Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Separation av cellhöljet för gramnegativa bakterier i inre och yttre membranfraktioner med tekniska justeringar för Acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Gramnegativa bakterier producerar två rumsligt segregerade membran. Det yttre membranet är partitionerat från det inre membranet av en periplasm och ett peptidoglykanlager. Förmågan att isolera de dubbla bilayers av dessa mikrober har varit avgörande för att förstå deras fysiologi och patogenes.
Transcript
Studera hur mikrober reglerar den kemiska sammansättningen av de enskilda bilayers kommer att informera vår kunskap om mekanismer för antibiotika dödande, antimikrobiell resistens och sjukdom patogenes. Denna teknik partitionerar cellkuvertet av gramnegativa bakterier i två definierade fraktioner utan att använda tvättmedel. Därför kan lipiderna, proteinerna och sockerarterna bedömas i en miljö som är delvis infödd.
Några av stegen är tidsberoende och kräver fokus och samordning. Använd initialt ett eller två stickprov. När ens komfortnivå ökar kan fler prover tillsättas.
Högst sex prover bör hanteras på en gång. Detta är en flera dagars förfarande och visuella kontrollpunkter är till hjälp för att bedöma effekt och fel. Innan du utför detta ibland sista steg.
Strimma bakterierna från frysta glycerollager på färska agarplattor. När kolonier utvecklas, lagra plattorna på fyra grader Celsius. Använd en enda koloni för att inokulera ett fem milliliterrör fyllt med buljongmedia och odla bakterierna som önskas över natten.
Tillbaka späda över natten bakteriekulturen i en liter av den föredragna buljong media och inkubera kolvarna. När önskad optisk densitet har uppnåtts, avlägsna kolvarna från inkubatorn och placera dem på is. Mät kulturens optiska densitet vid 600 nanometer och beräkna kulturens volym som motsvarar mellan sex och åtta gånger 10 till de elfte bakteriekolonibildande enheterna.
Lägg till denna kulturvolym till ett centrifugrör och se till att de återstående kulturerna stannar kvar på is tills de ska användas. Pellet bakterierna genom centrifugering i 10 minuter ina en fast vinkel, hög hastighet centrifug vid 7, 000 till 10, 000 gånger G och fyra grader Celsius. Försiktigt dekantera supernatanten och kassera den.
Resuspend varje cell pellet i 12,5 milliliter buffert A.Lägg till en magnetisk rör bar till cellen suspension. Tillsätt 180 mikroliter på 10 milligram per milliliterlysozym till varje cell återfpension. Efter att ha samlat lysozym EDTA behandlade bakterier genom centrifugeringen, tillsätt snabbt proteashämmare, magnesiumklorid och nukleas till bakterierna och snabbt återanvända cellerna i buffert B.Stir i två minuter, hålla suspensionerna på is.
Därefter lägger du till 12,5 milliliter på 1,5 millimolar EDTA-lösning till varje cell återupphängning och fortsätt röra om på is i ytterligare sju minuter. Dekantera suspensionerna i 15 milliliter koniska rör. Centrifugera suspensionerna vid 9, 000 till 11, 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.
Kasta supernatanterna i en behållare för biologiskt avfall och behåll pelletsen på is. Lägg till 25 milliliter buffert B till varje cellpellet. Tillsätt sedan 55 mikroliter av en molar magnesiumklorid, en mikroliter av rnase/dnase/nukleasreagens och en mikroliter av proteashämmare cocktail.
Resuspend pellets i blandningen. Kraftigt pipetter och virvel tills lösningarna verkar homogena. Förvara suspensionerna på is.
Häll provet i homogenisapelsprov cylinder och föra cellen till 20, 000 PSI. För att undvika aerosolisering av patogener, villkora den trycksatta apparaten i buffert B och justera trycknivåerna innan du tillsätter bakteriell suspension. Koppla in tryckcellen och anspela på 10 milliliter buffert B som en försiktighetsåtgärd.
Samla cellen lysate i 50 milliliter koniska rör på is samtidigt som proverna på is. För att uppnå fullständig lys, upprepa denna process tre till fem gånger. Att pelleta de återstående, intakta, cellmaterial, centrifug de lyst bakterieprover på 6, 169 gånger G och fyra grader Celsius i 10 minuter.
Fördela supernatanterna som nu innehåller de homogeniserade membranen, till polykarbonatflaskor för ultracentrifugering. Ultracentrifug cellen lysates på 184, 500 gånger G och fyra grader Celsius i minst en timme. Kassera supernatanterna och behåll membranpelletsen på is.
Med hjälp av ett glas, Dounce homogenisator, återanvända membranet pellets i en milliliter av den lågdensitet isopycnic sackaros gradient lösning. Använd sedan ett glas, Pasteurpipett för att överföra provet homogenate till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och placera röret på is. För att förbereda sackarosgradienten håller du ett polypropylen eller Ultra-klart Open-Top-rör i ett svagt lutat läge.
Tillsätt långsamt två milliliter av den högre densitet sackaroslösningen. Tillsätt sedan fyra milliliter av den lägre densitet sackaroslösningen. När du förbereder densitetsgradienten, tillsätt sackaroslösningen långsamt för att undvika att blanda lagren.
Sackaroslagren bör vara något synliga och visas allmänt definierade. Därefter lägger du till den totala membranfraktionen som tidigare var återsuspendad i en milliliter med låg densitet, isopycnic sackaroslösning. Slutligen fylla återstoden av röret genom att lägga till cirka sex milliliter av den låga densiteten, isopycnic sackaros gradient lösning.
Ultracentrifugera proverna med hjälp av en svängande bucket rotor på 288, 000 gånger G och fyra grader Celsius i 16 till 23 timmar. Klipp av änden från en P1000 pipett spets cirka fem milliliter från punkten. Efter centrifugeringen är klar, använd pipetten för att ta bort det övre, bruna skiktet från röret.
Överför detta skikt, som innehåller den inre membranfraktionen, till en polykarbonatflaska för ultracentrifugering. Lämna ca två milliliter av sackaroslösningen ovanför gränssnittet mellan 53%sackaros och 73%sackaros för att säkerställa att den nedre, vita, yttre membranfraktionen inte korsar förorenar den inre membranfraktionen. Återigen med hjälp av en P1000 pipett spets med slutet bort, ta bort det yttre membranskiktet och överföra den till en polykarbonat flaska.
Fyll återstående tomrum av polykarbonatflaska med isolerad membranlagringsbuffert och blanda genom inversion eller pippetting. Behålla proverna på is. För att samla membranen, ultracentrifug polykarbonatflaskorna vid 184, 500 gånger G och fyra grader Celsius i en timme.
Slutligen, kassera supernatanterna och tillsätt 500 till 1, 000 mikroliter lagringsbuffert. Resuspend membranen genom Dounce homogenisering. Samla in proverna i två milliliter mikrocentrifugrör.
Totala membran pellets skrapades, Dounce homogeniserade och ultracentrifuged över sackaros densitet lutningar för att separera de inre och yttre membran. En sackaros densitet gradient på 20%53%73%var tillräcklig för att partitionera vissa bakteriestammar. Men inte för partitionering A.baumannii som framgångsrikt delades med hjälp av en 20%45%73%-gradient.
För att bedöma effektiviteten hos separationen testades membranprover för NADH-dehydrogenas, ett enzym som ligger i det bakteriella innermembranet. En minskning av optisk densitet vid 340 nanometer indikerade närvaron av enzymet. Optisk densitet mättes för 50 mikrogram prover av inre och yttre membran fraktioner från vilda typ S.typhimurium, E.coli K12 DH5a och galE mutant S.typhimurium.
En högre koncentration av protein tillsattes när assaying renheten hos A.baumannii membran fraktioner eftersom en inledande analys med hjälp av 50 mikrogram föreslog att de relativa nivåerna av NADH dehydrogenas var lägre för A.baumannii än för de andra bakteriestammar. För att bedöma korskontaminering av de inre membranfraktionerna med yttre membranfraktioner extraherades och visualiserades LPS och LOS. Extrakten lastades på en polyakrylamid gel och färgas med Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii är en högsta prioritet, multi läkemedelsresistenta, mänskliga patogener. Detta protokoll bör stöd forskare i att förstå roller lipooligosackarider, fosfolipider och lipoproteiner i resistens och virulens mekanismer av denna unika och viktiga patogen. Denna metod är idealisk för nedströms analys av fosfolipider, glykopids kolhydrater, proteiner och små molekyler som vanligtvis finns inom de dubbla membranen av gramnegativa bakterier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
