Summary
Præsenteret her er en protokol for hele mount in situ RNA hybridisering analyse i zebrafisk og rør dannelse assay i patient-afledt induceret pluripotente stamceller-afledte endotelceller til at studere den rolle, endoglin i vaskulær dannelse.
Abstract
Vaskulær udvikling bestemmes af det sekventielle udtryk for specifikke gener, som kan undersøges ved at udføre in situ hybridiseringsanalyser i zebrafisk i forskellige udviklingsstadier. At undersøge den rolle, endoglin (eng) i fartøj dannelse under udviklingen af arvelige hemorrhagic telangiectasia (HHT), morpholino-medieret målrettet knockdown af eng i zebrafisk bruges til at studere sin tidsmæssige udtryk og tilknyttede funktioner. Her anvendes hel-mount in situ RNA hybridisering (WISH) til analyse af eng og dens nedstrømsgener i zebrafiskembryer. Også, rør dannelse assays udføres i HHT patient-afledt induceret pluripotente stamceller-differentierede endotelceller (iPSC-ECs; med eng mutationer). Et specifikt signal forstærkesystem ved hjælp af hele mængden In Situ Hybridization – WISH giver højere opløsning og lavere baggrundsresultater sammenlignet med traditionelle metoder. For at opnå et bedre signal justeres efterfikseringstiden til 30 min efter sondehybridering. Da fluorescensfarvning ikke er følsom i zebrafiskembryer, erstattes den med diaminobezidiin (DAB) farvning her. I denne protokol differentieres HHT-patientafledte iPSC-linjer, der indeholder en engmutation, til endotelceller. Efter belægning af en plade med kældermembranmatrix i 30 min ved 37 °C såes iPSC-ECs som monolag i brønde og holdes ved 37 °C i 3 timer. Derefter beregnes rørlængden og antallet af grene ved hjælp af mikroskopiske billeder. Således, med denne forbedrede WISH protokol, er det vist, at reduceret eng udtryk påvirker endotel stamfader dannelse i zebrafisk embryoner. Dette bekræftes yderligere af tube dannelsesanalyser ved hjælp af iPSC-ECs fra en patient med HHT. Disse analyser bekræfter den rolle, som eng i den tidlige vaskulære udvikling.
Introduction
Der er rapporteret en enkelt mutation på eng (CD105) hos patienter med HHT. Mutationen fører til øget spredning af EF og reduceret flowmedieret EF-forlængelse1,2. Det er også tidligere blevet rapporteret, at ENG-mangel reducerer endotel markører udtryk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i zebrafisk3. Endoglin, hovedsageligt udtrykt i endotelceller, er en transmembrane glycoprotein og fungerer som en co-receptor for at omdanne vækstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det dirigerer BMP9 bindende på celleoverfladen til at regulere downstream genet, herunder Id1 udtryk, at fremkalde stamcelle differentiering mod ECs4. Således eng genet spiller vigtige roller i vaskulogenese og human vaskulær sygdom5,6. Vi har tidligere undersøgt virkningerne af endoglin knockdown på fartøjsdannelse i zebrafiskembryer, efterfulgt af analyse af iPSCs-afledte ECs erhvervet fra en HHT-patient, der bærer en eng mutation7. Denne protokol viser virkningerne af ENG-mangel på endotelprogenitormarkør udtryk og rørdannelse, som er en kvantificerbar metode til måling af in vitro angiogenese.
For at studere eng rumlige og tidsmæssige udtryk, ER WISH ansat til at opdage genekspression in vivo8. In situ hybridisering (ISH) er en metode til at anvende mærkede sonder med komplementsekvenser af målnukleinsyrer (DNA eller mRNA) til at detektere og visualisere målnukleinsyre hybrider i en fast prøve. Processen forstærker genekspressionssignaler in vivo og bruges til at detektere ekspression af gener ved mikroskopi. WISH har været meget udbredt i forskellige model dyr, især i zebrafisk9. Det bruges også til at erhverve følgende data: 1) gen rumlige / tidsmæssige udtryk mønstre, som giver oplysninger om genfunktion og klassificering; og 2) specifikt udtrykt genmarkører, der anvendes i høj-throughput stof eller mutant screening10.
Kromogene sonder nedbrydes let med traditionel kromosom in situ hybridisering (CISH), hvilket resulterer i høj baggrundsstøj og uspecifikke signaler11,12. WISH-metoden bruger to uafhængige dobbelte Z-sonder, som er designet til at hybridisere for at målrette RNA-sekvenser. Hver sonde indeholder en 18-25 sekvens som supplement til målet RNA og en 14 base hale sekvens (konceptualiseret som Z). Målsonderne anvendes i et par (dobbelt Z). De to halesekvenser udgør tilsammen et 28 base hybridiseringssted for forforstærkeren, som indeholder 20 bindingssteder for forstærkeren. Forstærkeren indeholder til gengæld 20 bindingssteder for etiketsonden og kan teoretisk give op til 8.000 etiketter for hver mål-RNA-sekvens.
Denne avancerede teknologi letter samtidig signalforstærkning og baggrundsundertrykkelse for at opnå visualisering med et enkelt molekyle, samtidig med at vævsmorfologienbevares 13. Yderligere ændring af WISH metoder er baseret på tidligere forskning14, herunder ekstra fiksering og DAB farvning. Forudsat her er en forbedret WISH protokol, der kan arbejde, selv om målet RNA er delvist reduceret eller nedbrudt. Fordele omfatter, at det kan udfyldes i 24 timer uden RNase-fri betingelser. Signaler kan også registreres samtidigt gennem flere kanaler fra flere mål, og resultaterne er konsistente og kompatible med resultater fra forskellige automatiseringsplatforme med høj overførselshastighed.
Resultater fra dyremodeller afspejler ikke det samme fænomen, der forekommer hos mennesker. ENG indeholder to par konserverede cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i forældreløse områder. For yderligere at undersøge eng's rolle hos HHT-patienter er der udført tubedannelsesanalyser med iPSCs afledt af HHT-patienter i celler uden/med eng mutationer (Cys30Arg, C30R)15. Efter Kubota et al. første rapporterede røret dannelse eksperiment16, analysen er blevet udviklet på flere måder. Det har været brugt til at identificere angiogene eller antiangiogenic faktorer, definere signalering veje i angiogenese, og identificere gener, der regulerer angiogenese17.
Før tilgængeligheden af patient-afledte iPSC-ECs, forskere, der primært anvendes europæiske selskaber til at studere angiogense16. Men for endotelceller er det en teknisk udfordring at transduce eksogene gener med en virus, på grund af det begrænsede passage nummer, som ECs kan gennemgå. Dette skyldes, at der næppe er nok cellulære materiale, der skal indsamles fra menneskelige fartøjer enten fra kirurgi eller matchede godkendte donorer. Med opfindelsen af iPSC generation teknik af Shinya Yamanaka, menneskelige ECs stammer fra iPSCs kan anvendes pålideligt i in vitro eksperimenter, som rapporteret tidligere18.
Brug af viralt transkucerede ECs med et begrænset antal og passager kan være tilstrækkeligt til signaling undersøgelser, men for funktionelle undersøgelser, er det bedre at generere mutant pluripotente stamcellelinjer, (enten iPSCs eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCs), derefter differentiere dem i ECs for angiogenese undersøgelser, der bruger dannelse rør assays19. Rørdannelse kan bruges til at vurdere funktionen af endotelceller, der bærer mutationer. Denne protokol beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plade, som er en nem, omkostningseffektiv og reproducerbar metode.
Protokollen nedenfor giver en pålidelig og systemisk metode til at studere de specifikke geners rolle i vaskulær dannelse sammen med oplysninger om in vivo-ekspressionsmønster og in vitro-funktionel kvantificering til modellering af sygdomme hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den forskningsetiske komité på Zhejiang University school of medicine.
