Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Separation av cellhöljet för gramnegativa bakterier i inre och yttre membranfraktioner med tekniska justeringar för Acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Gramnegativa bakterier producerar två rumsligt segregerade membran. Det yttre membranet är partitionerat från det inre membranet av en periplasm och ett peptidoglykanlager. Förmågan att isolera de dubbla bilayers av dessa mikrober har varit avgörande för att förstå deras fysiologi och patogenes.

Abstract

Denna metod fungerar genom att dela upp kuvertet av gramnegativa bakterier i totala, inre och yttre membran (OM) fraktioner och avslutas med analyser för att bedöma renhet bilayers. OM har en ökad total densitet jämfört med det inre membranet, till stor del på grund av förekomsten av lipooligosackarider (LOS) och lipopolysackarider (LPS) i den yttre broschyren. LOS- och LPS-molekyler är amfipatiska glykolipider som har en liknande struktur, som består av en lipid-A disaccharolipid och core-oligosaccharide substituent. Emellertid, endast LPS molekyler är dekorerade med en tredje underenhet som kallas O-polysackarid, eller O-antigen. Den typ och mängd glykolipider som förekommer kommer att påverka en organisms OM-densitet. Därför testade vi om membranen hos bakterier med varierat glykolipidinnehåll kunde isoleras på samma sätt med hjälp av vår teknik. För LPS-producerande organismer, Salmonella enterica serovar Typhimurium och Escherichia coli, membranen var lätt isolerade och LPS O-antigen moiety påverkade inte bilayer partitionering. Acinetobacter baumannii producerar LOS molekyler, som har en liknande massa som O-antigen bristfälliga LPS-molekyler; membranen hos dessa mikrober kunde dock inte från början separeras. Vi motiverade att OM av A. baumannii var mindre tät än Enterobacteriaceae, så sackaros lutning justerades och membranen isolerades. Tekniken kan därför anpassas och modifieras för användning med andra organismer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gramnegativa bakterier producerar två membran som skiljs åt av ett periplasmiskt utrymme och en peptidoglykancellvägg1. Det inre membranet (IM) innesluter cytosol och är en symmetrisk bilayer av fosfolipider. Peptidoglykan skyddar mot turgor tryck och ger bakterien med en cellform, och är fäst vid det yttre membranet (OM) av lipoproteiner2,3. OM omger periplasmen och är övervägande asymmetrisk. Den inre bipacksedeln består av fosfolipider och den yttre bipacksedeln består av glykolipider som kallas lipooligosackarider (LOS) eller lipopolysackarider (LPS)4,5. Lipidasymmetrin och biokemin hos LOS/LPS-molekylerna i den yttre bipacksedeln ger barriäregenskaper till cellytan som skyddar bakterien mot faror i dess miljö6,7.

LPS-molekyler består av tre beståndsdelar: lipid A disaccharolipid, kärnan oligosaccharide, och O-polysackarid eller O-antigen. Lipid A är en multiplicera acylaterad disaccharolipid. Core-oligosackarider består av 10–15 sockerarter som kallas grov LPS eller R-LPS. Kärnan är indelad i den inre regionen, bestående av 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic syra (kdo) och en eller flera heptose rester, och en yttre region som består i allmänhet av hexoser (glukos eller galaktos) och heptoser, eller acetamido socker5. Det yttre kärnområdet är mer variabelt i sina komponenter och struktur än den inre kärnan. I Salmonella spp., har endast en kärnstruktur beskrivits; i Escherichia coli finns det dock fem olika kärnstrukturer (utsedda K-12, R1, R2, R3 och R4)8. E. coli K-12 DH5α, som vi använder i detta förfarande bär en mutation som resulterar i produktion R-LPS9. R-LPS-molekylerna saknar O-antigenmoiety och har en liknande molekylvikt som LOS-molekyler.

Tillsatsen av O-antigen till R-LPS förvandlar denna molekyl till slät LPS, eller S-LPS. O-antigenerna är byggda av korta 3-4 kolhydratsubenheter och består av flera modaliteter med varierande kedjelängder10. Vissa LPS-producerande bakterier, som Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), visa en trimodal fördelning av LPS-molekyler på deras yta10,11. Mycket långa kedjan O-antigener kan innehålla över hundra underenheter och väger över hundra kilodalton. O-antigenerna ger ytegenskaper till bakterien som är nödvändiga för att motstå antibiotika, undgå predation av bakteriofader och orsaka sjukdom.

Arter av Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria och andra genererar LOS molekyler istället för LPS molekyler på deras yta12. LOS molekyler består av lipid A och core oligosackarider men saknar O-antigen. Dessa typer av gramnegativa bakterier ändrar sina kärnoligosackarider med ytterligare sockerarter och kombinationer av socker för att ändraytegenskaperna 12. Både LOS och LPS-producerande mikrober härleder fosfaterna på lipid A och kärnmolekyler med katjoniska moieties7. Dessa tillägg inkluderar fosfoetanolamin, galaactosamin och aminoarabinose substitutioner, som fungerar genom att neutralisera anjonisk yta laddning och därmed skydda mot katjoniska antimikrobiella peptider. Gramnegativa bakterier ändrar också kärnan oligosaackarid struktur med varierande icke-stökiometriska substitutioner av sockerarter, eller extra kdo molekyler, och ändra antalet acyl kedjor på lipid-A disaccharolipids7.

Förmågan att isolera IM från OM av gramnegativa bakterier har varit avgörande för att förstå cellhöljets roll i antimikrobiell resistens och sjukdomspatogenes11,12. Härledningar av detta tillvägagångssätt har använts för att härleda mekanismer för montering, underhåll och ombyggnad av protein, fosfolipid och glykolipid beståndsdelar för OM.

Vårt labb utför rutinmässigt bakteriella lipidomic analyser för att studera proteinmedierade lipidreglering och lipidfunktion i en mängd gramnegativa arter. De volymer som används i protokollet återspeglar den rutinmässiga användningen av detta förfarande för att analysera icke-radioaktivt märkta fosfolipider med tunt lager kromatografi och flytande kromatografi tandem masspektrometri13,14.

Protokollet börjar med att utsätta en kyld suspension av gramnegativa bakterier för en hög osmolarlösning av sackaros och lägga till lysozym för att separera OM från det underliggande peptidoglykanska lagret (figur 1)12. EDTA tillsätts sedan för att underlätta penetration av lysozym, eftersom divalent katjonbindning stör den laterala elektrostatiska överbryggande interaktioner mellan intilliggande LOS / LPS molekyler15. Det ursprungliga protokollet från vilket vårt har anpassats krävs bildandet av spheroplasts, en gramnegativa bakteriell cellform som består av ett plasmamembran och cytosol, men saknar peptidoglykanskiktet och en OM. Det är möjligt att spheroplasts produceras med den anpassade metoden; tekniken förlitar sig dock inte på eller avser att deras bildning för framgång. Istället skördas de lysozym-EDTA-behandlade bakterierna snabbt genom centrifugering och åter suspenderas i en sackaroslösning med mindre koncentration innan trycksatt lys. De OEM-tillverkare som kan ha släppts genom att bilda spheroplasts bör i teorin kunna skördas från supernatanterna i de behandlade cellerna, men detta tillvägagångssätt är inte specificerat häri. I slutändan utsätts de behandlade cellerna för konventionell homogenisering och lys, vilket ökar effektiviteten och reproducerbarheten hos membranseparationsproceduren16.

Efter lysis samlas de totala membranen upp genom ultracentrifugering och appliceras på en diskontinuerlig sackarostäthetsgradient för att fraktionera IMs och OEM-tillverkare. Den klassiska metoden använder en mer kontinuerlig gradient som består av minst fem olika sackaroslösningar11,12. Den diskontinuerliga gradienten i vårt protokoll består av tre sackaroslösningar och partitionerar bilayers i två distinkta fraktioner17. LOS- och LPS-molekylerna i OEM-negativa bakterier driver kuvertet till att delas upp i en övre brun im-fraktion med låg densitet och en lägre vit HÖGdensitets-OM-fraktion (figur 1 och figur 2).

Acinetobacter baumannii är viktiga multiresistenta mänskliga patogener som producerar LOS molekyler i deras OM och uppföra ett cellkuvert som är svårt att skilja18,19. Senaste arbetet tyder på att en härledning av det protokoll som vi presenterar här kan användas för att dela bilayers av dessa organismer20. Därför testade vi vårt protokoll om A. baumannii 17978. Inledningsvis var förfarandet otillräckligt. Vi ändrade dock sackaroskoncentrationen i mellandensitetslösningen och avsevärt förbättrad separation (figur 2). En NADH dehydrogenas analys och en LOS/LPS extraktion och detektion förfarande användes för att bekräfta separation för A. baumannii, vild-typ S. Typhimurium och två O-antigen bristfälliga enterobacterial genotyper; nämligen galE-mutant S. Typhimurium och laboratoriestam, E. coli DH5α (figur 3 och figur 4).

Avsikten med detta arbete är att leverera en strömlinjeformad strategi för reproducerbart isolera membranen gramnegativa bakterier. Protokollet kan användas för att studera många typer av membran-associerade molekyler för dessa mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Allmänna reagenser och medieberedning för membranutvinning

  1. Bakterietillväxtmedia: Förbered och sterilisera 1 L buljongmedia i en noggrant rengjord och autoklaverad 2 L-kolv.
  2. Allmän resuspensionsbuffert (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 ml): Lös upp 6,05 g Tris-bas i 30 ml H2O. Justera pH till 7,5 med 5 M HCl. Justera den slutliga volymen till 50 ml med ultrapure H2O.
  3. Master lager av divalent katjon kelering lösning (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Tillsätt 18,6 g av natriumetylen tetraacetat ·2H2O till 80 ml H2O. Rör kraftigt och justera pH till 8,0 med NaOH. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ultrapure H2O.
    OBS: Detriumsaltet av EDTA löses inte upp förrän lösningens pH-kort har justerats till ~8,0 genom tillsats av NaOH.
  4. Osmotisk buffert A (0,5 M sackaros, 10 mM Tris pH 7.5; 1 L): Väg 171,15 g sackaros och överför till en 1 L cylinder. Tillsätt 10 ml 1 M Tris pH 7.5. Justera till en slutlig volym på 1 L med ultrapure H2O. Förvaras vid 4 °C.
  5. Lysozym (10 mg/ml; 5 ml): Väg 50 mg (kyckling äggvita) lysozym och lös upp i 5 ml ultrapure H2O. Förvaras vid 4 °C.
  6. Utspädd divalent katjonkelningslösning (1,5 mM EDTA; 500 ml): Tillsätt 1,5 ml 0,5 M EDTA (steg 1,3) till 497,5 ml ultrapure H2O. Förvaras vid 4 °C.
  7. Osmotisk buffert B (0,2 M sackaros, 10 mM Tris pH 7.5; 2 L): Väg 136,8 g sackaros och överför till en 2 L cylinder. Tillsätt 20 ml 1 M Tris pH 7.5. Justera den slutliga volymen till 2 L med ultrapure H2O. Förvara vid 4 °C.
  8. Nukleas co-faktor (1 M MgCl2; 10 ml): Lös upp 2,03 g MgCl2·6H2O i 8 ml ultrapure H2O. Justera volymen till 10 ml. Förvaras i rumstemperatur.
  9. Nukleaslösning cocktail inklusive RNase och DNase enzymer: Se Tabell av material. Förvaras vid -20 °C.
  10. Proteashämmare cocktail: Se Tabell över material. Förvaras vid 4 °C.
  11. Isopycnic sukrossäktlösning med låg densitet (20% w/v sackaros, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Lösning; 100 ml): Väg 20 g sackaros och överför till en 200 ml cylinder. Tillsätt 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7.5 och 200 μL av 0,5 M EDTA pH 8. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ultrapure H2O. Förvaras i rumstemperatur.
  12. Medeldensitet isopycnic sackaros gradient lösning (53% w / v sackaros, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Lösning; 100 ml): Väg 53 g sackaros och överför till en 200 ml graderad cylinder. Tillsätt 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7.5 och 200 μL av 0,5 M EDTA pH 8. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ultrapure H2O. Förvaras i rumstemperatur.
    OBS: Förbered denna lösning i en graderad cylinder för att säkerställa noggrannheten på grund av den höga andelen sackaros. Tillsätt en magnetisk omrörstång och rör om tills sackaroset är helt upplöst i lösningen. Den här processen kan ta flera timmar.
  13. Isopycnic sucrose gradientlösning med hög densitet (73% w/v sackaros, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Lösning; 100 ml): Väg 73 g sackaros och överför till en 200 ml graderad cylinder. Tillsätt 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7.5 och 200 μL av 0,5 M EDTA pH 8. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ultrapure H2O. Förvaras i rumstemperatur.
    OBS: Förbered denna lösning i en graderad cylinder för att säkerställa noggrannheten på grund av den höga andelen sackaros. Tillsätt en magnetisk omrörningsstång och rör om tills sackarosen är helt upplöst. Den här processen kan ta flera timmar.
  14. Buffert för isolerat membranlagring (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Tillsätt 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7.5 till en 1 L-kolv och justera den slutliga volymen till 1 L med ultrapure H2O.
  15. β-Nicotinamid adenin dinukleotid (NADH) (10 mg/ml-lösning): Resuspend 10 mg NADH i ultrapurE H2O. Förbered färska lager, varje vecka. Förvaras vid -20 °C.
  16. Fenollösning ekvilibrerad med 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Se Tabell över material. Förvara lösningen vid 4 °C.
  17. Lipopolysackarid gel fläck kit: Se tabell över material.
  18. Bradford reagens: Se tabell över material.
    OBS: Alla lösningar och media bör förberedas inom veckan efter att analysen utförs för att säkerställa konsekventa resultat.

2. Beredning av bakterier för membranutvinning

  1. Streak bakterierna från frysta glycerol lager på färska agar plattor. Förvara plattorna vid 4 °C när kolonier utvecklas. Inokulera en enda koloni i ett 5 ml-rör fyllt med buljongmedia och odla bakterierna som önskas över natten.
  2. Back-späd över natten bakteriell kultur i 1 L av föredragna buljong media och kultur bakterierna tills önskad optisk densitet uppnås.
    OBS: Inokukulera en enda bakteriell koloni i 1 L av buljong media rekommenderas för mutanta genotyper som är benägna att undertrycka tillväxt fenotyper, men vissa Gram-negativa bakterier helt enkelt växa långsammare än andra. Om det inte är möjligt att uppnå en tillräcklig kulturtäthet genom inokulering av en kolonier, är tillbaka spädning en över natten kultur i 1 L av media en strategi för att synkronisera tillväxten. Bakterie-membran sammansättning varierar beroende på tillväxtfasen av kulturen (logaritmisk vs stationär fas)13. Tillväxtkurvor som mäter förändringen i optisk densitet för bakteriekulturerna som en funktion av tiden bör utföras med alla stammar för att korrelera odlingstätheten med tillväxtfasen.
  3. Ställ in flaskorna som innehåller buljongkulturerna på is. Läs den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) och beräkna den kulturvolym som motsvarar mellan 6,0 och 8,0 x 1011 bakteriekolonibildande enheter (cfu). För S. Typhimurium, motsvarar detta till 1 L av kultur på en OD600 av mellan 0.6-0.8, sedan en OD600 av 1.0 är jämbördigt till ungefärligt 1.0x109 cfu/mL. Lägg denna volym till ett centrifugrör och se till att de återstående kulturerna stannar på is tills de ska användas.
  4. Pellet bakterierna genom centrifugering vid 4 °C vid 7 000-10 000 x g i en fast vinkel med höghastighetscentrifug i 10 min.
    OBS: Förkyla och håll centrifugerna vid låg temperatur. Underhåll proverna på is under hela proceduren.
  5. Dekantera och kassera supernatanten försiktigt.
    OBS: Pelleten kan blinkas frusen och/eller förvaras vid -80 °C om membranfraktionerna inte omedelbart kommer att extraheras. Det rekommenderas dock att gå direkt med plasmolys samma dag som cellerna skördas, och rekommenderas särskilt för icke-enterobacterial arter.

3. Dissociation av yttre membranet och Plasmolysis

  1. Tina cellpelletsen på is om de tidigare lagrats vid -80 °C och behåll proverna på is under återstoden av förfarandet. Resuspend varje cell pellet inom centrifugröret i 12,5 ml buffert A. Tillsätt en magnetisk omrörning bar till suspension av celler.
  2. Tillsätt 180 μL 10 mg/ml lysozym (slutlig koncentration på 144 μg/ml) till varje cellåtersuspension. Förvara proverna på is under omrörning i 2 min.
  3. Tillsätt 12,5 ml 1,5 mM EDTA-lösning till varje cellåtersuspension och fortsätt omrörning på is i ytterligare 7 minuter.
  4. Dekantera suspensionen till ett koniskt rör på 50 ml och centrifug vid 9 000-11 000 x g i 10 min vid 4 °C.
  5. Kasta supernatanter i en avfallsbehållare och behåll pelletsen på is.
  6. Tillsätt 25 ml buffert B till cellpelleten.
  7. Tillsätt 55 μL 1 M MgCl2,1 μL Rnase/DNase nuclease reagens (för att undvika viskositetsproblem i samband med bakterier som genomgår plasmolys före homogenisering) och 1 μL proteashämmarecocktail till den mängd buffert B som sitter ovanpå cellpelleten
  8. Resuspend pelleten i bufferten B blandningen. Kraftigt pipet och virvel tills observera en homogen lösning.
    OBS: Det är mycket viktigt att ha en homogen lösning innan man går vidare till steg 4 i detta protokoll. De återsuspenderade cellerna bör ha en trögflytande kaka-smet som utseende och konsistens.
  9. Vortex varje prov för 15 s. Behåll suspensioner på is och gå vidare till steg 4.

4. Trycksatt homogenisering och lys

OBS: Flera metoder kan användas för lysis. Ultraljudsbehandling är inte idealisk på grund av uppkomsten av värme. Osmotisk lys kan uppnås men är ofta ineffektiv. Därför rekommenderar vi högtryckslys. Högtryckslys kan uppnås med hjälp av en mängd olika instrument. Vi föreslår homogeniseringsmaskiner, såsom den franska pressen eller Emusliflex. Vi arbetar med många typer av gramnegativa bakterier vars svar på höga osmolar sackaroslösningar varierar. Högtryckshomogeniseringssteget förbättrar effektiviteten, reproducerbarheten och avkastningen.

  1. Prechill den franska Presscellen vid 4 °C eller sätt in metallspolen från homogenisatormaskinen på is.
  2. Häll provet i den fransktryckscell eller homogenisatorprovscylindern och föra cellen under önskat homogeniseringstryck (10 000 psi bör vara tillräckligt när du använder en fransk press eller 20 000 psi när du använder en homogenisator).
  3. Justera utloppsflödet till cirka ett fall per sekund samtidigt som trycket bibehålls om du använder en fransk press.
  4. Samla cellen lysate i 50 ml koniska rör samtidigt som prover på is.
  5. Upprepa steg 4.2-4.4 tre till fem gånger för att uppnå fullständig lys, vilket vanligtvis indikeras av gradvis ökning av insyn i provet.
    OBS: Provkammaren ska tvättas och jämviktas med buffert B mellan proverna.
  6. Håll lysed celler på is.

5. Totalt membranfraktionering

  1. Centrifugera de lystbakteriella proverna vid 6 169 x g i 10 min vid 4 °C till pelleten förblir intakt cellmaterial. (t.ex. olystbakteriella celler).
  2. Fördela den återstående delen av supernatanten, som nu innehåller de homogeniserade membranen i en polykarbonatflaska för ultracentrifugering.
    VARNING: Vid behov kan cellprover balanseras genom utspädning med buffert B.
  3. Ultracentrifugera cellen lysates vid 184.500 x g i minst 1 h, vid 4 °C. Detta steg kan utföras över natten utan att påverka membranens kvalitet.
  4. Kasta kvarvarande supernatant som finns i ultracentrifugröret och behåll membranpellets på is (figur 1).
  5. Resuspend membranet pellets i 1 ml av låg densitet isopycnic-sackaros gradient lösning med hjälp av en glas-dounce homogenizer. Använd en pastörpipett i glas för att överföra provets homogenat till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och behåll på is.
    OBS: Om endast total analys av membransammansättning önskas, ersätt 1 ml isopycnic-sackaros gradientlösning för 1 ml lagringsbuffert med isolerat membran. Steg 5.5 är slutpunkten för isolering om endast totalbakteriella membranprover önskas. Förvara proverna vid -20 °C tills ytterligare analys nedströms krävs.

6. Densitet Gradient Ultracentrifugering att separera dubbla membran

  1. Samla det lämpliga antalet 13 ml polypropylen eller ultraklara öppna rör som anges för en svängande skopa rotor och ultracentrifug.
  2. Håll röret i ett svagt lutande läge och förbered sackarosgradienten genom att långsamt tillsätta sackaroslösningar från högre densitet till lägre densitet i följande ordning:
    2 ml 73% w/v sackaros,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    4 ml 53% w/v sackaros, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Lägg sedan till den totala membranfraktionen (1 ml), som har återsuspenderats i 20% w/v sackaroslösningen (steg 5.5). Undvik att blanda membranfraktionen med sackaroslösningen som ligger under den. Indelningar bör vara synliga mellan vart och ett av dessa skikt.
    2. Slutligen, fyll röret med den låga densiteten isopycnic-sackaros gradientlösning (ca 6 ml). Polypropylen och ultraklara öppna rör bör fyllas så fulla som möjligt (2 eller 3 mm från rörtoppen) för rörstöd.
  3. Justering för Acinetobacter baumannii 17978
    1. Anpassa en justerad sackaros gradient för användning med olika bakterieprover. För A. baumanniigav följande sackarosgradient mer fullständig separation av membranen (figur 2).
      2 ml 73% w/v sackaros, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 ml 45% w/v sackaros, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Lägg sedan till den totala membranfraktionen (1 ml), som har återsuspenderats i 20% w/v sackaroslösningen (steg 5.5). Undvik att blanda membranfraktionen med sackaroslösningen som ligger under den. Indelningar bör vara synliga mellan vart och ett av dessa skikt.
    3. Slutligen, fyll röret med låg densitet isopycnic-sackaros gradient lösning (ca 6 ml). Polypropylen och ultraklara öppna rör bör fyllas så fulla som möjligt (2 eller 3 mm från rörtoppen) för rörstöd.
  4. Ultracentrifugera proverna med en svängrotor vid 288 000 x g och 4 °C över natten.
    OBS: För de volymer som används i föregående steg rekommenderar vi centrifugeringstider mellan 16 h och 23 timmar.
  5. Kapa änden av en P1000 pipettspets ca 5 mm från punkten. Ta bort det övre bruna SNABB-lagret med pipetten. Överför IM-fraktionen till en polykarbonatflaska för ultracentrifugering.
  6. Lämna ca 2 ml av sackaroslösningen ovanför 53-73% gränssnittet för att säkerställa att den nedre vita OM inte är korsförorenad med IM-fraktionen. Upprepa pipetteringsproceduren från steg 6.4 för OM-fraktionen (bild 1).
    OBS: Membranen kan också samlas in genom att punktera centrifugrören i botten med hjälp av en nål och samla in membranen som fraktioner dropwise.
  7. Fyll det återstående tomrummet av ultracentrifugröret med enstaka membranlagringsbuffert och blanda genom inversion eller pipettering. Behåll proverna på is.
  8. Samla de nu tvättade och isolerade membranen genom ultracentrifugering vid 184 500 x g för 1 h och 4 °C.
  9. Kasta supernatanten och återsuspend membranen genom dounce-homogenisering. Tillsätt 500-1000 μL lagringsbuffert. Samla in prover i 2 ml mikrocentrifugrör.
  10. Förvara bakteriemembranproverna vid -20 °C.

7. Bekräfta separation av bilayers

OBS: Ofullständig separation av bilayers kan uppstå på grund av tekniska fel eller den unika cell kuvert sammansättning av vissa arter. För att bekräfta separation rekommenderar vi att du använder två oberoende analyser för att kvantifiera graden av korskontaminering mellan bilayers. Den första analysen upptäcker den enzymatiska aktiviteten hos NADH dehydrogenas, som finns uteslutande i IM. Den andra analysen detekterar förekomsten av LOS eller LPS, som huvudsakligen finns i OM.

  1. Bekräftar att OEM-datorerna är isolerade från snabbmeddelandena
    1. Mät proteinkoncentrationen i varje isolerad membranfraktion med hjälp av en Bradford proteinanalys.
    2. Tillsätt den mängd prov som motsvarar mellan 50 och 500 μg protein i ett tomt 2 ml mikrocentrifugrör. Koncentrationen varierar beroende på art, men 50 μg är vanligtvis tillräckligt för Enterobacteriaceae. Tillsätt lämplig volym på 10 mM Tris-buffert för att uppnå en total volym på 990 μL. Överför innehållet till en cuvette för spektrofotometri.
    3. Tillsätt 10 μl av en 10 mg/ml-lösning av NADH till provet och mät den ursprungliga absorbansen vid 340 nm.
    4. Fortsätt att mäta absorbansen var 30:e s i 5 min.
    5. Sammanställa data och diagram förändringen i absorbans (y-axeln) jämfört med förändringen i tid (x-axel) för varje membranfraktion (figur 3).
  2. Bekräftar att snabbmeddelandena är isolerade från OEM-datorerna
    1. Tillsätt den mängd prov som motsvarar mellan 50 och 500 μg protein i ett tomt 2 ml mikrocentrifugrör. Koncentrationen varierar beroende på bakterieart, men 50 μg är vanligtvis tillräckligt för Enterobacteriaceae. Fyll på en slutlig volym på 100 μL med fosfatbuffrad koksaltlösning, som nedan kallas vattenfasen.
    2. Tillsätt 5 μl proteinas K (lager 800 U/ml) till vattenfasen och inkubera över natten vid 59 °C.
    3. Värm en 10 ml alikvot trismättad fenol i 10 min vid 68 °C.
    4. Snurra ner vattenfasproverna som behandlades med Proteinas K och tillsätt den "heta" Tris-mättade fenolen i ett 1:1-förhållande med vattenfasen, virveln kraftigt och inkubera vid 68 °C i 10 min.
    5. Överför de nu mjölkvita proverna från 68 °C till ett isvattenbad och inkubera i 10 min.
    6. Centrifugera proverna vid 2 100 x g i 10 min vid 4 °C.
    7. Överför den övre vattenfasen till ett nytt rör och förvara röret vid -20 °C om provet inte ska användas omedelbart.
    8. Späd prover i SDS-lastning buffert och ladda brunnarna i en 4-20% Tris-glycin gradient gel.
    9. Elektrofora i 45 min eller tills färgfronten är längst ner på gelen.
    10. Färga gelen med LPS-färgningssatsen enligt tillverkarens anvisningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna teknik ger ett effektivt sätt att isolera IM och OEM-tillverkare för gramnegativa bakterier. En översikt över hela förfarandet illustreras (figur 1). I allmänhet kommer normalisering av kulturer till en OD600 av 0,6-0,8 i 1 L av media, eller skörd mellan 6,0 och 8,0 x 1011 bakterieceller att säkerställa att lämplig mängd membranmaterial samlas in för efterföljande separation.

Vid lysing av bakterierna och ultracentrifuging av lysate, en klibbig brun totalt membran pellet kommer att synas längst ner i ultracentrifugröret. Efter skrapning, dounce-homogenisering och ultracentrifuging membranet över den diskontinuerliga sackaros densitet gradient, IM och OM bör separeras som avbildas (figur 2). Vi fann att 20%/53%/73% (w / v) sackaros-densitet gradient var otillräcklig för att partitionera kuvertet av A. baumannii, medan en 20% /45%/ 73% w / v lutning var tillräcklig (figur 2).

Olika analysmetoder kan användas för att bedöma kvaliteten och renheten hos varje membranfraktion. NADH-dehydrogenas är ett inre membranenzym som katalyserar NADH oxidation till NAD (figur 3). Med tanke på dess cellulära lokalisering kan den användas för att bestämma korskontaminering mellan IMs och OEM-tillverkare. Enligt absorbansspektra av båda molekylerna, NAD och NADH har vardera en topp absorbans vid 260 nm, medan endast NADH har en maximal absorbans vid 340 nm. En minskning av absorbansen vid 340 nm skulle således tyna på oxidation av NADH till NAD och därmed förekomsten av enzymet i provet. Om membranen separeras ordentligt bör denna förändring av absorbansen endast ske i IM-prover (figur 3). En minskning av absorbansen i OM-prover skulle tyda på korskontaminering med IM-material. För A. baumanniibehövdes tre gånger så mycket membran, eller 150 μg proteinekvivalenter, för att påvisa liknande nivåer av NADH-dehydrogenasaktivitet som vad som mättes för enterobacterialstammarna (figur 3). Därför är det möjligt att nivåerna av NADH oxidas är lägre för A. baumannii eller att den specifika aktiviteten hos enzymet minskar.

Den yttre broschyren av OM består huvudsakligen av LOS eller LPS molekyler. Utvinning av LPS/LOS från IM- och OM-proverna med efterföljande elektrofores och visualisering genom LPS-färgning återspeglar anrikningen av dessa strukturer i OM jämfört med IM-fraktionerna. Syntesen av LOS- och LPS-molekyler börjar i cytoplasma och avslutas vid im5:syta. LOS- och LPS-strukturer transporteras enkelriktat till OM och sätts in i den yttre bipacksedeln. Eftersom biosyntesen innebär prekursortillsättning till IM, observeras alltid ett svagt bandingmönster för IM-fraktionerna. Molekylernas intensitet i OM-fraktionen är dock mycket större än i IM-fraktionen, på grund av anrikningen av LOS/LPS-strukturerna (figur 4). Mängden membran som erhölls mättes genom att bestämma proteinkoncentrationen i suspensionen. Sex gånger mängden membran var nödvändigt att extrahera och upptäcka LOS från A. baumannii jämfört med den mängd som krävs för att upptäcka LPS-molekyler från de enteriska organismerna (figur 4). Vi resonerar att detta kan återspegla en minskad nivå av LOS molekyler i OM för dessa organismer jämfört med proteinnivåer, men har inte eftersträvat denna hypotes i detalj.

Figure 1
Figur 1: En schematisk som visar det gramnegativa bakteriella membranisoleringsförfarande som beskrivs i denna metodartikel. Visas är det förfarande som används för att samla in bakterieceller och isolera den totala, inre (IM), och yttre membran (OM). Metoden bygger på den ökade densiteten hos OM-bilayern för dessa mikrober jämfört med densiteten hos IM-bilayern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat för olika gramnegativa arter vars membran isolerades med hjälp av standard- och de modifierade sackarostäthetsgradienter som beskrivs i denna artikel. Bilder av diskontinuerliga sackarostäthetsgradienter efter isopycnic centrifugering för (A) vildtyp Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s, (B) galE-mutant S. Tyfus LT2, som producerar LPS-molekyler som saknar O-antigener, och (C) Escherichia coli K-12 DH5α, som också producerar LPS-molekyler som saknar O-antigener. Det inre membranet (IM) är separerat från det yttre membranet (OM) och lokaliserar till 20-53% sackaros gränssnitt som ett brunt material. Det vita OM-lagret lokaliserar till 53-73% sackaros gränssnittet på grund av den högre densiteten hos denna fraktion. D) De totala membranen i den vilda Acinetobacter baumanii 17978 separerade inte med 20%/53%/73% (w/v) sackarosgradient,(E)men separerade med hjälp av 20%/45%/73% (w/v) sackarosgradienten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat för NADH-dehydrogenasanalysen för att testa den yttre membranets (OM) renhet. Förekomsten av enzymet, NADH-dehydrogenas, testades i inre (IM) och OM prover för att testa effektiviteten av separationen. (A)Oxidationen av NADH till NAD katalyseras av ett enzym som finns i bakterie-IM. Reaktionssubstratet (NADH) har en maximal absorbans vid 340 nm; Därför tyder en minskning av den optiska densiteten vid denna våglängd på förekomsten av enzymet i provet. Snabbmeddelanden och OEM-tillverkare mättes för(B)vildtyp S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5α och (D) galE-mutant S. Typhimurium. Dessa membran isolerades med hjälp av en isopycnic sackaros densitet gradient av 20%/53%/73% w/v sackaros. För A. baumanniiisolerades membranen med en gradient på 20%/45%/73% w/v sackaros. NADH-analysen för att testa membranens renhet gjordes med hjälp av(E)50 μg för enterobacterialorganismerna och (F) 150 μg av totala proteiner för A. baumannii. En högre koncentration av protein tillsattes i (F), eftersom kurvan för (E) föreslog att de relativa nivåerna av NADH dehydrogenas jämfört med totalt protein var mindre för A. baumannii än för S. Typhimurium och E. coli. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat för LPS- och LOS-extraktions- och visualiseringsproceduren för att testa innermembranets (IM) renhet. Mängden membranprov motsvarande 50 μg totalt protein användes för att extrahera LPS från IM och yttre membran (OM) av S. Typhimurium och E. coli DH5-alfa. Volymen av membranprov motsvarande 300 μg totalt protein användes för att extrahera LPS från membranen i A. baumannii. Volymerna normaliserades till 100 μl med endotoxinfritt vatten och behandlades med Proteinase K. LPS eller LOS extraherades genom varmfenolextraktion (1:1 vatten:fenol) och 21 μl av extrakten lastades på en 4-20% gradient polyakrylamid gel och visualiseras av PRO-Q Emerald 300 färgning för att bedöma korskontaminering av IM fraktioner med OM material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna metod kommer att fortsätta att hjälpa forskare att förstå cellhöljets roll i bakteriell fysiologi och patogenes. Efter de sekventiella ultracentrifugeringsstegen kan en renad total, inre och OM-fraktion erhållas. Dessa membran kan analyseras isolerat för att testa hypoteser relaterade till membranprotein lokalisering och funktion, transport och handel över periplasm, och sammansättningen av de enskilda bilayers under olika miljöförhållanden. Biologiska studier som undersöker enskilda OM-komponenters deltagande i patogenes, såsom LOS/ LPS och OM-proteiner, kan också utföras i djur- och cellmodeller med hjälp av isolerade membranfraktioner som samlats in av denna teknik.

Vår procedur har optimerats för användning med Enterobacteriaceae, specifikt S. Typhimurium, som producerar LPS-molekyler som innehåller O-antigener av variabel kedjelängd. Detta protokoll fungerar också för modellbakterien, E. coli K-12, som har förlorat den genetiska förmågan att syntetisera O-antigener. Använda vild typ och O-antigen bristfällig S. Typhimurium 14028s och E. coli K-12 stam DH5α, visar vi att förmågan att separera membranen för dessa mikrober inte påverkas väsentligt av förekomsten av O-antigener. Men för att separera kuvertet av den LOS-producerande bakterien, A. baumannii 17978, var vi tvungna att minska koncentrationen av den mellersta densitet sackaroslösningen i den diskontinuerliga lutningen för att isolera bilayers (figur 2). I synnerhet var det tillräckligt att flytta koncentrationen av mellandensitetslösningen från 53 till 45 % för att om-delningen skulle kunna partitioneras till gränssnittet på 45–73 % i den anpassade lutningen. Vid användning av lutningen på 53–73 % för A. baumanniiobserverades ofta majoriteten av OM-materialet något under IM-fraktionen vid gränssnittet 20–53 % (figur 2). Sparse OM material var närvarande vid 53-73% gränssnitt för A. baumannii. Dessa resultat tyder på att lutningen på 20%/53%/73% är otillräcklig för att separera bilayers av A. baumannii under dessa förhållanden.

Sammanfattningsvis kan justeringar göras av densitetsgradienten för att rymma organismer med varierad OM-glykolipidhalt och nivå, och metoden kan anpassas för andra gramnegativa bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av P20GM10344 och R01AI139248 tilldelas Z. D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
Separation av cellhöljet för gramnegativa bakterier i inre och yttre membranfraktioner med tekniska justeringar för <em>Acinetobacter baumannii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter