3. الترطيب والهضم
    1. ترطيب الأجنة التي تم الحفاظ عليها في الميثانول 100٪ باستخدام منخل مع شبكة النايلون في الجزء السفلي لغسل الأجنة بالتتابع في آبار 12 لوحات البئر مع سلسلة من 75٪، 50٪، و الميثانول 25٪ (المخفف في PBST) لمدة 5 دقيقة لكل منهما. اغسل الأجنة بـ PBST 3x لمدة 5 دقيقة لكل منها في RT.
    2. أضف 50 ميكرولتر من بروتينات K (10 ملغ/مل) إلى الأنبوب مع الأجنة واتبع وقت الهضم في الجدول 2 في RT.
    3. إزالة بروتينات K وغسل الأجنة مع PBST 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما في RT.
  4. التهجين التحقيق والتثبيت بعد
    1. وضع المسابير المصممة وفقا لتسلسل mRNA كل الجين في نظام الهجينزاتين 40 درجة مئوية حتى يذوب المترسب، التي ينبغي أن تأخذ ~ 10 دقيقة. مزيج المسابير الهدف من على سبيل المثال (XM_007116.7) واثنين من الجينات الهامة إضافية تنطوي في تكوين السلف النبوبي mesoderm في وقت مبكر (هنا، aplnr [NM_001075105.1] وnrp1a [NM_001040326.1]) في أنبوب 1.5 مل في نسبة 50:1:1.
    2. أضف 50-100 ميكرولتر من المسابير المستهدفة المختلطة في كل أنبوب مع الأجنة ، ثم احتضن بين عشية وضحاها عند 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب أن تكون المسابير المختلطة مسبقًا دافئة مسبقًا إلى 40 درجة مئوية وتبريدها إلى RT قبل الاستخدام.
    3. إعداد محلول سترات الصوديوم المالح ة 0.2x مع Tween-20 (SSCT): حل 175.3 غرام من NaCl و 88 غرام من سترات الصوديوم في 1 لتر من dH2O للحصول على محلول SSC 20x. ثم، تمييع الحل 1:100 في dH2O للحصول على حل 0.2 × SSCT. تمييع Tween-20 1:1000 في حل SSCT 0.2x.
    4. نقل المسابير المعاد تدويرها إلى أنبوب جديد. اغسل الأجنة في محلول SSCT 0.2x 3x لمدة 15 دقيقة لكل منها في RT. يمكن إعادة استخدام المسابير المعاد تدويرها 5x-10x.
    5. استخدام 4٪ بارافورمايدهيد (PFA) لإصلاح الأجنة لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الأجنة في محلول SSCT 0.2x 3x لمدة 15 دقيقة لكل منها في RT.
      ملاحظة: يشير عمل Gross-Thebing وآخرون إلى فترة تثبيت بعد 10 دقيقة14، ولكن يجب تعديل المبلغ الفعلي وفقًا لذلك. هنا ، اختبرنا 10 دقيقة بعد التثبيت 3x ، وتتأثر حساسية Dying بشكل كبير. بعد التحقيق، تأكد من أن 0.5-1.0 ساعة من التثبيت هو الشرط الأمثل (فترة تثبيت أقصر لا يمكن أن تنتج إشارة واضحة من الجيش الملكي النيبالي الهدف، والتمديد المناسب لوقت التثبيت يساعد على تقوية الإشارة وتوفير أقل الضوضاء الخلفية).
  5. مكبر للصوت متتابعة وتسمية التهجين التحقيق
    1. إزالة محلول SSCT واستبدال مع 50 ميكرولتر من أمبير 1. السماح للأجنة لتسوية في أمبير 1 في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، يغسل الأجنة في محلول SSCT 0.2x 3x لمدة 15 دقيقة لكل منها في RT.
    2. إزالة محلول SSCT وإضافة 50 ميكرولتر من أمبير 2. السماح للأجنة لتسوية في 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، يغسل الأجنة في محلول SSCT 0.2x 3x لمدة 15 دقيقة لكل منها في RT.
    3. إزالة محلول SSCT، إضافة 50 ميكرولتر من أمبير 3 واضغط على أنبوب أقل ما يقال. ثم، احتضان الأجنة في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل الأجنة في محلول SSCT 0.2x 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
    4. قم بإزالة محلول SSCT، وأضف 50 ميكرولتر من Amp 4 dropwise، واضغط بعناية على الأنبوب. ثم، احتضان الأجنة في 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل الأجنة في 0.2x SSCT 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
  6. التلطيخ المضاد والمجهر
    1. إزالة محلول SSCT وإضافة 50 ميكرولتر من DAPI إلى كل أنبوب. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 4 °C.
    2. غسل الأجنة مع PBST وإعدادها للتصوير باستخدام 1٪ منخفضة نقطة انصهار agarose (LMP) حل (1 غرام من LMP مذابة في 100 مل من dH2O) في طبق بيتري مليئة PBST.
    3. استخدام مجموعة الركيزة DAB peroxidase لوصمة عار العينة. إضافة الكواشف اللون A، B، و C (50 ميكرولتر لكل منهما) إلى 1 مل من الماء المقطر وتخلط جيدا للحصول على السائل DAB العمل كاملة. يُضاف السائل إلى العينة ويغطّي لمدة 10 دقيقة.
    4. غسل العينة جيدا مع PBST بعد تلطيخ.
    5. استخدام المجهر البصري مع وظيفة التصوير الفوتوغرافي لتصوير العينات.
      ملاحظة: إذا أخذ الصور في وقت لاحق، يجب أن تكون ملفوفة أنابيب في رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجة مئوية.

2. أنبوب تشكيل القول

ملاحظة: تم تمييز الـ eng mutant و wildtype ECs (التحكم) عن iPSCs المشتقة من مريض HHT (هنا ، مريضة 62 عاما مع epistaxis المتكررة منذ 22 عاما, نزيف الجهاز الهضمي, تشوهات الشرايين الرئوية، تحمل طفرة انكلترا سوء في موقف c.88T > C من exon 2) ومتبرع صحي (دون طفرة المهندس), التي قدمتها مستشفى كلية الطب في جامعة بكين بموافقة من لجنة أخلاقيات البحوث الكلية.

  1. التحكم وثقافات خلايا HHT iPSC
    1. إضافة حجم معين من مصفوفة غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، Matrigel) إلى لوحة ثقافة الخلية 6 جيدا لتغطية الجزء السفلي من البئر واحتضان لوحات لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: عند استخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخزنة لأول مرة عند -20 درجة مئوية، احضن على الجليد أو في ثلاجة خالية من الصقيع 4 درجات مئوية حتى يذوب. ثم، تمييع في 1:100 في DMEM/F12، ثم توزيع المخفف في 200 ميكرولتر أنابيب تحتوي على 100 ميكرولتر لكل منهما. تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية وتجنب التجميد المتكرر والذوبان. عند إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف، لا تخلق فقاعات. بعد إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف، يهز لوحة 6 جيدا بلطف باليد بحيث يغطي بالتساوي الجزء السفلي.
    2. بعد طلاء لوحة، وإزالة محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي المستخدمة من الآبار. ثم، إضافة 2 مل من mTeSR1 المتوسطة في كل بئر، ولوحة iPSCs حصادها من الممر الأخير في ما يقرب من 1 × 106 لكل بئر.
  2. توليد وتوسيع الـ ECs من مراكز الـ iPS
    1. بعد ما يقرب من 4 أيام من ثقافة iPSC، تبادل المتوسطة الثقافة مع المتوسط BEL تستكمل مع activin A (25 نانوغرام / مل)، BMP4 (30 نانوغرام / مل)، VEGF165 (50 نانوغرام / مل)، وCHIR99021 (1.5 ميكرومتر). تنمو الخلايا لمدة 3 أيام لتوليد خلايا mesoderm.
    2. استبدل الوسط الموصوف في الخطوة 2.2.1 بوسيط BEL المكمل بـ VEGF (50 نانوغرام/مل) وSB431542 (10 ميكرومتر) لمدة 4 أيام لتوسيع الأوعية الدموية ECs. علاج الخلايا مع نفس الوسط والثقافة لمدة 3-4 أيام أخرى.
    3. استخدام CD31-dynabeads لتنقية ECs الأوعية الدموية ناضجة: الرجوع إلى التعليمات في طقم CD31-dynabeads، الذي يربط الجسم المضاد CD31 الإنسان مع الخرز المغناطيسي للجمع بين جزيئات CD31 أعرب عن على ECs، ثم جمع الخلايا CD31 إيجابية بواسطة العازلة elution. الحفاظ على وتوسيع ECs النقية في EC-SFM المتوسطة التي تحتوي على VEGF165 (30 نانوغرام / مل) ، bFGF (30 نانوغرام / مل) ، وFBS (1٪).
  3. طلاء الخلايا الانبهية على لوحات المغلفة Matrigel والمجهر
    1. إضافة 10 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل بئر لمعطف لوحات تولد الأوعية (انظر جدول المواد)واحتضان في 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. حصاد الخلايا الانبوبية بعد التحقق من علامات الانهوثيلية CD31 وVE-cadherin مع تلطيخ الفلور المناعة وإعادة تعليقها في نمو الانهوثيلية المتوسطة 2 عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية (2 × 105 خلايا /مل) جيدًا على المصفوفة الصلبة واحتضان الخلايا لمدة 3-5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: قبل تجربة تشكيل الأنبوب ، يجب فحص علامات الانهوثيللية للتأكد من النمط الظاهري السليم للخلايا الانبوبية الوظيفية. 1 × 104 خلية لكل بئر هو رقم مثالي لتشكيل أنبوب. خلايا كثيرة جدا أو قليلة جدا لا تؤدي إلى تشكيل أنبوب. إضافة الخلايا من جانب الطبق وعدم لمس مصفوفة غشاء الطابق السفلي. استخدم المجهر الخفيف في حقل التكبير العالي للتحقق من الخلايا والتقاط الصور.
  4. النتائج الكمية لتكوين الأنبوب
    1. لاحظ النتائج باستخدام مجهر بدقة عالية وخذ صورًا لما لا يقل عن 10 مناطق لكل مجموعة للحصول على إحصاءات بيانات موثوقة.
    2. فحص تشكيل أنبوب الانبوبي: تقدير مدى تشكيل أنبوب من خلال فحص طول الأنبوب العام، رقم الأنبوب، ونقاط الفرع. تقييم وعدد عدد وطول الفروع باستخدام برنامج ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويستند كله جبل في الموقع التهجين على مبدأ مماثل لنقل الطاقة صدى الفلورسينس. وهي مصممة لتحسين الحساسية والتحديد في العش الحمار الوحشي وكذلك تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف دون التأثير على إشارة الخلفية.