1. Hel-mount in situ hybridisering
- Zebrafisk linje opdræt og reproduktion
- Fodre og opdrætte alle voksne zebrafisk ved 26-28 °C i et recirkulerende akvakultursystem med 14 timers lys/10 h mørk cyklus for hver dag. Brug AB (vildtype) zebrafisklinjer til følgende procedurer.
- Sæt et lag af småsten i bunden af avlskassen som et krisecenter for æg. Gruppere forældrefisk i forholdet 2:1 (dvs. to hunner og en han) i hver kasse. Lad hunfisken gyde i 1 dag. I slutningen af gydning, fjerne forældrenes fisk straks for at forhindre dem i at spise æggene.
- 2 ng af morpholinos og 500 pg af mRNA i encellede trin embryoner ved hjælp af Femto Jet injektion system under et mikroskop (endoglin-MOs sekvens: 5'-GATGAACTCAACACTCGTCGTCTGAT-3'; 5-mispair kontrol MOs sekvens: 5'-AAACAGACCACATCCTCTTCATTCCATTC-3').
- Zygoterne inkuberes i surt havvand ved 27 °C i ca. 48 timer.
- Indsamling og fiksering af zebrafiskembryer
- Brug en plastoverførselspipette til at opsamle 20-40 zebrafiskembryder fra det cirkulerende systemvand (pH = 5,0) i et 1,5 ml rør, når de er afkofanget og når en bestemt udviklingsperiode. Tilsæt 1 ml frisklavet 4% PFA-opløsning ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Den periode, hvor det valgte embryon er baseret på formålet med forsøget. Tabel 1 viser den fikseringstid, der kræves i forskellige embryonale perioder. - Tag fikseringsopløsningen ud, vask embryoner med fosfatbufferet opløsning med Tween-20 (PBST, fortynd 1 ml Tween til 1000 ml PBS-opløsning) 3x i 5 min hver ved RT.
- Dehydrer embryonerne gennem inkubation i en serie på 25%, 50% og 75% methanol (fortyndet i PBST) i 5 min hver. Overfør embryoner til 100% methanol i 5 min og erstatte med frisk methanol. Embryonerne opbevares ved -20 °C natten over eller længere.
- Brug en plastoverførselspipette til at opsamle 20-40 zebrafiskembryder fra det cirkulerende systemvand (pH = 5,0) i et 1,5 ml rør, når de er afkofanget og når en bestemt udviklingsperiode. Tilsæt 1 ml frisklavet 4% PFA-opløsning ved stuetemperatur (RT).
- Hydrering og fordøjelse
- Hydrat embryoner, der blev bevaret i 100% methanol ved hjælp af en sigte med nylon mesh i bunden til sekventielt vaske embryoner i brøndene af 12 brønde plader med en serie på 75%, 50%, og 25% methanol (fortyndet i PBST) i 5 min hver. Embryonerne vaskes med PBST 3x i 5 minutter hver ved RT.
- Der tilsættes 50 μL proteinase K (10 mg/ml) i røret med embryoner, og fordøjelsestiden følges i tabel 2 ved RT.
- Fjern proteinase K og vask embryoner med PBST 3x i 5 min hver på RT.
- Vir hybridisering og efter-fiksering
- Sonderne, der er konstrueret i henhold til hvert gens mRNA-sekvenser, anbringes i et 40 °C hybridizatinsystem, indtil bundfaldet er opløst. som bør tage ~ 10 min. Bland målet sonder af f.eks (XM_007116,7) og yderligere to vigtige gener inddrage i den tidlige mesoderme endotheial progenitor dannelse (her aplnr [NM_001075105.1] og nrp1a [NM_001040326.1]) i en 1,5 ml rør på en 50:1:1 forholdet.
- Der tilsættes 50-100 μL blandede målsonder i hvert rør med embryoner, hvorefter de inkuberes natten over ved 40 °C.
BEMÆRK: Forblandede sonder skal forvarmes til 40 °C og afkøles til RT før brug. - Der fremstilles en 0,2 x saltvandsnatriumcitratopløsning med Tween-20 (SSCT): 175,3 g NaCl og 88 g natriumcitrat opløses i 1 L dH2O for at opnå en 20x SSC-opløsning. Derefter fortyndes opløsningen 1:100 i dH2O for at opnå en 0,2 x SSCT-opløsning. Tween-20 1:1000 fortyndes i 0,2 x SSCT-opløsningen.
- Overfør de genvundne sonder til et nyt rør. Embryonerne vaskes i 0,2 x SSCT-opløsning 3x i 15 minutter hver ved RT. De genvundne sonder kan genbruges 5x-10x.
- Brug 4% paraformaldehyd (PFA) til at fastgøre embryonerne i 30 min ved RT. Vask embryonerne i 0,2 x SSCT-opløsning 3x i 15 minutter hver ved RT.
BEMÆRK: Arbejdet i Gross-Thebing et al. foreslår en post-fixation periode på 10 min14, men det faktiske beløb skal justeres i overensstemmelse hermed. Her testede vi 10 min post-fixation 3x, og følsomheden af DAB døende er væsentligt påvirket. Efter undersøgelse skal du sikre dig, at 0,5-1,0 h af fiksering er den optimale tilstand (en kortere fikseringsperiode kan ikke frembringe et klart signal fra mål-RNA'et, og en passende forlængelse af fikseringstiden hjælper med at styrke signalet og give mindre baggrundsstøj).
- Sekventiel forstærker og etiketsondehyrde hybridisering
- SSCT-opløsningen fjernes, og udskift den med 50 μL Amp 1. Lad embryonerne sætte sig i Amp 1 ved 40 °C i 30 min. Derefter vaskes embryonerne i 0,2 x SSCT opløsning 3x i 15 min hver på RT.
- Tag SSCT-opløsningen af og tilsæt 50 μL Amp 2. Embryonerne anbringes ved 40 °C i 15 minutter. Derefter vaskes embryonerne i 0,2 x SSCT opløsning 3x i 15 min hver på RT.
- SSCT-opløsningen fjernes, tilsættes 50 μL Amp 3, og bank let på røret. Derefter inkuberes embryonerne ved 40 °C i 30 min. Vask derefter embryonerne i 0,2 x SSCT-opløsning 3x i 15 minutter hver ved RT.
- Tag SSCT-opløsningen ud, tilsæt 50 μL Amp 4 dropwise, og bank forsigtigt på røret. Derefter inkuberes embryonerne ved 40 °C i 15 min. Vask derefter embryonerne i 0,2 x SSCT 3x i 15 minutter hver ved RT.
- Kontrastæring og mikroskopi
- SSCT-opløsningen fjernes, og der tilsættes 50 μL DAPI til hvert rør. Embryonerne inkuberes natten over ved 4 °C.
- Embryonerne vaskes med PBST, og de forberedes til billeddannelse ved hjælp af en 1% lav smeltepunkt agarose (LMP) opløsning (1 g LMP opløst i 100 ml dH2O) i en petriskål fyldt med PBST.
- Brug et DAB peroxidase-substratsætsæt til at plette prøven. Tilsæt farvereagenser A, B og C (50 μL hver) til 1 ml destilleret vand og bland godt for at opnå en komplet DAB arbejdsvæske. Tilsæt væsken til prøven og dæk i 10 min.
- Prøven vaskes grundigt med PBST efter farvning.
- Brug et optisk mikroskop med en fotografisk funktion til billeddannelse af prøverne.
BEMÆRK: Hvis du tager billeder senere, skal rør pakkes ind i aluminiumsfolie og opbevares ved 4 °C.
2. Tube dannelse assay
BEMÆRK: Eng mutant og wildtype ECs (kontrol) blev differentieret fra iPSCs afledt af en HHT-patient (her, en 62-årig kvindelig patient med tilbagevendende epistaxis siden 22 år gammel, gastrointestinal blødning, pulmonal arteriel misdannelser, der transporterer en missense eng mutation i position c.88T>C af exon 2) og en sund donor (uden eng mutation), som blev leveret af Peking Union Medical College Hospital med godkendelse fra kollegiet forskning etik udvalg.
- Kontrol- og HHT iPSC-cellekulturer
- Der tilsættes et vist volumen af kældermembranmatrix (f.eks. matrigel) til en 6 brøndcellekulturplade for at dække bunden af brønden og inkubere pladerne i 1 time ved 37 °C.
BEMÆRK: Når kældermembranen første gang opbevares ved -20 °C, inkuberes på is eller i et frostfrit 4 °C køleskab, indtil den optøes. Derefter fortyndes ved 1:100 i DMEM/F12, derefter distribueres fortyndingsrøret i 200 μL rør indeholdende 100 μL hver. Rørene opbevares ved -20 °C, og der undgås gentagen frysning og optøning. Når du tilføjer den fortyndede kældermembranmatrix, må der ikke dannes bobler. Når den fortyndede kældermembranmatrix er tilsmeltet, rystes 6 brøndpladen forsigtigt i hånden, så den dækker bunden jævnt. - Efter belægning pladen, fjerne den anvendte kælder membran matrix opløsning fra brøndene. Derefter tilsættes 2 ml mTeSR1 medium i hver brønd, og plade iPSCs høstet fra den sidste passage på ca 1 x 106 per brønd.
- Der tilsættes et vist volumen af kældermembranmatrix (f.eks. matrigel) til en 6 brøndcellekulturplade for at dække bunden af brønden og inkubere pladerne i 1 time ved 37 °C.
- Generering og udvidelse af EC'er fra iPSC'er
- Efter ca. 4 dages iPSC-kultur udveksles dyrkningsmediet med BEL-mediet suppleret med activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/ml) og CHIR99021 (1,5 μM). Dyrk cellerne i 3 dage for at generere mesodermceller.
- Det medie, der er beskrevet i trin 2.2.1, erstattes med BEL-medium suppleret med VEGF (50 ng/ml) og SB431542 (10 μM) i 4 dage for at udvide vaskulære EC'er. Behandl cellerne med samme medium og kultur i yderligere 3-4 dage.
- Brug CD31-dynabeads til at rense de modne vaskulære ECs: Se instruktionerne i CD31-dynabeads kit, som forbinder humant CD31 antistof med magnetiske perler til at kombinere CD31 molekyler udtrykt på ECs, derefter indsamle CD31-positive celler ved eluering buffer. Vedligeholde og udvide de rensede EC'er i EC-SFM-mediet, der indeholder VEGF165 (30 ng/ml), bFGF (30 ng/mL) og FBS (1%).
- Plating endotelceller på matrigelebelagte plader og mikroskopi
- Der tilsættes 10 μL kældermembranmatrix pr. brønd for at belægge angiogenesepladerne (se Materialetabellen)og inkuberes ved 30 min ved 37 °C.
- Høst endotelceller efter kontrol af endotelmarkører CD31 og VE-cadherin med immunfluorescens farvning og resuspend dem i endotelvækst medium 2 ved pipettering gentagne gange. Der tilsættes 50 μL cellesuspension (2 x10 5 celler/ml) pr. brønd på den størknede matrix, og cellerne inkuberes i 3-5 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Før rørdannelsesforsøget skal endotelmarkører kontrolleres for at sikre, at funktionelle endotelceller er korrekt fænotype. 1 x 104 celle pr brønd er et ideelt tal for rørdannelse. For mange eller for få celler er ikke befordrende for rørdannelse. Tilføj celler fra siden af skålen og ikke røre kælderen membran matrix. Brug lysmikroskop i feltet med høj forstørrelse til at kontrollere cellerne og tage billeder.
- Kvantitative resultater af rørdannelse
- Overhold resultaterne med et mikroskop med høj opløsning og tag billeder af mindst 10 områder for hver gruppe for at opnå pålidelige datastatistikker.
- Undersøg endotelrør dannelse: anslå omfanget af rørdannelse ved at inspicere den samlede rørlængde, rørnummer og gren punkter. Vurder og tæl antallet og længden af grene ved hjælp af ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount in situ hybridisering er baseret på et princip svarende til fluorescens resonans energioverførsel. Det er designet til at forbedre både følsomhed og specificitet i zebrafisk ISH samt forstærke målspecifikke signaler uden at påvirke baggrundssignalet.
I 24 hk zebrafisk embryoner, er endoglin stærkt udtrykt i den bageste kardinal vene (PCV), intersegmental fartøjer (ISVs), og blod øer3. Det er svært at kontrollere farvningstiden i traditionel kromogen in situ hybridisering (CISH), med ikke-positive signaler, der forekommer i nogle regioner, såsom blommesække (Figur 1A). For at undersøge engs rolle i den tidlige vaskulære udvikling blev der anvendt en hæmogen endotelmarkør (aplnra) samt en anden endotelprogenitormarkør (nrp1a) til at undersøge, hvilken type endotel blev påvirket af eng silencing20. Udtrykket af aplnra og nrp1a var svag i 24 hkf embryoner. Sammenlignet med CISH blev det svage signal fra de to gener tydeligt påvist i haleregionen efter eng knockdown i WISH (Figur 1B). Knockdown af eng RNA forårsaget reduceret udtryk for to typer af endotelceller markør gener udtryk i en HHT dyremodel.
Før der blev udført forsøg med differentierede iPSC'er, blev cellerne identificeret og bekræftet som ECs. Morfologisk, de optrådte som brostensbelagte form. Udtrykket af endotelcelleoverflademolekylære markører CD31, CD146, VE-cadherin og vWF blev bekræftet medIF-farvning 21. Efter magnetisk baseret isolation ved hjælp af CD31 blev den funktionelle analyse udført som beskrevet nedenfor.
Her blev rørdannelsesanalysen udført ved hjælp af eng mutant og kontrol iPSC-afledte endotelceller. Statistisk analyse blev udført baseret på antallet, grene og længder af rør. En ny parameter blev også indført baseret på tidligere arbejde3, punkter af angiogenese, for at afspejle rørdannelse af endotelceller. Til sidst blev det konstateret, at eng mutant endotelceller dannede færre grene end kontrol endotelceller, og at grene i eng mutant endotelceller steget betydeligt efter stimulation med vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) (Figur 2A,B). Mutationen i eng resulterede i defekt karrørdannelse.
Figur 1: Endoglin knockdown reducerede udtrykket af endotelmarkører. (A) CISH og WISH blev udført for at bestemme ekspressionen af endoglin i 24 hkf embryoner (n > 30). Det røde felt repræsenterer det forstørrede område. Skalabarer = 200 μm. (B) aplnra og nrp1a udtryk ved WISH i 24 hk zebrafisk embryoner af kontrol-MO og eng-MO gruppe. Den røde pil angiver områder, hvor ekspressionen af disse gener faldt betydeligt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Rørdannelse af eng mutant og kontrol iPSC-ECs. (A) Rørdannelsen for de fire grupper, herunder kontrolgruppen, kontrolgruppen + VEGF (kontrolen endotelceller + 30 ng/ml VEGF), eng mutant(eng mutant endotel cells) og eng mutant + VEGF(eng mutant endotelceller + 30 ng/ml VEGF) og eng mutant + VEGF). Rørdannelsen blev vurderet og fotograferet efter 3 timer. Målestoksforhold = 100 μm. (B) Der vises kvantitative resultater af rørdannelse. På det dækkede område blev antallet af grene og deres rørlængde beregnet ved hjælp af billed J. Fejllinjer repræsenterer SD for middelværdierne fra tre uafhængige eksperimenter. En værdi af P blev anset for statistisk signifikant, når * p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Embryonale periode | Fikseringstid |
| 4-celler til 8 hkf | 4 timer |
| 8 hk til 24 hkf | 1 time |
| 24 hk til 4 dpf | 30 minutter |
Tabel 1: Fikseringstid, der kræves til forskellige embryonale stadier.
| Embryonale periode | Fordøjelsestid |
| 4-celler til 8 hkf | 2 minutter |
| 8 hk til 24 hkf | 5 minutter |
| 24 hk til 4 dpf | 10 minutter |
Tabel 2: Fordøjelsestiden for forskellige embryonale stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol anvendte en forbedret hel-mount in situ RNA analyseplatform for zebrafisk og rør dannelse assays på iPSC-ECs stammer fra en HHT patient. Den traditionelle ISH-metode kræver en længere eksperimentel cyklus med ekstra eksperimentelle trin. Protokollen har nogle vigtige forbedringer, brugen af uafhængige dobbelt Z sonder og iPSCs stammer fra en patient med HHT, der blev anvendt i WISH assays og rør dannelse, henholdsvis. Disse forbedringer er afgørende for at øge detektionsfølsomheden sammenlignet med, hvad der er observeret med traditionel ISH. De unikt designede sonder og målsignalforstærkning gør det muligt at detektere sjældent udtrykte udskrifter(aplnra er et dårligt udtrykt gen i 24 hkf embryoner). En ændring er den ekstra fiksering efter sonde hybridisering. Den ekstra fiksering kan forbedre kombinationen af sonder og udskrifter. DAB farvning anvendes også snarere end fluorescens farvning, fordi det blev konstateret, at det var vanskeligt at udføre fluorescens farvning i visse lav-overflod gener. Derefter, iPSCs blev brugt til angiogenese assays, hvilket øger betydningen og klinik relevansen af dette arbejde. Generering af iPSC'er kræver strenge kulturbetingelser og udgør en begrænsning af protokollen.
Nogle kritiske trin skal fremhæves. I WISH-analyse skal fordøjelsestiden for zebrafiskembryder følges i nøje overensstemmelse med teksten. En kortere fordøjelsestid kan ikke garantere, at sonden kombineres med transskripter med succes. I modsætning hertil vil forlænget fordøjelsestid ødelægge integriteten af embryoner. I rørdannelsesforsøgene skal billeddiagnostiket være velkontrolleret. Generelt vil endotelcellerne blive rør inden for 12 timer, men den rørformede struktur har tendens til at gå i opløsning efter 24 timer. Cellenummeret er også vigtigt for rørdannelse, da en celletæthed, der er for høj eller for lav, kan føre til mislykket rørdannelse. Hvis det er vanskeligt at fremkalde endotelceller til at danne rør, er det nyttigt at medtage tilføjelse af vækstfaktorer såsom VEGF til dyrkningsmediet som en positiv kontrol for at teste eC'ernes evne til at danne rørstrukturer.
Sammenfattende er den forbedrede WISH-metode blevet betragtet som en fordelagtig teknik til laboratoriearbejdsgange. For nylig er vores forskningsgruppe begyndt at teste denne analyse i kliniske prøver. I betragtning af højere følsomhed og mere effektiv detektion end observeret i traditionelle metoder, denne forbedrede WISH metode har betydelige løfte om at udvikle og gennemføre RNA-baserede molekylære diagnostik22.
Udførelsen af rørdannelsesanalyse ved hjælp af patientens iPSC-EC'er gør det muligt at bekræfte resultaterne fra dyreforsøg eng samt identificere sygdomsfremkaldende mutationer fra enkeltnukleotidpolymorfi i eng-genet. Kombinationen af disse metoder tydeliggør engs rolle i vaskulær dannelse og har potentiale for genkorrektion af patient iPSC-ECs til hjerte-kar-celleterapi23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key Research and Development Program of China-stem cell og translationel forskning [tilskudsnummer 2016YFA0102300 (til Jun Yang)];The Nature Science Foundation of China [tilskudsnummer 81870051, 81670054 (til Jun Yang)]; CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [tilskudsnummer 2016-I2M-4-003 (til Jun Yang)]; PUMC Youth Found og De Grundlæggende Forskningsfonde for de centrale universiteter [tilskudsnummer 2017310013 (til Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al.
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
