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Immunology and Infection

Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes spatialement séparées. La membrane externe est divisée de la membrane interne par un périplasme et une couche peptidoglycan. La capacité d’isoler les bilayers doubles de ces microbes a été critique pour comprendre leur physiologie et leur pathogénie.

Abstract

Cette méthode fonctionne en cédant l’enveloppe des bactéries Gram-négatives en fractions totales, intérieures et externes de membrane (OM) et se termine par des essais pour évaluer la pureté des bilayers. L’OM a une densité globale accrue par rapport à la membrane interne, en grande partie en raison de la présence de lipooligosaccharides (LOS) et lipopolysaccharides (LPS) dans le tract externe. Les molécules DE et LPS sont des glycolipids amphipathiques qui ont une structure similaire, qui se compose d’un lipide-A disaccharolipid et noyau-oligosaccharide substituent. Cependant, seules les molécules de LPS sont décorées d’un troisième sous-unité connu sous le nom d’O-polysaccharide, ou O-antigène. Le type et la quantité de glycolipids présents auront un impact sur la densité omombre d’un organisme. Par conséquent, nous avons testé si les membranes des bactéries à faible teneur en glycolipid pourraient être également isolées à l’aide de notre technique. Pour les organismes producteurs de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium et Escherichia coli, les membranes étaient facilement isolées et la meety LPS O-antigène n’a pas eu d’impact sur le partitionnement des bilayer. Acinetobacter baumannii produit des molécules DE, qui ont une masse similaire aux molécules de LPS déficientes en O-antigène; cependant, les membranes de ces microbes n’ont pas pu être séparées au départ. Nous avons raisonné que l’OM d’A. baumannii était moins dense que celui d’Enterobacteriaceae, de sorte que le gradient de saccharose a été ajusté et les membranes ont été isolées. La technique peut donc être adaptée et modifiée pour une utilisation avec d’autres organismes.

Introduction

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Les bactéries gram-négatives produisent deux membranes qui sont séparées par un espace périplasmique et une paroi de cellules peptidoglycanes1. La membrane interne (IM) enveloppe le cytosol et est un bilayer symétrique de phospholipides. Peptidoglycan protège contre la pression turgor et fournit la bactérie avec une forme cellulaire, et est attaché à la membrane externe (OM) par les lipoprotéines2,3. L’OM entoure le périplasme et est principalement asymétrique. Le dépliant intérieur se compose de phospholipides et le dépliant externe se compose de glycolipids connus sous le nom lipooligosaccharides (LOS) ou lipopolysaccharides (LPS)4,5. L’asymétrie lipidique et la biochimie des molécules LOS/LPS dans le dépliant externe confèrent des propriétés de barrière à la surface cellulaire qui protègent la bactérie contre les dangers dans son environnement6,7.

Les molécules de LPS sont composées de trois constituants : le lipide A disaccharolipid, l’oligosaccharide de noyau, et l’O-polysaccharide ou O-antigène. Lipid A est une dispersion acylée. Les core-oligosaccharides sont composés de 10 à 15 sucres connus sous le nom de LPS brut ou R-LPS. Le noyau est subdivisé dans la région intérieure, composé de 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonique acide (kdo) et un ou plusieurs résidus d’heptose, et une région extérieure qui se compose généralement d’hexoses (glucose ou galactose) et heptoses, ou sucres d’acétalo5. La région du noyau extérieur est plus variable dans ses composants et sa structure que le noyau intérieur. Dans Salmonella spp., une seule structure centrale a été décrite; cependant, à Escherichia coli il existe cinq structures de base différentes (désignées K-12, R1, R2, R3 et R4)8. E. coli K-12 DH5, que nous utilisons dans cette procédure porte une mutation qui se traduit par la production R-LPS9. Les molécules R-LPS n’ont pas la moiety O-antigène et ont un poids moléculaire similaire aux molécules de LOS.

L’ajout d’O-antigène à R-LPS transforme cette molécule en LPS lisse, ou S-LPS. Les O-antigènes sont construits à partir de sous-unités courtes de 3-4 hydrates de carbone et se composent de multiples modalités avec des longueurs de chaîne variables10. Certaines bactéries productrices de LPS, comme Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), afficher une distribution trimodale de molécules LPS sur leur surface10,11. La chaîne très longue O-antigènes peut contenir plus d’une centaine de sous-unités et peser plus d’une centaine de kilodaltons. Les O-antigènes fournissent des propriétés de surface à la bactérie qui sont nécessaires pour résister aux antibiotiques, échapper à la prédation par bactériophages, et causer des maladies.