في 24 أجنة حمار وحشي hpf, وأعرب عن endoglin للغاية في الوريد الكاردينال الخلفي (PCV), الأوعية بين القطاعات (ISVs), وجزر الدم3. من الصعب التحكم في وقت تلطيخ في التهجين التقليدي للكروموجيني ة في الموقع (CISH) ، مع وجود إشارات غير إيجابية في بعض المناطق ، مثل كيس الصفار(الشكل 1A). للتحقيق في دور المهندس في التنمية المبكرة الوعائية، تم استخدام علامة بطانة الدممية(aplnra)وكذلك علامة ذرية بطانة أخرى(nrp1a)لفحص أي نوع من البطانة تأثر بإسكات المهندس 20. كان التعبير عن اللابرار وnrp1a ضعيفًا في 24 جنينًا من أجنة hpf. بالمقارنة مع CISH ، تم إثبات الإشارة الضعيفة من الجينات اثنين بوضوح في منطقة الذيل بعد الضربة القاضية في ENG في WISH(الشكل 1B). تسبب الضربة القاضية لـ eng RNA في تقليل التعبير عن نوعين من جينات علامات الخلايا النُفوطية في نموذج الحيوان HHT.

وقبل إجراء تجارب على مراكز الـ iPSCs المتباينة، تم تحديد الخلايا وتأكيدها كمراكز ECS. شكلي، ظهرت كشكل حصوى. التعبير عن الخلايا الانبائية على سطح علامات الجزيئية CD31، CD146، VE-cadherin، وvWF تم تأكيد مع IF تلطيخ21. بعد العزلة المغناطيسية باستخدام CD31 ، تم إجراء الشبهة الوظيفية على النحو المبين أدناه.

هنا ، تم إجراء القول تشكيل أنبوب باستخدام متحولة المهندس والتحكم iPSC المستمدة من الخلايا الانبوبية. تم إجراء التحليل الإحصائي استنادًا إلى عدد الأنابيب وفروعها وأطوالها. كما تم تقديم معلمة جديدة على أساس العمل السابق3، نقاط تولد الأوعية ، من أجل عكس تكوين أنبوب الخلايا الانبوبية. في نهاية المطاف ، وجد أن خلايا الانهوثيلية المتحولة التي شكلت فروعًا أقل من خلايا النُهُب المنقّة ، وأن الفروع في خلايا النُهج المُنَوَرة في الخلايا الأنثيلية التي تُدَفَن بزيادة كبيرة بعد التحفيز مع عامل نمو النُفوع الوعائي (VEGF)(الشكل 2A، B). الطفرة في eng أدى إلى تكوين أنبوب الأوعية المعيبة.

Figure 1
الشكل 1: خفضت الضربة القاضية Endoglin التعبير عن علامات بطانة. (أ)تم إجراء CISH و WISH لتحديد تعبير الإندوغلين في 24 أجنة hpf (n > 30). يمثل المربع الأحمر المنطقة الموسعة. أشرطة مقياس = 200 ميكرون .(B) aplnra وnrp1a التعبير من قبل WISH في 24 أجنة حمار وحشي hpf من مجموعة التحكم MO وeng-MO. يشير السهم الأحمر إلى المناطق التي انخفض فيها التعبير عن هذه الجينات بشكل كبير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشكيل أنبوب من تحول المهندس والتحكم iPSC-ECs. (أ)تشكيل أنبوب من قبل المجموعات الأربع، بما في ذلك مجموعة التحكم، والتحكم + VEGF (التحكم الخلايا الانبوبية + 30 نانوغرام/ مل VEGF)، ومتحولة المهندس (انكلترا الخلايا الانبوبية متحولة) المجموعة، والمهندس متحولة + VEGF(انكلترا الخلايا الانبوبية متحولة + 30 نانوغرام / مل VEGF) المجموعة. تم تقييم تشكيل الأنبوب وتصويره بعد 3 ح. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر.(B)تظهر النتائج الكمية لتشكيل الأنبوب. في المنطقة المغطاة تم حساب عدد الفروع وطول الأنابيب بواسطة صور J. تمثل أشرطة الخطأ SD من متوسط القيم من ثلاث تجارب مستقلة. اعتبرت قيمة P ذات دلالة إحصائية عندما *p < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفترة الجنينية وقت التثبيت
4 خلايا إلى 8 hpf 4 ساعات
8 hpf إلى 24 hpf ساعة واحدة
24 hpf إلى 4 dpf 30 دقيقة

الجدول 1: وقت التثبيت المطلوب لمختلف المراحل الجنينية.

الفترة الجنينية وقت الهضم
4 خلايا إلى 8 hpf دقيقتان
8 hpf إلى 24 hpf 5 دقائق
24 hpf إلى 4 dpf 10 دقائق

الجدول 2: وقت الهضم المطلوب لمختلف المراحل الجنينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول تطبيق تحسين كامل جبل في الموقع RNA منصة تحليل لحمار وحشي وأنابيب تشكيل المقالات على iPSC-ECs المستمدة من مريض HHT. تتطلب طريقة ISH التقليدية دورة تجريبية أطول مع خطوات تجريبية إضافية. البروتوكول لديه بعض التحسينات الهامة، واستخدام مستقلة مزدوجة Z المسابير وiPSCs المستمدة من المريض مع HHT التي تم تطبيقها في المقالات ويش وتشكيل أنبوب، على التوالي. هذه التحسينات حاسمة لتعزيز حساسية الكشف مقارنة مع ما لوحظ مع ISH التقليدية. تسمح المسابير المصممة بشكل فريد وتضخيم الإشارة المستهدفة بالكشف عن النصوص التي نادراً ما يتم التعبير عنها(aplnra هو جين ضعيف التعبير عنه في 24 جنينًا من أجنة hpf). تعديل واحد هو التثبيت الإضافي بعد التهجين التحقيق. يمكن أن يعزز التثبيت الإضافي مزيجًا من المسابير والنصوص. يتم تطبيق تلطيخ DAB أيضًا بدلاً من تلطيخ الفلورستان ، لأنه وجد أنه كان من الصعب إجراء تلطيخ الفلورسيز في بعض الجينات منخفضة الوفرة. ثم، تم استخدام iPSCs لمقالات تولد الأوعية، مما يزيد من أهمية وأهمية العيادة لهذا العمل. يتطلب إنشاء مراكز الـ iPSCs شروطًا ثقافية صارمة ويمثل قيدًا في البروتوكول.

