एसिनेटोबैक्टर बौमैनी के लिए तकनीकी समायोजन के साथ इनर और बाहरी झिल्ली अंशों में ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए सेल लिफाफे का पृथक्करण
Summary
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दो स्थानिक रूप से अलग झिल्ली का उत्पादन करते हैं। बाहरी झिल्ली को आंतरिक झिल्ली से एक परिधीय और पेप्टिडोग्लिकन परत द्वारा विभाजित किया जाता है। इन रोगाणुओं के दोहरे बाइलेयर को अलग करने की क्षमता उनके शरीर विज्ञान और रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रही है।
Abstract
यह विधि ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिफाफे को कुल, आंतरिक और बाहरी झिल्ली (ॐ) अंशों में विभाजित करके काम करती है और बाइलेयर की शुद्धता का आकलन करने के लिए परखों के साथ समाप्त होती है। ओम में आंतरिक झिल्ली की तुलना में समग्र घनत्व में वृद्धि हुई है, मुख्यतः बाहरी पत्रक के भीतर लिपूलीगोसैकराइड्स (एलओएस) और लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) की उपस्थिति के कारण। लॉस और एलपीएस अणु एम्फीपैथिक ग्लाइकोलिपिड होते हैं जिनमें एक समान संरचना होती है, जिसमें लिपिड-ए अलग-अलग और कोर-ओलिगोसाक्राइड प्रतिस्थापन होते हैं। हालांकि, केवल एलपीएस अणुओं को ओ-पॉलीसैकराइड, या ओ-एंटीजन के रूप में जाना जाता है एक तीसरी उपइकाई के साथ सजाया जाता है। मौजूद ग्लाइकोलिपिड का प्रकार और मात्रा किसी जीव के ओम घनत्व को प्रभावित करेगी। इसलिए, हमने परीक्षण किया कि क्या विभिन्न ग्लाइकोलिपिड सामग्री वाले बैक्टीरिया की झिल्ली को हमारी तकनीक का उपयोग करके इसी तरह अलग किया जा सकता है। एलपीएस उत्पादक जीवों, साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम और एस्चेरिचिया कोलाईके लिए, झिल्ली आसानी से अलग-थलग पड़ गई थी और एलपीएस ओ-एंटीजन मोईटी ने बाइलेयर विभाजन को प्रभावित नहीं किया। एसिनेटोबैक्टर बौमैनी लॉस अणुओं का उत्पादन करता है, जिसमें ओ-एंटीजन की कमी वाले एलपीएस अणुओं का समान द्रव्यमान होता है; हालांकि, इन रोगाणुओं की झिल्ली को शुरू में अलग नहीं किया जा सका। हमने तर्क दिया कि ए बौमनी का ओम एंट्रोबैक्टीरिया की तुलना में कम घना था, इसलिए सुक्रोज ढाल को समायोजित किया गया और झिल्ली अलग-थलग पड़ गई। इसलिए तकनीक को अन्य जीवों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है।
Introduction
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दो झिल्ली का उत्पादन करते हैं जो एक परिपिलेमिक स्थान और पेप्टिडोग्लिकन सेल दीवार1से अलग होते हैं। आंतरिक झिल्ली (आईएम) साइटोसोल को घेरती है और फॉस्फोलिपिड का एक सममित बाइलेयर है। पेप्टिडोग्लिक्स टर्गोर दबाव से बचाता है और जीवाणु को कोशिका आकार प्रदान करता है, और लिपोप्रोटीन2,,3द्वारा बाहरी झिल्ली (ओम) से जुड़ा होता है। ॐ परिसिपल को घेरे हुए है और मुख्य रूप से असममित है। आंतरिक पत्रक में फॉस्फोलिपिड होते हैं और बाहरी पत्रक में ग्लाइकोलिपिड होते हैं, जिसे लिपूलिगोसैकराइड्स (एलओएस) या लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस)4,,5के रूप में जाना जाता है। लिपिड विषमता और बाहरी पत्रक में लॉस/एलपीएस अणुओं की जैव रसायन कोशिका सतह को बाधा गुण प्रदान करता है जो जीवाणु को अपने पर्यावरण6,7में खतरों से बचाता है ।