Espèces de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria et d’autres génèrent des molécules los LOS au lieu de molécules LPS sur leur surface12. Les molécules de LOS se composent des lipides A et des oligosaccharides de noyau mais n’ont pas l’O-antigène. Ces types de bactéries Gram-négatives modifient leurs oligosaccharides de base avec des sucres supplémentaires et des combinaisons de sucres pour modifier les propriétés de surface12. Les microbes DE LOS et de LPS-producteurs dérivatisent les phosphates sur les molécules de lipide A et de noyau avec des moieties cationiques7. Ces ajouts incluent la phosphoethanolamine, la galactosamine et les substitutions d’aminoarabinose, qui fonctionnent en neutralisant la charge de surface anionique et protégeant ainsi contre les peptides antimicrobiens cationiques. Les bactéries gram-négatives modifient également la structure d’oligosaccharide de noyau avec des substitutions non-stoichiométriques variables des sucres, ou molécules de kdo supplémentaires, et modifient le nombre de chaînes d’acyl sur les désaccharolipids lipidiques-A7.

La capacité d’isoler la GI de l’OM des bactéries Gram-négatives a été déterminante pour comprendre le rôle de l’enveloppe cellulaire dans la résistance aux antimicrobiens et la pathogénie des maladies11,12. Les dérivations de cette approche ont été utilisées pour déduire les mécanismes d’assemblage, d’entretien et de remodelage des constituants de protéines, de phospholipides et de glycolipid pour l’OM.

Notre laboratoire effectue régulièrement des analyses lipidiques bactériennes pour étudier la régulation lipidique et la fonction lipidique à médiation protéique chez une variété d’espèces Gram-négatives. Les volumes utilisés dans le protocole reflètent l’utilisation systématique de cette procédure pour analyser les phospholipides non radiolacés par la chromatographie à couches minces et la spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide13,14.

Le protocole commence par exposer une suspension réfrigérée des bactéries Gram-négatives à une solution osmolar élevée de saccharose et en ajoutant du lysozyme pour dissocier l’OM de la couche peptidoglycane sous-jacente(figure 1)12. EDTA est ensuite ajouté pour faciliter la pénétration du lysozyme, puisque la séquestration de cation divalente perturbe les interactions latérales de pontage électrostatique entre les molécules adjacentes DE/LPS15. Le protocole original à partir duquel le nôtre a été adapté a nécessité la formation de sphéoplastes, une forme de cellules bactériennes Gram-négative qui se composent d’une membrane plasmatique et d’un cytosol, mais qui n’a pas la couche peptidoglycan et un OM. Il est possible que les sphéoplastes soient produites par la méthode adaptée ; cependant, la technique ne repose pas ou n’a pas l’intention de leur formation pour le succès. Au lieu de cela, les bactéries traitées à la lysozyme-EDTA sont rapidement récoltées par centrifugation et réendées dans une solution saccharose de moindre concentration avant une lyse pressurisée. Les OM qui auraient pu être libérés en formant des sphéroplastes devraient en théorie être récoltables des supernatants des cellules traitées, mais cette approche n’est pas détaillée dans les présentes. En fin de compte, les cellules traitées sont soumises à l’homogénéisation conventionnelle et la lyse, ce qui améliore l’efficacité et la reproductibilité de la procédure de séparation de la membrane16.

Après la lyse, les membranes totales sont collectées par ultracentrifugation et appliquées à un gradient discontinu de densité de saccharose pour fractionner les IM et les OM. L’approche classique utilise un gradient plus continu qui se compose d’au moins cinq solutions de saccharose différentes11,12. Le gradient discontinu dans notre protocole se compose de trois solutions de saccharose et divise les bilayers en deux fractions distinctes17. Les molécules DE et LPS dans les OM des bactéries Gram-négatives conduisent l’enveloppe à se cloisonner en une fraction de QNI brune supérieure de basse densité et une fraction blanche inférieure d’OM à haute densité(figure 1 et figure 2).

Acinetobacter baumannii sont d’importants agents pathogènes humains multirésistants qui produisent des molécules de LOS dans leur OM et érigent une enveloppe cellulaire qui est difficile à séparer18,19. Des travaux récents suggèrent qu’une dérivation du protocole que nous présentons ici peut être utilisée pour diviser les bilayers de ces organismes20. Par conséquent, nous avons testé notre protocole sur A. baumannii 17978. Au départ, la procédure était inadéquate. Cependant, nous avons modifié la concentration de saccharose de la solution de densité moyenne et la séparation grandement améliorée(figure 2). Un essai de déshydrogénase NADH et une procédure d’extraction et de détection DE LOS/LPS ont été utilisés pour confirmer la séparation pour A. baumannii, de type sauvage S. Typhimurium et deux génotypes entérobactériens déficients en oegène; à savoir, galE-mutant S. Typhimurium et une souche de laboratoire, E. coli DH5MD(figure 3 et figure 4).

L’objectif de ce travail est de fournir une approche rationalisée pour isoler de façon reproductrice les membranes des bactéries Gram-négatives. Le protocole peut être utilisé pour étudier de nombreux types de molécules associées à la membrane pour ces microbes.