ولا بد من تسليط الضوء على بعض الخطوات الحاسمة. في تحليل WISH ، يجب اتباع وقت هضم أجنة الحمار الوحشي وفقًا للنص بدقة. وقت الهضم الأقصر لا يمكن أن يضمن أن التحقيق يجمع مع النصوص بنجاح. وعلى النقيض من ذلك، فإن تمديد وقت الهضم سيدمر سلامة الأجنة. في تجارب تشكيل الأنبوب ، يجب التحكم في توقيت التصوير بشكل جيد. عموما، سوف تصبح الخلايا الانبوبية أنابيب في غضون 12 ساعة ولكن الهيكل أنبوبي يميل إلى التفكك بعد 24 ساعة. رقم الخلية مهم أيضًا لتشكيل الأنبوب ، حيث أن كثافة الخلية عالية جدًا أو منخفضة جدًا يمكن أن تؤدي إلى فشل تشكيل الأنبوب. إذا كان من الصعب حث الخلايا الانبوبية لتشكيل أنابيب، فمن المفيد أن تشمل إضافة عوامل النمو مثل VEGF إلى الوسط الثقافة كتحكم إيجابي لاختبار قدرة ECs لتشكيل هياكل أنبوبي.

وخلاصة القول إن طريقة ويش المحسنة اعتُبرت تقنية مفيدة لسير العمل المختبري. في الآونة الأخيرة ، بدأت مجموعتنا البحثية في اختبار هذا الفحص في العينات السريرية. بالنظر إلى حساسية أعلى والكشف أكثر كفاءة مما لوحظ في الأساليب التقليدية ، فإن طريقة WISH المحسنة هذه تحمل وعدًا كبيرًا لتطوير وتنفيذ التشخيص الجزيئي القائم على الحمض النووي الريبي22.

أداء قياس تشكيل أنبوب باستخدام المريض iPSC-ECs يسمح تأكيد النتائج من الدراسات الحيوانية، فضلا عن تحديد الطفرات المسببة للأمراض من تعدد الأشكال النيوكليوتيدية واحد في الجين المهندس. مزيج من هذه الأساليب يوضح دور المهندس في تكوين الأوعية الدموية وعقد المحتملة في تصحيح الجينات من iPSC-ECs المريض للعلاج بالخلايا القلبية الوعائية23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بمنح من البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين - الخلايا الجذعية والبحوث الانتقالية [منحة رقم 2016YFA0102300 (إلى جون يانغ)]؛ مؤسسة علوم الطبيعة في الصين [المنحة رقم 81870051، 81670054 (إلى جون يانغ)]؛ صندوق كامس للابتكار للعلوم الطبية (CIFMS) [منحة رقم 2016-I2M-4-003 (إلى جون يانغ)]؛ تم العثور على شباب PUMC وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية [منحة رقم 2017310013 (إلى فانغ تشو)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis ibidi 81506 Cell culture
Amp 1-FL ACD SDS 320852 Signal Amplification
Amp 2-FL ACD SDS 320853 Signal Amplification
Amp 3-FL ACD SDS 320854 Signal Amplification
Amp 4 Alt B-FL ACD SDS 320856 Signal Amplification
Corning Matrigel Matrix Corning 354234 Growth factor-reduced Matrigel
DEPC Sigma D5758 RNAase-free Water
Human Endothelial-SFM Thermofisher 11111044 Cell culture
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Fixed embryos
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Fixed Cells
Protease K ACD SDS 322337 Digest tissue
Sodium Citrate Sigma 6132-04-3 SSCT solution: Wash Buffer
VEGF-165 STEMCELL Technologies 78073 Growth factor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
  2. Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
  3. Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
  4. Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
  5. Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
  6. Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
  7. Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
  8. Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
  9. Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
  10. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  11. Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
  12. Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
  15. Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
  16. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
  17. Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
  18. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
  19. Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
  20. Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
  21. El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
  22. Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
  23. Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 159، التهجين الكامل في الموقع، iPSC-ECs، تشكيل الأنبوب، تطوير الأوعية الدموية، HHT، أمراض القلب والأوعية الدموية
التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Zhang, D., Zhou, F., Zhou, … More

Wang, Y., Zhang, D., Zhou, F., Zhou, M., Li, Q., Chen, J., Yang, J. Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development. J. Vis. Exp. (159), e60498, doi:10.3791/60498 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter