Summary

Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii

Published: April 10, 2020
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Summary

Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes spatialement séparées. La membrane externe est divisée de la membrane interne par un périplasme et une couche peptidoglycan. La capacité d’isoler les bilayers doubles de ces microbes a été critique pour comprendre leur physiologie et leur pathogénie.

Abstract

Cette méthode fonctionne en cédant l’enveloppe des bactéries Gram-négatives en fractions totales, intérieures et externes de membrane (OM) et se termine par des essais pour évaluer la pureté des bilayers. L’OM a une densité globale accrue par rapport à la membrane interne, en grande partie en raison de la présence de lipooligosaccharides (LOS) et lipopolysaccharides (LPS) dans le tract externe. Les molécules DE et LPS sont des glycolipids amphipathiques qui ont une structure similaire, qui se compose d’un lipide-A disaccharolipid et noyau-oligosaccharide substituent. Cependant, seules les molécules de LPS sont décorées d’un troisième sous-unité connu sous le nom d’O-polysaccharide, ou O-antigène. Le type et la quantité de glycolipids présents auront un impact sur la densité omombre d’un organisme. Par conséquent, nous avons testé si les membranes des bactéries à faible teneur en glycolipid pourraient être également isolées à l’aide de notre technique. Pour les organismes producteurs de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium et Escherichia coli, les membranes étaient facilement isolées et la meety LPS O-antigène n’a pas eu d’impact sur le partitionnement des bilayer. Acinetobacter baumannii produit des molécules DE, qui ont une masse similaire aux molécules de LPS déficientes en O-antigène; cependant, les membranes de ces microbes n’ont pas pu être séparées au départ. Nous avons raisonné que l’OM d’A. baumannii était moins dense que celui d’Enterobacteriaceae, de sorte que le gradient de saccharose a été ajusté et les membranes ont été isolées. La technique peut donc être adaptée et modifiée pour une utilisation avec d’autres organismes.

Introduction

Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes qui sont séparées par un espace périplasmique et une paroi de cellules peptidoglycanes1. La membrane interne (IM) enveloppe le cytosol et est un bilayer symétrique de phospholipides. Peptidoglycan protège contre la pression turgor et fournit la bactérie avec une forme cellulaire, et est attaché à la membrane externe (OM) par les lipoprotéines2,3. L’OM entoure le périplasme et est principalement asymétrique. Le dépliant intérieur se compose de phospholipides et le dépliant externe se compose de glycolipids connus sous le nom lipooligosaccharides (LOS) ou lipopolysaccharides (LPS)4,5. L’asymétrie lipidique et la biochimie des molécules LOS/LPS dans le dépliant externe confèrent des propriétés de barrière à la surface cellulaire qui protègent la bactérie contre les dangers dans son environnement6,7.

Les molécules de LPS sont composées de trois constituants : le lipide A disaccharolipid, l’oligosaccharide de noyau, et l’O-polysaccharide ou O-antigène. Lipid A est une dispersion acylée. Les core-oligosaccharides sont composés de 10 à 15 sucres connus sous le nom de LPS brut ou R-LPS. Le noyau est subdivisé dans la région intérieure, composé de 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonique acide (kdo) et un ou plusieurs résidus d’heptose, et une région extérieure qui se compose généralement d’hexoses (glucose ou galactose) et heptoses, ou sucres d’acétalo5. La région du noyau extérieur est plus variable dans ses composants et sa structure que le noyau intérieur. Dans Salmonella spp., une seule structure centrale a été décrite; cependant, à Escherichia coli il existe cinq structures de base différentes (désignées K-12, R1, R2, R3 et R4)8. E. coli K-12 DH5, que nous utilisons dans cette procédure porte une mutation qui se traduit par la production R-LPS9. Les molécules R-LPS n’ont pas la moiety O-antigène et ont un poids moléculaire similaire aux molécules de LOS.

L’ajout d’O-antigène à R-LPS transforme cette molécule en LPS lisse, ou S-LPS. Les O-antigènes sont construits à partir de sous-unités courtes de 3-4 hydrates de carbone et se composent de multiples modalités avec des longueurs de chaîne variables10. Certaines bactéries productrices de LPS, comme Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), afficher une distribution trimodale de molécules LPS sur leur surface10,11. La chaîne très longue O-antigènes peut contenir plus d’une centaine de sous-unités et peser plus d’une centaine de kilodaltons. Les O-antigènes fournissent des propriétés de surface à la bactérie qui sont nécessaires pour résister aux antibiotiques, échapper à la prédation par bactériophages, et causer des maladies.

Espèces de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria et d’autres génèrent des molécules los LOS au lieu de molécules LPS sur leur surface12. Les molécules de LOS se composent des lipides A et des oligosaccharides de noyau mais n’ont pas l’O-antigène. Ces types de bactéries Gram-négatives modifient leurs oligosaccharides de base avec des sucres supplémentaires et des combinaisons de sucres pour modifier les propriétés de surface12. Les microbes DE LOS et de LPS-producteurs dérivatisent les phosphates sur les molécules de lipide A et de noyau avec des moieties cationiques7. Ces ajouts incluent la phosphoethanolamine, la galactosamine et les substitutions d’aminoarabinose, qui fonctionnent en neutralisant la charge de surface anionique et protégeant ainsi contre les peptides antimicrobiens cationiques. Les bactéries gram-négatives modifient également la structure d’oligosaccharide de noyau avec des substitutions non-stoichiométriques variables des sucres, ou molécules de kdo supplémentaires, et modifient le nombre de chaînes d’acyl sur les désaccharolipids lipidiques-A7.

La capacité d’isoler la GI de l’OM des bactéries Gram-négatives a été déterminante pour comprendre le rôle de l’enveloppe cellulaire dans la résistance aux antimicrobiens et la pathogénie des maladies11,12. Les dérivations de cette approche ont été utilisées pour déduire les mécanismes d’assemblage, d’entretien et de remodelage des constituants de protéines, de phospholipides et de glycolipid pour l’OM.

Notre laboratoire effectue régulièrement des analyses lipidiques bactériennes pour étudier la régulation lipidique et la fonction lipidique à médiation protéique chez une variété d’espèces Gram-négatives. Les volumes utilisés dans le protocole reflètent l’utilisation systématique de cette procédure pour analyser les phospholipides non radiolacés par la chromatographie à couches minces et la spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide13,14.

Le protocole commence par exposer une suspension réfrigérée des bactéries Gram-négatives à une solution osmolar élevée de saccharose et en ajoutant du lysozyme pour dissocier l’OM de la couche peptidoglycane sous-jacente(figure 1)12. EDTA est ensuite ajouté pour faciliter la pénétration du lysozyme, puisque la séquestration de cation divalente perturbe les interactions latérales de pontage électrostatique entre les molécules adjacentes DE/LPS15. Le protocole original à partir duquel le nôtre a été adapté a nécessité la formation de sphéoplastes, une forme de cellules bactériennes Gram-négative qui se composent d’une membrane plasmatique et d’un cytosol, mais qui n’a pas la couche peptidoglycan et un OM. Il est possible que les sphéoplastes soient produites par la méthode adaptée ; cependant, la technique ne repose pas ou n’a pas l’intention de leur formation pour le succès. Au lieu de cela, les bactéries traitées à la lysozyme-EDTA sont rapidement récoltées par centrifugation et réendées dans une solution saccharose de moindre concentration avant une lyse pressurisée. Les OM qui auraient pu être libérés en formant des sphéroplastes devraient en théorie être récoltables des supernatants des cellules traitées, mais cette approche n’est pas détaillée dans les présentes. En fin de compte, les cellules traitées sont soumises à l’homogénéisation conventionnelle et la lyse, ce qui améliore l’efficacité et la reproductibilité de la procédure de séparation de la membrane16.

Après la lyse, les membranes totales sont collectées par ultracentrifugation et appliquées à un gradient discontinu de densité de saccharose pour fractionner les IM et les OM. L’approche classique utilise un gradient plus continu qui se compose d’au moins cinq solutions de saccharose différentes11,12. Le gradient discontinu dans notre protocole se compose de trois solutions de saccharose et divise les bilayers en deux fractions distinctes17. Les molécules DE et LPS dans les OM des bactéries Gram-négatives conduisent l’enveloppe à se cloisonner en une fraction de QNI brune supérieure de basse densité et une fraction blanche inférieure d’OM à haute densité(figure 1 et figure 2).

Acinetobacter baumannii sont d’importants agents pathogènes humains multirésistants qui produisent des molécules de LOS dans leur OM et érigent une enveloppe cellulaire qui est difficile à séparer18,19. Des travaux récents suggèrent qu’une dérivation du protocole que nous présentons ici peut être utilisée pour diviser les bilayers de ces organismes20. Par conséquent, nous avons testé notre protocole sur A. baumannii 17978. Au départ, la procédure était inadéquate. Cependant, nous avons modifié la concentration de saccharose de la solution de densité moyenne et la séparation grandement améliorée(figure 2). Un essai de déshydrogénase NADH et une procédure d’extraction et de détection DE LOS/LPS ont été utilisés pour confirmer la séparation pour A. baumannii, de type sauvage S. Typhimurium et deux génotypes entérobactériens déficients en oegène; à savoir, galE-mutant S. Typhimurium et une souche de laboratoire, E. coli DH5MD(figure 3 et figure 4).

L’objectif de ce travail est de fournir une approche rationalisée pour isoler de façon reproductrice les membranes des bactéries Gram-négatives. Le protocole peut être utilisé pour étudier de nombreux types de molécules associées à la membrane pour ces microbes.

Protocol

1. Réagents généraux et préparation des médias pour l’extraction de membrane Médias de croissance bactérienne : Préparer et stériliser 1 L de supports de bouillon dans un flacon de 2 L bien nettoyé et autoclavé. Tampon de résuspension générale (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissoudre 6,05 g de base Tris en 30 mL de H2O. Ajuster pH à 7,5 avec 5 M HCl. Ajuster le volume final à 50 mL avec ultrapure H2O. Stock de 100 mL: Ajouter 18,6 g d’éthylène t?…

Representative Results

Cette technique fournit un moyen efficace d’isoler les IM et les OM pour les bactéries Gram-négatives. Un aperçu de l’ensemble de la procédure est illustré(figure 1). En général, la normalisation des cultures à un OD600 de 0,6-0,8 dans 1 L des médias, ou la récolte entre 6,0 et 8,0 x 1011 cellules bactériennes assurera que la quantité appropriée de matériel membranaire est recueillie pour la séparation ultérieure. En lysan…

Discussion

Cette méthode continuera d’aider les chercheurs à comprendre le rôle de l’enveloppe cellulaire dans la physiologie bactérienne et la pathogénie. Suite aux étapes séquentielles d’ultracentrifugation une fraction totale, intérieure et OM purifiée peut être obtenue. Ces membranes peuvent être analysées isolément pour tester les hypothèses liées à la localisation et à la fonction des protéines membranaires, au transport et au trafic à travers le périplasme, et à la composition des bicoussards indiv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par P20GM10344 et R01AI139248 attribués à Z. D. Dalebroux.

Materials

1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 – IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma – Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

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