एलपीएस अणुओं में तीन घटक शामिल हैं: लिपिड ए डिसैचरोलिपिड, कोर ओलिगोसाक्धारी, और ओ-पॉलीसैकराइड या ओ-एंटीजन। लिपिड ए एक गुणा acylated disaccharolipid है। कोर-ओलिगोसैकराइड्स में 10-15 शर्करा होती है जिसे रफ एलपीएस या आर-एलपीएस के नाम से जाना जाता है। कोर को आंतरिक क्षेत्र में विभाजित किया गया है, जो 2-कीटो-3-डिऑक्सी-डी-मैनो-ऑक्टुलोसोनिक एसिड (केडीओ) और एक या अधिक हेपेटोज अवशेषों से बना है, और एक बाहरी क्षेत्र जिसमें आम तौर पर हेक्सोज़ (ग्लूकोज या गैलक्टोज) और हेपेटोस, या एसीटामिडो शर्करा5शामिल हैं। बाहरी कोर क्षेत्र आंतरिक कोर की तुलना में इसके घटकों और संरचना में अधिक परिवर्तनशील है। साल्मोनेला sppमें, केवल एक कोर संरचना का वर्णन किया गया है; हालांकि, एस्चेरिचिया कोलाई में पांच अलग-अलग कोर संरचनाएं (नामित K-12, R1, R2, R3, और R4)8हैं। ई. कोलाई कश्मीर-12 DH5α, जो हम इस प्रक्रिया में उपयोग एक उत्परिवर्तन है कि उत्पादन आर एलपीएस9में परिणाम किया जाता है । आर-एलपीएस अणुओं में ओ-एंटीजन मोईटी की कमी होती है और लॉस अणुओं के समान आणविक वजन होता है ।
आर-एलपीएस के लिए ओ एंटीजन के अलावा चिकनी एलपीएस, या एस एलपीएस में इस अणु बदल जाता है । ओ-एंटीजन छोटे 3-4 कार्बोहाइड्रेट उपइकाइयों से बनाए जाते हैं और इसमें अलग-अलग चेन लम्हों10के साथ कई तौर-तरीके शामिल होते हैं। कुछ एलपीएस उत्पादक बैक्टीरिया, जैसे साल्मोनेला आंत्रिका सेरोवर टाइथिमुरियम(एस। टाइपिमुरिनियम,10,11की सतह पर एलपीएस अणुओं का एक त्रिमंडल वितरण प्रदर्शित करता है। बहुत लंबी श्रृंखला ओ-एंटीजन में एक सौ से अधिक उपइकाइयां हो सकती हैं और एक सौ किलोसे अधिक वजन हो सकती हैं। ओ-एंटीजन जीवाणु को सतह गुण प्रदान करते हैं जो एंटीबायोटिक दवाओं का विरोध करने, बैक्टीरियोफेज द्वारा पर्प्रिशन से बचने और बीमारी का कारण बनने के लिए आवश्यक हैं।
कैम्पिलोबैक्टर, बोर्डेटेला, एसिनेटोबैक्टर, हीमोफिलस, नेसेरिया और अन्य की प्रजातियां12की सतह पर एलपीएस अणुओं के बजाय लॉस अणु उत्पन्न करती हैं । लॉस अणुओं लिपिड ए और कोर ओलिगोसैकराइड्स से मिलकर बनता है लेकिन ओ-एंटीजन की कमी है। इस प्रकार के ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया अपने कोर ओलिगोसैकराइड्स को अतिरिक्त शर्करा और शर्करा के संयोजन के साथ सतह गुणों को बदलने के लिए संशोधित करते हैं12। लॉस और एलपीएस-उत्पादक रोगाणु दोनों लिपिड ए और कोर अणुओं पर फॉस्फेट को सीनिक मोईकेट्स7के साथ प्राप्त करते हैं। इन परिवर्धन में फॉस्फोथेनॉलमाइन, गैलेक्टोसामाइन और अमीनोराबिनोज प्रतिस्थापन शामिल हैं, जो एनीनिक सतह आवेश को बेअसर करके कार्य करते हैं और इस तरह सीनिक एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स से रक्षा करते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया शर्करा, या अतिरिक्त केडो अणुओं के चर गैर-स्टोइचियोमेट्रिक प्रतिस्थापन के साथ कोर ओलिगोसैक्राइड संरचना को भी संशोधित करते हैं, और लिपिड-ए डिचरोलिपिड्स7पर एसीसाइल चेन की संख्या को बदल देते हैं।
आईएम को ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के ॐ से अलग करने की क्षमता रोगाणुरोधी प्रतिरोध और रोगरोगजनक1111,12में कोशिका लिफाफे की भूमिका को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । इस दृष्टिकोण के व्युत्पन्नका का उपयोग ओम के लिए असेंबली, रखरखाव और प्रोटीन, फॉस्फोलिपिड और ग्लाइकोलिपिड घटकों के तंत्र को कम करने के लिए किया गया है।
हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से ग्राम-नकारात्मक प्रजातियों की एक किस्म में प्रोटीन मध्यस्थता लिपिड विनियमन और लिपिड समारोह का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरियल लिपिडोमिक विश्लेषण करती है । प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली मात्रा पतली परत क्रोमेटोग्राफी और तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेमरी13,,14द्वारा गैर-रेडियोलेबल फॉस्फोलिपिड का विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया के नियमित उपयोग को दर्शाती है।
प्रोटोकॉल ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के एक ठंडा निलंबन को सुक्रोज के उच्च ओस्मोलर समाधान के लिए उजागर करने और अंतर्निहित पेप्टिडोग्लिकन परत(चित्र ा 1)12से ओम को अलग करने के लिए lysozyme जोड़ने से शुरू होता है । इसके बाद EDTA को lysozyme के प्रवेश की सुविधा के लिए जोड़ा जाता है, क्योंकि डाइवेलेंट cation ज़ब्ती आसन्न लॉस/एलपीएस अणुओं15के बीच पार्श्व इलेक्ट्रोस्टैटिक ब्रिजिंग इंटरैक्शन को बाधित करता है । मूल प्रोटोकॉल जिसमें से हमारा अनुकूलित किया गया है, वह स्पेरोप्लास्ट के गठन की आवश्यकता है, एक ग्राम-नकारात्मक जीवाणु कोशिका रूप जिसमें प्लाज्मा झिल्ली और साइटोसोल शामिल है, लेकिन पेप्टिडोग्लिकन परत और एक ओम का अभाव है। यह संभव है कि गोलाकार अनुकूलित विधि द्वारा उत्पादित किए जाते हैं; हालांकि, तकनीक सफलता के लिए उनके गठन पर भरोसा या इरादा नहीं है। इसके बजाय, lysozyme-EDTA इलाज बैक्टीरिया तेजी से केंद्रीकरण द्वारा काटा जाता है और दबाव lysis से पहले कम एकाग्रता के एक सुक्रोज समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाता है । ओएमएस जो स्पॉरोप्लास्ट बनाकर जारी किया गया हो सकता है, सिद्धांत रूप में इलाज कोशिकाओं के सुपरनेटेंट से कटाई योग्य होना चाहिए, लेकिन यह दृष्टिकोण यहां विस्तृत नहीं है। अंततः, उपचारित कोशिकाओं को पारंपरिक समरूपता और लिसिस के अधीन किया जाता है, जो झिल्ली पृथक्करण प्रक्रिया16की दक्षता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है।
लिसिस के बाद, कुल झिल्ली अल्ट्रासेंट्रोफैगेशन द्वारा एकत्र की जाती है और आईएमएस और ओएमएस को आंशिक करने के लिए एक असतत सुक्रोज घनत्व ढाल पर लागू होती है। शास्त्रीय दृष्टिकोण में अधिक निरंतर ढाल का उपयोग किया जाता है जिसमें कम से कम पांच विभिन्न सुक्रोज समाधान होते हैं11,12. हमारे प्रोटोकॉल में असतत ढाल में तीन सुक्रोज समाधान होते हैं और बिलेयरों को दो अलग अंशों में विभाजित किया जाता है17। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के ओएमएस के भीतर लॉस और एलपीएस अणु लिफाफे को एक ऊपरी भूरे रंग के कम घनत्व आईएम अंश और एक कम सफेद उच्च घनत्व ओम अंश(चित्रा 1 और चित्रा 2)में विभाजित करने के लिए ड्राइव करते हैं।
एसिनेटोबैक्टर बौमैनी महत्वपूर्ण मल्टीड्रग प्रतिरोधी मानव रोगजनक हैं जो अपने ओम में लॉस अणुओं का उत्पादन करते हैं और एक कोशिका लिफाफा खड़ा करते हैं जिसे18,19को अलग करना मुश्किल होता है । हाल के कार्य से पता चलता है कि हम यहां मौजूद प्रोटोकॉल के एक व्युत्पन्न का उपयोग इन जीवों के बाइलेयर ों को20के विभाजित करने के लिए किया जा सकता है । इसलिए, हमने ए बौमनी 17978 पर अपने प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। प्रारंभ में प्रक्रिया अपर्याप्त थी। हालांकि, हमने मध्य घनत्व समाधान की सुक्रोज एकाग्रता को संशोधित किया और बहुत बेहतर अलगाव(चित्रा 2)। एक NADH dehydrogenase परख और एक लॉस/एलपीएस निष्कर्षण और पता लगाने की प्रक्रिया ए baumannii,जंगली प्रकार एस के लिए जुदाई की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । टाइथिमुरियाम और दो ओ-एंटीजन की कमी आंत्रजीवाणु जीनोटाइप; अर्थात्, गाले-उत्परिवर्ती एस. Typhimurium और एक प्रयोगशाला तनाव, ई. कोलाई DH5α(चित्रा 3 और चित्रा 4)।
इस काम का उद्देश्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की झिल्ली को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण की आपूर्ति करना है। प्रोटोकॉल का उपयोग इन रोगाणुओं के लिए कई प्रकार के झिल्ली से जुड़े अणुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि बैक्टीरियल फिजियोलॉजी और रोगजनन में सेल लिफाफे की भूमिका को समझने में शोधकर्ताओं की सहायता जारी रखेगी। अनुक्रमिक अल्ट्रासेंट्रोइफिज़न के बाद एक शुद्ध कुल, आंतरिक और ओम अंश प्राप्त किया जा सक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पी 20GM10344 और R01AI139248 द्वारा जेड डी डेलब्रोक्स को सम्मानित किया गया था।
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
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