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Protocol

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1. Réagents généraux et préparation des médias pour l’extraction de membrane

  1. Médias de croissance bactérienne : Préparer et stériliser 1 L de supports de bouillon dans un flacon de 2 L bien nettoyé et autoclavé.
  2. Tampon de résuspension générale (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissoudre 6,05 g de base Tris en 30 mL de H2O. Ajuster pH à 7,5 avec 5 M HCl. Ajuster le volume final à 50 mL avec ultrapure H2O.
  3. Stock de 100 mL: Ajouter 18,6 g d’éthylène tétraacetate de disodium 2H2Hà 80 mL de H2O. Remuer vigoureusement et ajuster le pH à 8,0 avec NaOH. Ajuster le volume final à 100 ml avec l’ultrapure H2O.
    REMARQUE: Le sel de disodium d’EDTA ne se dissout pas tant que le pH de la solution n’aura pas été ajusté à 8,0 à 8,0 par l’ajout de NaOH.
  4. Tampon osmotique A (0,5 M saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 1 L): Peser 171,15 g de saccharose et transférer à un cylindre de 1 L. Ajouter 10 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuster à un volume final de 1 L avec ultrapure H2O. Store à 4 oC.
  5. Lysozyme (10 mg/mL; 5 ml) : Peser 50 mg de lysozyme (poulet blanc d’œuf) et dissoudre dans 5 mL ultrapure H2O. Store à 4 oC.
  6. Solution de chélation d’ation divalente diluée (1,5 mM EDTA; 500 ml) : Ajouter 1,5 mL de 0,5 M EDTA (étape 1,3) à 497,5 mL ultrapure H2O. Store à 4 oC.
  7. Tampon osmotique B (0,2 M saccharose, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): Peser 136,8 g de saccharose et transférer à un cylindre de 2 L. Ajouter 20 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuster le volume final à 2 L avec l’ultrapure H2O. Store à 4 oC.
  8. Facteur de nucléase (1 M MgCl2; 10 ml) : Dissoudre 2,03 g de MgCl26H2O dans 8 mL d’ultrapure H2O. Ajuster le volume à 10 ml. Conserver à température ambiante.
  9. Cocktail de solution de nucléase comprenant les enzymes RNase et DNase : voir tableau des matériaux. Magasinez à -20 oC.
  10. Cocktail d’inhibiteur de protéase : Voir tableau des matériaux. Conserver à 4 oC.
  11. Solution de gradient de saccharose isopycnique de faible densité (20 % w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solution; 100 ml) : Peser 20 g de saccharose et transférer à un cylindre de 200 mL. Ajouter 100 L de 1 M Tris Buffer pH 7.5 et 200 L de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuster le volume final à 100 ml avec l’ultrapure H2O. Conserver à température ambiante.
  12. Solution de gradient de saccharose isopycnique de densité moyenne (53 % w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Solution; 100 ml) : Peser 53 g de saccharose et transférer à un cylindre gradué de 200 ml. Ajouter 100 L de 1 M Tris Buffer pH 7.5 et 200 L de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuster le volume final à 100 ml avec l’ultrapure H2O. Conserver à température ambiante.
    REMARQUE: Préparer cette solution dans un cylindre gradué pour assurer la précision en raison du pourcentage élevé de saccharose. Ajouter une barre magnétique et remuer jusqu’à ce que le saccharose soit complètement dissous en solution. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
  13. Solution de gradient de saccharose isopycnique à haute densité (73 % w/v saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Solution; 100 ml) : Peser 73 g de saccharose et transférer à un cylindre gradué de 200 ml. Ajouter 100 L de 1 M Tris Buffer pH 7.5 et 200 L de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuster le volume final à 100 ml avec l’ultrapure H2O. Conserver à température ambiante.
    REMARQUE: Préparer cette solution dans un cylindre gradué pour assurer la précision en raison du pourcentage élevé de saccharose. Ajouter une barre magnétique et remuer jusqu’à ce que le saccharose soit complètement dissous. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
  14. Tampon de stockage à membrane isolée (10 mM Tris Buffer pH 7,5; 1 L): Ajouter 1 mL de 1 M Tris Buffer pH 7,5 à un flacon de 1 L et ajuster le volume final à 1 L avec ultrapure H2O.
  15. Dinucleotide d’adénine de Nicotinamide (NADH) (solution de 10 mg/mL ) : Résuspend 10 mg de NADH dans l’ultrapure H2O. Préparer des stocks frais, chaque semaine. Magasinez à -20 oC.
  16. Solution Phenol équilibrée avec 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Voir Tableau des matériaux. Conservez la solution à 4 oC.
  17. Lipopolysaccharide gel kit tache: Voir Tableau des matériaux.
  18. Bradford réactif: Voir tableau des matériaux.
    REMARQUE : Toutes les solutions et les médias doivent être préparés dans la semaine suivant l’exécution de l’essai afin d’assurer des résultats cohérents.

2. Préparation des bactéries pour l’extraction de membrane

  1. Sérisez les bactéries des stocks de glycérol congelés sur les plaques d’agar fraîches. Conservez les plaques à 4 oC une fois que les colonies se développeront. Inoculer une seule colonie dans un tube de 5 ml rempli de supports de bouillon et de culture des bactéries comme désiré du jour au lendemain.
  2. Back-dilute la culture bactérienne de nuit en 1 L des médias de bouillon préférés et la culture des bactéries jusqu’à ce que la densité optique désirée soit réalisée.
    REMARQUE: Inoculant une colonie bactérienne unique en 1 L de mélange est recommandé pour les génotypes mutants qui sont enclins à supprimer les phénotypes de croissance, mais certaines bactéries Gram-négatives se développent simplement plus lentement que d’autres. S’il n’est pas possible d’atteindre une densité de culture suffisante par inoculation d’une seule colonie, le retour diluer une culture du jour au lendemain en 1 L des médias est une stratégie pour synchroniser la croissance. La composition de la membrane bactérienne varie en fonction de la phase de croissance de la culture (phase logarithmic vs stationnaire)13. Les courbes de croissance mesurant l’évolution de la densité optique pour les cultures bactériennes en fonction du temps doivent être effectuées avec toutes les souches pour corréler la densité de la culture avec la phase de croissance.
  3. Placez les flacons contenant les cultures de bouillon sur la glace. Lisez la densité optique à 600 nm (OD600) et calculez le volume de culture équivalent à entre 6,0 et 8,0 x 1011 unités de formation de colonies bactériennes (cfu). Pour S. Typhimurium, cela correspond à 1 L de la culture à un OD600 entre 0,6-0,8, puisqu’un OD600 de 1,0 est égal à environ 1,0x109 cfu/mL. Ajouter ce volume à un tube de centrifugeuse et s’assurer que les cultures restantes restent sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
  4. Pelletez les bactéries par centrifugation à 4 oC à 7 000 à 10 000 x g dans une centrifugeuse à grande vitesse à angle fixe pendant 10 min.
    REMARQUE: Pré-refroidir et maintenir les centrifugeuses à basse température. Maintenir les échantillons sur la glace pendant toute la procédure.
  5. Décant et jeter le supernatant soigneusement.
    REMARQUE: La granule peut être congelée et/ou stockée à -80 oC si les fractions de membrane ne vont pas être extraites immédiatement. Cependant, il est recommandé de procéder directement avec la plasmolyse le même jour que les cellules sont récoltées, et est particulièrement recommandé pour les espèces non entérobactériennes.

3. Dissociation de la membrane extérieure et de la plasmolyse

  1. Décongeler les granulés de cellules sur la glace s’ils sont entreposés auparavant à -80 oC et conserver les échantillons sur la glace pour le reste de la procédure. Résuspendez chaque granule cellulaire dans le tube de centrifugeuse dans 12,5 ml de tampon A. Ajouter une barre d’agitation magnétique à la suspension des cellules.
  2. Ajouter 180 L de 10 mg/mL lysozyme (concentration finale de 144 g/mL) à chaque résuspension cellulaire. Garder les échantillons sur la glace tout en remuant pendant 2 min.
  3. Ajouter 12,5 ml de solution EDTA de 1,5 mM à chaque résuspension cellulaire et continuer à remuer sur la glace pendant 7 minutes supplémentaires.
  4. Décanter la suspension dans un tube conique de 50 ml et une centrifugeuse à 9 000 à 11 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
  5. Jeter les supernatants dans un contenant de déchets biorisques et conserver les granulés sur la glace.
  6. Ajouter 25 ml de tampon B à la boulette cellulaire.
  7. Ajouter 55 L de 1 M MgCl2, 1 L de reagent de nucléase RNase/DNase (pour éviter les problèmes de viscosité associés aux bactéries subissant la plasmolyse avant l’homogénéisation), et 1 l de cocktail inhibiteur de la protéase au volume de tampon B qui se trouve au sommet de la pastille cellulaire
  8. Réutilisez la pastille dans le mélange tampon B. Vigoureusement pipet et vortex jusqu’à l’observation d’une solution homogène.
    REMARQUE: Il est très important d’avoir une solution homogène avant de passer à l’étape 4 de ce protocole. Les cellules résinocypendées devraient avoir un gâteau visqueux-batteur comme l’apparence et la consistance.
  9. Vortex chaque échantillon pour 15 s. Conserver les suspensions sur la glace et passer à l’étape 4.

4. Homogénéisation pressurisée et Lysis

REMARQUE: Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour la lyse. La sonication n’est pas idéale en raison de la génération de chaleur. La lyse osmotique peut être réalisée mais est souvent inefficace. Par conséquent, nous recommandons la lyse à haute pression. La lyse à haute pression peut être atteinte à l’aide d’une variété d’instruments. Nous suggérons des machines d’homogénéisation, telles que la presse Français ou l’Emusliflex. Nous travaillons avec de nombreux types de bactéries Gram-négatives dont la réponse à des solutions de saccharose osmolar élevé varie. L’étape d’homogénéisation à haute pression améliore l’efficacité, la reproductibilité et le rendement.

  1. Préchill la cellule Français Presse à 4 oC ou insérer la bobine métallique de la machine à homogénéiser sur la glace.
  2. Verser l’échantillon dans la cellule Français pression ou le cylindre de l’échantillon d’homogénéisateur et mettre la cellule sous la pression d’homogénéisation désirée (10 000 psi devraient être adéquats lors de l’utilisation d’une presse Français ou de 20 000 psi lors de l’utilisation d’un homogénéisant).
  3. Ajustez le débit de sortie à environ une goutte par seconde tout en maintenant la pression si vous utilisez une presse Français.
  4. Recueillir le lysate cellulaire dans des tubes coniques de 50 ml tout en gardant des échantillons sur la glace.
  5. Répéter les étapes 4.2-4.4 trois à cinq fois pour atteindre la lyse complète, généralement indiquée par une augmentation graduelle de la transparence de l’échantillon.
    REMARQUE: La chambre d’échantillon doit être lavée et équilibrée avec le tampon B entre les échantillons.
  6. Gardez les cellules lysées sur la glace.

5. Fractionnement total de membrane

  1. Centrifuge les échantillons bactériens lysed à 6 169 x g pendant 10 min à 4 oC à granulés restant du matériel cellulaire intact. (p. ex., cellules bactériennes non contrôlées).
  2. Répartir la partie restante du supernatant, qui contient maintenant les membranes homogénéisées dans une bouteille en polycarbonate pour l’ultracentrifugation.
    CAUTION: Si nécessaire, les échantillons cellulaires peuvent être équilibrés en se diluant avec le tampon B.
  3. Ultracentrifuge la cellule lysates à 184.500 x g pour au moins 1 h, à 4 oC. Cette étape peut être effectuée pendant la nuit sans affecter la qualité des membranes.
  4. Jeter le reste du surnatant présent dans le tube d’ultracentrifuge et conserver les granulés de membrane sur la glace(figure 1).
  5. Résuspendez les granulés de membrane dans 1 ml de solution de gradient isopycnique-saccharose à faible densité à l’aide d’un homogénéisateur en verre.dounce. Utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer l’homogénéat de l’échantillon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL et conserver sur la glace.
    REMARQUE: Si seulement l’analyse totale de la composition de la membrane est souhaitée, remplacez 1 ml de solution de gradient isopycnique-sucrose de faible densité pour 1 ml de tampon de stockage à membrane isolée. L’étape 5.5 est le point final de l’isolement si seuls des échantillons de membranes bactériennes totales sont souhaités. Entreposez des échantillons à -20 oC jusqu’à ce qu’une analyse en aval plus approfondie soit nécessaire.

6. Ultracentrifugation gradient de densité pour séparer les membranes doubles

  1. Recueillir le nombre approprié de polypropylène de 13 ml ou de tubes ultra-transparents à toit ouvert spécifiés pour un rotor de seau oscillant et une ultracentrifug.
  2. Maintenez le tube dans une position légèrement inclinée et préparez le gradient de saccharose en ajoutant lentement des solutions de saccharose de densité plus élevée à la densité inférieure dans l’ordre suivant :
    2 mL de 73% w/v sucrose,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    4 mL de 53% w/v sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    1. Ensuite, ajoutez la fraction totale de la membrane (1 ml), qui a été résumée dans la solution de saccharose w/v de 20 % (étape 5.5). Évitez de mélanger la fraction de membrane avec la solution de saccharose qui se trouve en dessous. Les divisions doivent être visibles entre chacune de ces couches.
    2. Enfin, remplissez le tube de la solution de gradient isopycnique-saccharose de faible densité (environ 6 ml). Le polypropylène et les tubes à toit ouvert ultra-transparents doivent être remplis le plus complet possible (2 ou 3 mm du dessus du tube) pour le support du tube.
  3. Ajustement pour Acinetobacter baumannii 17978
    1. Adapter un gradient de saccharose ajusté pour une utilisation avec différents spécimens bactériens. Pour A. baumannii, le gradient de saccharose suivant a permis une séparation plus complète des membranes (figure 2).
      2 mL de 73% w/v sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
      4 mL de 45% w/v sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    2. Ensuite, ajoutez la fraction totale de la membrane (1 ml), qui a été résumée dans la solution de saccharose w/v de 20 % (étape 5.5). Évitez de mélanger la fraction de membrane avec la solution de saccharose qui se trouve en dessous. Les divisions doivent être visibles entre chacune de ces couches.
    3. Enfin, remplissez le tube d’une solution de gradient isopycnique-saccharose de faible densité (environ 6 ml). Le polypropylène et les tubes à toit ouvert ultra-transparents doivent être remplis le plus complet possible (2 ou 3 mm du dessus du tube) pour le support du tube.
  4. Ultracentrifuge les échantillons à l’aide d’un rotor de seau à 288 000 x g et 4 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Pour les volumes utilisés dans les étapes précédentes, nous recommandons des temps de centrifugation entre 16 h et 23 h.
  5. Couper l’extrémité d’une pointe de pipette P1000 à environ 5 mm du point. Retirer la couche de GI brun supérieur à l’aide de la pipette. Transférer la fraction de GI dans une bouteille en polycarbonate pour l’ultracentrifugation.
  6. Laissez environ 2 ml de la solution saccharose au-dessus de l’interface 53-73% pour s’assurer que l’OM blanc inférieur n’est pas transversal contaminé par la fraction de GI. Répétez la procédure de tuyauterie de l’étape 6.4 pour la fraction OM(figure 1).
    REMARQUE: Les membranes peuvent également être recueillies en perforant les tubes de centrifugeuse au fond à l’aide d’une aiguille et en recueillant les membranes pendant que les fractions tombent dans le sens de la chute.
  7. Remplissez le vide restant du tube d’ultracentrifuge avec un tampon de stockage à membrane isolée et mélangez par inversion ou tuyauterie. Conserver les échantillons sur la glace.
  8. Recueillir les membranes maintenant lavées et isolées par ultracentrifugation à 184 500 x g pour 1 h et 4 oC.
  9. Jeter le supernatant et résuspendre les membranes par dounce-homogénéisation. Ajouter 500-1000 L de tampon de stockage. Recueillir des échantillons dans des tubes de microcentrifugeuse de 2 ml.
  10. Conservez les échantillons de membrane bactérienne à -20 oC.

7. Confirmer la séparation des Bilayers

REMARQUE: La séparation incomplète des bicouches peut se produire en raison d’une erreur technique ou de la composition unique de l’enveloppe cellulaire de certaines espèces. Pour confirmer la séparation, nous conseillons d’utiliser deux essais indépendants pour quantifier le degré de contamination croisée entre les bicouches. Le premier essai détecte l’activité enzymatique de la déshydrogénase NADH, qui existe exclusivement dans la GI. Le deuxième essai détecte la présence de LOS ou de LPS, qui existe principalement à l’OM.

  1. Confirmant que les OM sont isolés des IM
    1. Mesurez la concentration de protéines dans chaque fraction de membrane isolée à l’aide d’un essai de protéine Bradford.
    2. Ajouter le volume d’échantillon correspondant à entre 50 et 500 g de protéines à un tube vide de microcentrifuge de 2 ml. La concentration varie selon l’espèce, mais 50 g est généralement suffisante pour les entérobactéries. Ajouter le volume approprié de 10 mM Tris-buffer pour atteindre un volume total de 990 ll. Transférer le contenu dans une cuvette pour la spectrophotométrie.
    3. Ajouter 10 L d’une solution de 10 mg/mL de NADH à l’échantillon et mesurer l’absorption initiale à 340 nm.
    4. Continuer à mesurer l’absorption tous les 30 s pendant 5 minutes.
    5. Compilez les données et graphiquez le changement d’absorption (y-axe) par rapport au changement d’heure (x-axe) pour chaque fraction de membrane(figure 3).
  2. Confirmant que les IM sont isolés des OM
    1. Ajouter le volume d’échantillon correspondant à entre 50 et 500 g de protéines à un tube vide de microcentrifuge de 2 ml. La concentration varie en fonction des espèces bactériennes, mais 50 g est généralement suffisante pour les entérobactéries. Remplir à un volume final de 100 l avec du phosphate tamponné saline, qui est par la suite appelé la phase aqueuse.
    2. Ajoutez 5 L de Proteinase K (stock 800 U/mL) à la phase aqueuse et incuber pendant la nuit à 59 oC.
    3. Chauffer un aliquot de 10 mL de Phénol saturé de Tris pendant 10 min à 68 oC.
    4. Faites tourner les échantillons de phase aqueuse qui ont été traités avec le Proteinase K et ajoutez le phénol " chaud » saturé de Tris à un rapport de 1:1 avec la phase aqueuse, vortex vigoureusement et incubate à 68 oC pendant 10 min.
    5. Transférer les échantillons maintenant blanc laiteux de 68 oC dans un bain d’eau glacée et incuber pendant 10 min.
    6. Centrifuge les échantillons à 2 100 x g pendant 10 min à 4 oC.
    7. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube et entreposer le tube à -20 oC si l’échantillon ne doit pas être utilisé immédiatement.
    8. Diluer les échantillons dans le tampon de chargement SDS et charger les puits d’un gel de gradient Tris-glycine de 4 à 20 %.
    9. Électrophorèse pendant 45 minutes ou jusqu’à ce que le colorant-avant soit au fond du gel.
    10. Tachez le gel à l’aide du kit de coloration LPS suivant les instructions du fabricant.

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Representative Results

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Cette technique fournit un moyen efficace d’isoler les IM et les OM pour les bactéries Gram-négatives. Un aperçu de l’ensemble de la procédure est illustré(figure 1). En général, la normalisation des cultures à un OD600 de 0,6-0,8 dans 1 L des médias, ou la récolte entre 6,0 et 8,0 x 1011 cellules bactériennes assurera que la quantité appropriée de matériel membranaire est recueillie pour la séparation ultérieure.

En lysant les bactéries et en ultracentrifugeant le lysate, une granule de membrane totale brune collante sera visible au fond du tube d’ultracentrifug. Après le grattage, la dounce-homogénéisante et l’ultracentrifuging de la membrane sur le gradient discontinu de densité de saccharose, le IF et l’OM devraient être séparés comme décrit (figure 2). Nous avons constaté que le gradient de densité de saccharose de 20 %/53 %/73% (w/v) était insuffisant pour cloisonner l’enveloppe de A. baumannii, tandis qu’un gradient de 20%/45% /73% w/v était suffisant(figure 2).45%

Diverses méthodes d’analyse peuvent être utilisées pour évaluer la qualité et la pureté de chaque fraction de membrane. NADH-dehydrogenase est une enzyme à membrane interne qui catalyse l’oxydation NADH à LA NAD (figure 3). Compte tenu de sa localisation cellulaire, il peut être utilisé pour déterminer la contamination croisée entre les IM et les OM. Selon les spectres d’absorption des deux molécules, NAD et NADH ont chacun une absorption maximale à 260 nm, tandis que seul NADH a une absorption maximale à 340 nm. Ainsi, une diminution de l’absorption à 340 nm serait indicative de l’oxydation de NADH à NAD et donc la présence de l’enzyme dans l’échantillon. Si les membranes se séparent correctement, ce changement d’absorption ne devrait se produire que dans les échantillons de GI(figure 3). Une diminution de l’absorption des échantillons om indiquerait une contamination croisée par des matières de GI. Pour A. baumannii, trois fois la quantité de membrane, soit 150 g d’équivalents protéiques, était nécessaire pour démontrer des niveaux similaires d’activité de déshydrogénase NADH à ce qui a été mesuré pour les souches entérobactériennes(figure 3). Par conséquent, il est possible que les niveaux d’oxidase NADH soient plus faibles pour A. baumannii ou que l’activité spécifique de l’enzyme soit diminuée.

Le dépliant externe de l’OM est principalement composé de molécules LOS ou LPS. Par conséquent, l’extraction des échantillons de LPS/LOS à partir des échantillons de MESSAGERIE et d’OM avec électrophoresèse ultérieure et visualisation par coloration LPS reflétera l’enrichissement de ces structures dans l’OM par rapport aux fractions de GI. La synthèse des molécules DE et LPS commence dans le cytoplasme et est complétée à la surface de la IM5. Les structures LOS et LPS sont transportées sans direction à l’OM et insérées dans le tract extérieur. Puisque la biosynthèse implique l’attachement précurseur à la GI, un modèle de baguage faible est toujours observé pour les fractions de GI. Cependant, l’intensité des molécules dans la fraction OM est beaucoup plus grande que dans la fraction de GI, en raison de l’enrichissement des structures LOS/LPS(figure 4). La quantité de membrane obtenue a été mesurée en déterminant la concentration de protéine dans la suspension. Six fois la quantité de membrane était nécessaire pour extraire et détecter le LOS de A. baumannii par rapport à la quantité nécessaire pour détecter les molécules de LPS des organismes entériques(figure 4). Nous raisonlons que cela pourrait refléter une diminution du niveau de molécules de LOS dans l’OM pour ces organismes par rapport aux niveaux de protéines, mais n’ont pas poursuivi cette hypothèse en détail.

Figure 1
Figure 1 : Un schéma représentant la procédure d’isolement de membrane bactérienne Gram-négatif décrite dans cet article de méthodes. La procédure utilisée pour la collecte des cellules bactériennes et l’isolement des membranes totales, intérieures (IM) et externes (OM) est présentée. L’approche repose sur la densité accrue du bilayer OM pour ces microbes par rapport à la densité du bilayer IM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs pour différentes espèces Gram-négatives dont les membranes ont été isolées à l’aide de la norme et des gradients modifiés de densité de saccharose décrits dans cet article. Images de gradients discontinus de densité de saccharose post centrifugation isopycnic pour (A) sauvage-type Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s, (B) galE-mutant S. Typhimurium LT2, qui produit des molécules de LPS dépourvues d’O-antigènes, et (C) Escherichia coli K-12 DH5, qui produit également des molécules de LPS qui n’ont pas d’antigènes O. La membrane interne (IM) est séparée de la membrane externe (OM) et localise à l’interface saccharose de 20-53% comme matériau brun. La couche blanche OM se localise à l’interface saccharose 53-73% en raison de la densité plus élevée de cette fraction. (D) Les membranes totales du baumanient acinetobacter sauvage 17978 ne se séparaient pas en utilisant 20%/53%/73% (w/v) gradient de saccharose, (E) mais ne séparé en utilisant le gradrose de 20%/45%/73% (w/v) sucroseient. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs de l’essai de déshydrogénase NADH pour tester la pureté de la membrane externe (OM). La présence de l’enzyme, NADH-dehydrogenase, a été testée dans des échantillons internes (IM) et OM pour tester l’efficacité de la séparation. (A) L’oxydation de NADH à NAD est catalysée par une enzyme située dans la GI bactérienne. Le substrat de réaction (NADH) a une absorption maximale à 340 nm; par conséquent, une diminution de la densité optique à cette longueur d’onde est révélatrice de la présence de l’enzyme dans l’échantillon. Les IM et les OM ont été mesurés pour (B) de type sauvage S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5 et (D) galE-mutant S. Typhimurium. Ces membranes ont été isolées à l’aide d’un gradient isopycnique de densité de saccharose de 20%/53%/73% w/v sucrose. Pour A. baumannii, les membranes ont été isolées à l’aide d’un gradient de 20%/45%/73% w/v sucrose. L’essai NADH pour tester la pureté des membranes a été fait en utilisant (E) 50 g pour les organismes entérobactériens et (F) 150 'g de protéines totales pour A. baumannii. Une concentration plus élevée de protéines a été ajoutée dans (F), puisque la courbe pour (E) a suggéré que les niveaux relatifs de déshydrogénase de NADH comparés à la protéine totale étaient moins pour A. baumannii que pour S. Typhimurium et E. coli. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de la procédure d’extraction et de visualisation LPS et LOS pour tester la pureté de la membrane interne (IM). Le volume d’échantillon de membrane correspondant à 50 g de protéines totales a été utilisé pour extraire LPS de la messagerie instantanée et de la membrane externe (OM) de S. Typhimurium et E. coli DH5-alpha. Le volume d’échantillon de membrane correspondant à 300 g de protéines totales a été utilisé pour extraire LPS des membranes de A. baumannii. Les volumes ont été normalisés à 100 l avec de l’eau sans endotoxine et traités avec Proteinase K. LPS ou LOS ont été extraits par extraction de phénol chaud (1:1 eau : phénol) et 21 l des extraits ont été chargés sur un gel en polyacrylamide de 4-20% gradient et visualisés par pro-Q Emerald 300 colorant pour évaluer la contamination croisée des fractions de GI avec des matériaux OM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Cette méthode continuera d’aider les chercheurs à comprendre le rôle de l’enveloppe cellulaire dans la physiologie bactérienne et la pathogénie. Suite aux étapes séquentielles d’ultracentrifugation une fraction totale, intérieure et OM purifiée peut être obtenue. Ces membranes peuvent être analysées isolément pour tester les hypothèses liées à la localisation et à la fonction des protéines membranaires, au transport et au trafic à travers le périplasme, et à la composition des bicoussards individuels dans diverses conditions environnementales. Des études biologiques explorant l’implication de composants OM individuels dans la pathogénie, telles que les protéines LOS/LPS et OM, peuvent également être menées dans des modèles animaux et cellulaires à l’aide de fractions membranes isolées recueillies par cette technique.

Notre procédure a été optimisée pour une utilisation avec Enterobacteriaceae, en particulier S. Typhimurium, qui produit des molécules LPS qui contiennent des O-antigènes de longueur de chaîne variable. Ce protocole fonctionne également pour la bactérie modèle, E. coli K-12, qui a perdu la capacité génétique de synthétiser les O-antigènes. Utilisation de type sauvage et O-antigène déficiente S. Typhimurium 14028 et souche E. coli K-12 DH5MD, nous montrons que la capacité de séparer les membranes de ces microbes n’est pas largement influencée par la présence des O-antigènes. Cependant, pour séparer l’enveloppe de la bactérie productrice de LOS, A. baumannii 17978, nous avons dû réduire la concentration de la solution de saccharose de densité moyenne dans le gradient discontinu pour isoler les bilayers(figure 2). En particulier, le déplacement de la concentration de la solution de densité moyenne de 53 à 45% a été suffisant pour permettre à l’OM de se répartir vers l’interface 45-73% dans le gradient adapté. Lors de l’utilisation du gradient de 53 à 73 % pour A. baumannii, la majorité du matériel om a souvent été observée légèrement en dessous de la fraction de GI à l’interface de 20-53%(figure 2). Le matériel de l’OM était présent à l’interface 53-73% pour A. baumannii. Ces résultats suggèrent que le gradient de 20 %/53%/73% est insuffisant pour séparer les bilayers de A. baumannii dans ces conditions.

En résumé, des ajustements peuvent être apportés au gradient de densité pour accueillir les organismes à faible teneur et niveau OM-glycolipid, et l’approche peut être adaptée à d’autres bactéries Gram-négatives.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par P20GM10344 et R01AI139248 attribués à Z. D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

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Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries Gram-négatives dans les fractions de membrane intérieure et extérieure avec des ajustements techniques pour <em>Acinetobacter baumannii</em>
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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

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