Presentert her er en protokoll for hel-mount in situ RNA hybridisering analyse i sebrafisk og rør formasjon analyse i pasient-avledet indusert pluripotent stamcelle-avledede endotelceller å studere rollen som endoglin i vaskulær formasjon.
Vaskulær utvikling bestemmes av det sekvensielle uttrykket av spesifikke gener, som kan studeres ved å utføre in situ hybridiseringsanalyser i sebrafisk under ulike utviklingsstadier. For å undersøke rollen som endoglin(eng) i skipsdannelse under utviklingen av arvelig hemorragisk telangiectasia (HHT), brukes morpholino-mediert målrettet knockdown av eng i sebrafisk til å studere sitt temporale uttrykk og tilhørende funksjoner. Her er helmontert in situ RNA hybridisering (WISH) ansatt for analyse av eng og dets nedstrøms gener i sebrafiskembryoer. Også rørdannelsesanalyser utføres i HHT pasientavledede indusert pluripotent stamcelledifferensierte endotelceller (iPSC-ECer; med eng mutasjoner). Et spesifikt signalforsterkende system ved hjelp av hele beløpet In Situ Hybridization – WISH gir høyere oppløsning og lavere bakgrunnsresultater sammenlignet med tradisjonelle metoder. For å få et bedre signal, justeres etterløsningstiden til 30 minutter etter sondehybridisering. Fordi fluorescensfarging ikke er følsom i sebrafiskembryoer, erstattes den med diaminobezidin (DAB) farging her. I denne protokollen differensieres HHT pasientavledede iPSC-linjer som inneholder en eng-mutasjon, til endotelceller. Etter å ha dekket en plate med kjellermembranmatrise i 30 min ved 37 °C, seedes iPSC-ECer som monolager i brønner og oppbevares ved 37 °C i 3 timer. Deretter beregnes rørlengden og antall grener ved hjelp av mikroskopiske bilder. Dermed, med denne forbedrede WISH-protokollen, er det vist at redusert eng-uttrykk påvirker endotelstamdannelse i sebrafiskembryoer. Dette bekreftes videre av rørdannelsesanalyser ved hjelp av iPSC-ECer avledet fra en pasient med HHT. Disse analysene bekrefter rollen for eng i tidlig vaskulær utvikling.
En enkelt mutasjon på eng (CD105) er rapportert hos pasienter med HHT. Mutasjonen fører til økt EF-spredning og redusert strømningsmediert EC-forlengelse1,,2. Det har også tidligere blitt rapportert at ENG-mangel reduserer endotelmarkører uttrykk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i sebrafisk3. Endoglin, hovedsakelig uttrykt i endotelceller, er en transmembrane glykoprotein og fungerer som en co-reseptor for å transformere vekstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det leder BMP9 binding på celleoverflaten for å regulere nedstrøms genet, inkludert Id1 uttrykk, å indusere stamcelle differensiering mot ECs4. Dermed spiller eng genet viktige roller i vaskuogenese og menneskelig vaskulær sykdom5,6. Vi har tidligere undersøkt effekten av endoglin knockdown på fartøydannelse i sebrafisk embryoer, etterfulgt av analyse av iPSCs-avledet ECs ervervet fra en HHT pasient bærer en eng mutasjon7. Denne protokollen viser effekten av ENG-mangel på endotelstammarkøruttrykk og rørdannelse, som er en kvantifiserbar metode for måling av in vitro angiogenese.
For å studere eng romlig og timelig uttrykk, er WISH ansatt for å oppdage genuttrykk in vivo8. In situ hybridization (ISH) er en metode for å bruke merkede sonder med komplement sekvenser av målkjernesyrer (DNA eller mRNA) for å oppdage og visualisere målkjernesyre hybrider i en fast prøve. Prosessen forsterker genuttrykkssignaler in vivo og brukes til å oppdage uttrykket av gener ved mikroskopi. WISH har vært mye brukt i ulike modell dyr, spesielt i sebrafisk9. Det brukes også til å skaffe følgende data: 1) gen romlige / temporale uttrykksmønstre, som gir informasjon om genfunksjon og klassifisering; og 2) spesielt uttrykte genmarkører som brukes i høygjennomstrømning narkotika eller mutant screening10.
Kromogene sonder er lett degradert med tradisjonelle kromosom in situ hybridization (CISH), noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy og uspesifikke signaler11,12. WISH-metoden bruker to uavhengige doble Z-sonder, som er designet for å hybridisere for å målrette RNA-sekvenser. Hver sonde inneholder en 18-25 sekvens komplementær til målet RNA og en 14 base tail sekvens (konseptualisert som Z). Målsondene brukes i et par (dobbel Z). De to halesekvensene danner sammen et 28-base hybridiseringssted for foramplifieren, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkeren. Forsterkeren inneholder i sin tur 20 bindingssteder for etikettsonden og kan teoretisk gi opptil 8000 etiketter for hver mål RNA-sekvens.
Denne avanserte teknologien forenkler samtidig signalforsterkning og bakgrunnsundertrykkelse for å oppnå visualisering med ett molekyl samtidig som vevmorfologienbevares 13. Ytterligere endring av WISH-metodene er basert på tidligere forskning14, inkludert ekstra fiksering og DAB-farging. Forutsatt her er en forbedret WISH-protokoll som kan fungere selv om målet RNA er delvis redusert eller degradert. Fordeler inkluderer at det kan fullføres i 24 timer uten RNase-frie forhold. Signaler kan også oppdages samtidig gjennom flere kanaler fra flere mål, og resultatene er konsistente og kompatible med resultater fra forskjellige automatiseringsplattformer med høy gjennomstrømning.
Resultater fra dyremodeller gjenspeiler ikke det samme fenomenet som oppstår hos mennesker. ENG inneholder to par bevarte cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i foreldreløse områder. For ytterligere å studere rollen som eng hos HHT-pasienter, har rørdannelsesanalyser med iPSCer avledet fra HHT-pasienter blitt utført i celler uten/med eng-mutasjoner (Cys30Arg, C30R)15. Etter at Kubota et al. først rapporterte rørdannelseseksperimentet16,er analysen utviklet på flere måter. Det har blitt brukt til å identifisere angiogene eller antiangiogene faktorer, definere signalveiene i angiogenese, og identifisere gener som regulerer angiogenese17.
Før tilgjengeligheten av pasientavledede iPSC-ECer, brukte forskere primært kultiverte ECer til å studere angiogensis16. Men for endotelceller er det en teknisk utfordring å transduce eksogene gener med et virus, på grunn av det begrensede passasjenummeret som ECer kan gjennomgå. Dette er fordi det er knapt nok cellulært materiale til å bli samlet inn fra menneskelige fartøy enten fra kirurgi eller matchet godkjente givere. Med oppfinnelsen av iPSC generasjon teknikk av Shinya Yamanaka, menneskelige ECer avledet fra iPSCs kan brukes pålitelig i in vitro eksperimenter, som rapportert tidligere18.
Ved hjelp av viralt transduserte ECer med begrenset antall og passasjer kan være tilstrekkelig for signalstudier, men for funksjonelle studier er det bedre å generere muterte pluripotente stamcellelinjer (enten iPSCer eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCer), og deretter skille dem inn i ECer for angiogenesestudier som bruker rørdannelsesanalyser19. Rørdannelse kan brukes til å evaluere funksjonen til endotelceller som bærer mutasjoner. Denne protokollen beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plate, som er en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar metode.
Protokollen nedenfor gir en pålitelig og systemisk metode for å studere rollen som spesifikke gener i vaskulær formasjon, sammen med detaljer for in vivo uttrykksmønster og in vitro funksjonell kvantifisering for modellering av menneskelig sykdom.
Denne protokollen brukte en forbedret helmontert in situ RNA-analyseplattform for sebrafisk- og rørdannelsesanalyser på iPSC-ECer avledet fra en HHT-pasient. Den tradisjonelle ISH-metoden krever en lengre eksperimentell syklus med ekstra eksperimentelle trinn. Protokollen har noen viktige forbedringer, bruk av uavhengige doble Z-sonder og iPSCer avledet fra en pasient med HHT som ble brukt i WISH-analyser og rørdannelse, henholdsvis. Disse forbedringene er avgjørende for å forbedre deteksjonsfølsomheten sammenligne…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key Research and Development Program of China-stem celle og translasjonell forskning [tilskuddsnummer 2016YFA0102300 (til Jun Yang)];Nature Science Foundation of China [tilskuddsnummer 81870051, 81670054 (til Jun Yang)]; CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [tilskuddsnummer 2016-I2M-4-003 (til Jun Yang)]; PUMC Youth Found og Fundamental Research Funds for de sentrale universitetene [tilskuddsnummer 2017310013 (til Fang Zhou)].
µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |