Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

Abstract

שיטה זו פועלת על ידי חלוקת המעטפה של חיידקים גראם שליליים לתוך הכולל, פנימי, הקרום החיצוני (OM) שברים מסכם עם בחני להעריך את הטוהר של bilayers. לאום יש צפיפות כוללת מוגברת לעומת הקרום הפנימי, בעיקר בשל נוכחות של lipooligosaccharides (לוס) וליפופוליסכלידיס (LPS) בתוך העלון החיצוני. לוס ו LPS המולקולות הם אמפיפתיים גליקולפידים כי יש מבנה דומה, אשר מורכב השומנים-disaccharolipid ו-core-oligosaccharide מתמיר. עם זאת, רק מולקולות LPS מעוטרים עם יחידת משנה שלישית המכונה O-רב-סוכר, או O-אנטיגן. הסוג והכמות של גליקולפידים הנוכחיים ישפיעו על צפיפות ה-OM של האורגניזם. לכן, בדקנו אם הקרומים של חיידקים עם תוכן גליקולפיד מגוון יכול להיות מבודד באופן דומה באמצעות הטכניקה שלנו. עבור האורגניזמים המייצרים LPS, סלמונלה בידור מסוג Typhimurium ואסאנכיה קולי, הקרומים היו מבודדים בקלות ו lps O-אנטיגן moiety לא השפעה על החלוקה bilayer. הביטוח העצמי מייצרת מולקולות לוס אנג'לס, אשר יש מסה דומה למולקולות lps לקויה של O-אנטיגן; עם זאת, הקרומים של חיידקים אלה לא יכלו בתחילה להיות מופרדים. החלטנו שהאום של המוסד לביטוח העצמי היה פחות צפוף מזה של באנקובאכריים, ולכן הכוונן את מעבר הסוכות והקרומים היו מבודדים. הטכניקה יכולה אפוא להיות מותאם ושונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חיידקים גראם שליליים לייצר שתי ממברנות כי הם מופרדים על ידי החלל הפריפלזמית והתא התאים פפטידוגליקן1. הממברנה הפנימית (IM) מנתיקים את הציטוזול והוא מהווה בינה סימטרית של פוספוליפידים. Peptidoglycan יכול להגן מפני לחץ טורגור ומספק את החיידק עם צורה תא, והוא מחובר הקרום החיצוני (אום) על ידי ליפופרוטאינים2,3. ה-OM מקיף את הפריפלמטר והוא ברובו אסימטרית. העלון הפנימי מורכב מפוספוליפידים והעלעל החיצוני כולל גליקולפידים המוכרים כ-lipooligosaccharides (LOS) או ליפופוליסכדים (lps)4,5. א-סימטריה השומנים וביוכימיה של מולקולות לוס/lps בעלון החיצוני מעניקים למאפייני המכשול את משטח התא המגן על החיידק מפני סכנות בסביבתו6,7.

מולקולות LPS מורכבות משלושה מרכיבים: ליפיד disaccharolipid, oligosaccharide הליבה, ואת O-רב-סוכר או O-אנטיגן. ליפיד A הוא disaccharolipid מכפלה. Core-oligosaccharides מורכב 10 – 15 סוכרים המכונה LPS מחוספס או R-LPS. הליבה מחולקת לתוך האזור הפנימי, המורכב מ-2-כתו-3-דיקסי-D-מאנאין-אובלי-אוטוסוניק (kdo) ואחד או יותר שאריות הפיז, ואזור חיצוני המורכב בדרך כלל מהקאוסס (גלוקוז או גלקטוז) והפטטוסים, או מרחמת סוכרים5. אזור הגרעין החיצוני משתנה יותר ברכיביו ובמבנה מאשר הליבה הפנימית. ב סלמונלה spp., רק מבנה אחד ליבה תוארה; עם זאת, ב Esהכלאיים coli יש חמישה מבני ליבה שונים (מיועד K-12, R1, R2, R3, ו-4)8. E. coli K-12 DH5α, שבו אנו משתמשים בהליך זה נושאת מוטציה שתוצאתה הייצור R-lps9. מולקולות R-LPS חסר הmoiety או אנטיגן ויש להם משקל מולקולרי דומה למולקולות LOS.

התוספת של O-אנטיגן ל-R-LPS הופך את המולקולה הזאת לחלקה LPS, או S-LPS. O-אנטיגנים בנויים קצר 3-4 שדות פחמימות משנה ומורכב של מספר מיטות עם אורכי שרשרת משתנים10. חיידקים מניבים מסוימים, כמו סלמונלה בידור בשיטת "היימוופיום" (S. Typhimurium), להציג התפלגות תלת מודאלית של מולקולות LPS על פני השטח שלהם10,11. מאוד ארוך שרשרת O-אנטיגנים יכולים להכיל מעל 100 יחידות משנה ושוקלים מעל 100 kilodaltons. O-אנטיגנים לספק תכונות פני השטח לחיידק כי הם נחוצים כדי להתנגד לאנטיביוטיקה, להתחמק מראש על ידי בקטריה, ולגרום למחלות.

מינים של קמפילובקטר, בורידילה, acineטבק, האמפילוס, NEISSERIA ואחרים לייצר מולקולות לוס במקום lps מולקולות על פני השטח שלהם12. מולקולות לוס מורכב ליפיד A ו oligosaccharides ליבה אבל חסר O-אנטיגן. סוגים אלה של חיידקים גראם שליליים לשנות את oligosaccharides הליבה שלהם עם סוכרים נוספים ושילובים של סוכרים כדי לשנות את השטח נכסים12. הן לוס ו-LPS הפקת חיידקים ללעג פוספטים על השומנים A ואת הליבה מולקולות עם moieties7ic. התוספות הללו כוללות פוספואנטואנאמין, גלטוסאמין והחלפות עמינח arabinose, אשר מתפקדים על ידי החלפת משטח הקרקע בנטרול ובכך הגנה מפני פפטידים מיקרוביאלית. חיידקים גראם שליליים גם לשנות את מבנה oligosaccharide הליבה עם משתנה שאינו stoichiometric החלפות של סוכרים, או מולקולות kdo נוספות, ולשנות את מספר שרשראות acyl על ליפיד-A disaccharolipids7.

היכולת לבודד IM מן האום של חיידקים גראם שליליים כבר אינסטרומנטלי להבנת התפקיד של מעטפת התא בהתנגדות מיקרוביאלית המחלה פתוגנזה11,12. בגישה זו נעשה שימוש כדי להסיק מנגנונים של הרכבה, תחזוקה, ושיפוץ של חלבון, פוספוליפיד, ו גליקולפיד המרכיבים עבור האום.

המעבדה שלנו באופן שגרתי מבצעת ניתוחים lipidomic חיידקיים ללמוד חלבון בתיווך השומנים רגולציה ותפקוד השומנים במגוון של מינים גראם שליליים. אמצעי האחסון הנמצאים בשימוש בפרוטוקול משקפים את השימוש השגרתי בהליך זה כדי לנתח פוספוליפידים בעלי שכבה שאינה רדיוגרפית באמצעות13כרומטוגרפיה של שכבות דקות וכרומטוגרפיה כרומטוגרפית מאסיביתמסוג 13,14.

הפרוטוקול מתחיל על ידי חשיפת השעיית מקורר של חיידקים גראם שליליים לפתרון אוסמוטי גבוה של סוכרוז והוספת ליזוזים לנתק את האום מן השכבה הבסיסית של פפטידוגליקן (איור 1)12. EDTA לאחר מכן מתווסף כדי להקל על החדירה של lysozyme, מאז קיבוע על הקטיון משבש את האינטראקציות לרוחב אלקטרוסטטי גישור בין מולקולות LOS/LPS סמוכים15. הפרוטוקול המקורי שממנו שלנו הותאם נדרש היווצרות של כדורית, הטופס החיידק גרם-שלילי המכיל קרום פלזמה ו ציטוסול, אבל חסר את השכבה הפטיפדואפשר ואום. ייתכן כי הספרופור מיוצרים על ידי השיטה המותאמת; עם זאת, הטכניקה אינה מסתמכת או מתכוונת על היווצרות שלהם להצלחה. במקום זאת, החיידק lysozyme-EDTA מטופלים הם שנקטפו במהירות על ידי צנטריפוגה ומושעה מחדש בפתרון סוכות של ריכוז פחותה לפני הליזה בלחץ. OMs כי יכול להיות שוחרר על ידי יצירת ספרונטקיים צריך בתאוריה להיות harvestable מן הסופרנטנים של התאים התייחסו, אבל גישה זו לא מפורטת במסמך זה. בסופו של דבר, התאים התייחסו חשופים לטיפול הומוגון קונבנציונאלי, המשפר את היעילות והתוכקות של הליך הפרדת הממברנה16.

לאחר הליזה, הקרומים הכולל נאספים על ידי מעבר הדרגתי ומוחלים על צפיפות מתמשכת בדחיסות האנגיופלסטיקה של ה-IMs ו-OMs. הגישה הקלאסית משתמשת בדרגה רציפה יותר, המורכבת מחמישהמתוך חמש פתרונותשונים של סוכות,12. מעבר הדרגתי בפרוטוקול שלנו מורכב משלושה פתרונות של סוכות ומחיצות הבילאיירס לשני שברים נפרדים17. LOS ו-LPS מולקולות בתוך OMs של חיידקים גראם שליליים כונן את המעטפה למחיצה לתוך חום גבוה בצפיפות נמוכה IM שבר ושבריר נמוכה לבן נמוך בצפיפות גבוהה (איור 1 איור 2).

הביטוח העצמי של acineטבק הם גורמי האדם העמידים בפני תרופות רב-תרופתיים המייצרים לוס מולקולות באום שלהם והקמת מעטפת תא קשה להפריד18,19. העבודה האחרונה עולה כי הנגזרת של הפרוטוקול שאנו מציגים כאן ניתן להשתמש כדי לחלק את הבילאיירס של אורגניזמים אלה20. לכן, בדקנו את הפרוטוקול שלנו . בבית הביטוח העצמי 17978 בתחילה, ההליך היה מספיק. עם זאת, אנו שינו את ריכוז הסוכות של פתרון הצפיפות האמצעית ושיפור משמעותי בהפרדה (איור 2). השימוש בשיטת NADH דהידרוגנאז ובתהליך החילוץ והגילוי של לוס-אנג'לס שימש לאישור הפרדה של בעלי הבית, מסוגפראי . Typhimurium ושני מסוג O-אנטיגן לקויה הגנותיים; כלומר, מוטציה של גייל. Typhimurium ומאמץ מעבדה, E. coli DH5α (איור 3 ואיור 4).

כוונת העבודה הזאת היא לספק גישה מפושטת לבידוד הקרומים של חיידקים גראם שליליים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ללמוד סוגים רבים של מולקולות הקשורות לקרום עבור חיידקים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ריאגנטים כללי ומדיה הכנה לכריית ממברנה

  1. מדיה הצמיחה חיידקים: להכין ולחטא 1 L של התקשורת מרק ב ניקוי ביסודיות ובקבוקון 2 L.
  2. מאגר הבולם הכללי (1 מאגר טריס pH 7.5; 50 mL): התמוססות 6.05 g של בסיס Tris ב 30 מ ל של H2O. כוונן את ה-pH כדי 7.5 עם הHCl 5 מ '. כוונן את הנפח הסופי ל-50 ML עם H2O באולטרסאונד.
  3. מלאי מאסטר של פתרון לקטיון דיאונטי (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL): להוסיף 18.6 g של divalent אתילן טטראצטט · 2H2O כדי 80 ML של H2O. מערבבים במרץ והתאם את ה-PH ל8.0 עם naoh. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 mL עם H2O באלקטרופורזה.
    הערה: מלח ניתרן של edta לא להתמוסס עד pH של הפתרון מותאם ל ~ 8.0 על ידי תוספת של naoh.
  4. אוסמוטי מאגר A (0.5 M סוכות, 10 מ"מ מ ' Tris pH 7.5; 1 L): שוקל 171.15 g של סוכרוז והעברה לצילינדר 1 L. הוסף 10 mL של 1 M טריס pH 7.5. התאם לאמצעי האחסון הסופי של L באמצעות החנות H2O באולטרסאונד.
  5. ליזוזים (10 מ"ג/mL; 5 מ ל): שוקל 50 מ"ג (עוף ביצה לבן) ליזוזים ומתמוסס ב 5 מ ל באלקטרופורזה H2O. חנות ב 4 ° c.
  6. פתרון לקטיון מדולל בתמיסה (1.5 מ"מ EDTA; 500 mL): הוסף 1.5 mL של 0.5 M EDTA (שלב 1.3) כדי ל497.5 בתוספת של H2ו. חנות ב 4 ° c.
  7. אוסמוטי מאגר B (0.2 M סוכרוז, 10 mM טריס pH 7.5; 2 L): שוקל 136.8 g של סוכרוז והעברה לצילינדר 2 L. הוסף 20 מ ל של 1 M Tris pH 7.5. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-2 ל'באמצעות החנות ב-4 ° c.
  8. Nuclease שיתוף פקטור (1 M mgcl2; 10 מ ל): לפזר 2.03 g של mgcl2· 6h2o ב 8 מ ל של אלקטרופורזה H2o. התאם נפח ל 10 מ ל. . חנות בטמפרטורת החדר
  9. Nuclease הפתרון קוקטייל כולל האנזימים RNase ו DNase: ראה שולחן חומרים. חנות ב-20 ° c.
  10. קוקטייל פרוטאז מעכבי: לראות את הטבלה של חומרים. חנות ב -4 ° c.
  11. בצפיפות נמוכה הפתרון הדרגתי מעבר הצבע (20% w/v סוכות, 1 מ"מ EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 פתרון; 100 mL): שוקל 20 גרם של סוכרוז והעברה לצילינדר 200 mL. הוסף 100 μL של 1 M מאגר Tris pH 7.5 ו 200 μL של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 mL עם שירותי H2או. Store בטמפרטורת החדר.
  12. בדחיסות בינונית-מעבר הצבע הפתרון הדרגתי (53% w/v סוכות, 1 מ"מ EDTA, 1mM Tris pH 7.5 פתרון; 100 mL): שוקלים 53 g של סוכרוז והעברה לגליל בוגר 200 בשנת לימודים. הוסף 100 μL של 1 M מאגר Tris pH 7.5 ו 200 μL של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 mL עם שירותי H2או. Store בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכינו פתרון זה בצילינדר הדרגתי כדי להבטיח דיוק בשל האחוז הגבוה של סוכרוז. הוסיפו בר למהומה מגנטית ומערבבים עד שהסוכרוז מומס לחלוטין בתמיסה. תהליך זה עשוי להימשך מספר שעות.
  13. בצפיפות גבוהה הפתרון הדרגתי מעבר הצבע (73% w/v סוכות, 1 מ"מ EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 פתרון; 100 mL): שוקלים 73 g של סוכרוז והעברה לגליל בוגר ברמת 200 המאה ה-mL. הוסף 100 μL של 1 M מאגר Tris pH 7.5 ו 200 μL של 0.5 M EDTA pH 8. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 mL עם שירותי H2או. Store בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכינו פתרון זה בצילינדר הדרגתי כדי להבטיח דיוק בשל האחוז הגבוה של סוכרוז. הוסיפו בר למהומה מגנטית ומערבבים עד שהוא נמס לחלוטין. תהליך זה עשוי להימשך מספר שעות.
  14. מבודד-מאגר אחסון ממברנה (10 מ"מ מאגר טריס pH 7.5; 1 L): להוסיף 1 מ ל של מאגר 1 מ ' טריס pH 7.5 ל 1 L בקבוקון ולהתאים את אמצעי האחסון הסופי ל 1 L עםהשניבאולטרטהור H 2 O.
  15. β-ניקולט אדנין (NADH) (10 מ"ג/mL פתרון): להשעות 10 מ ג של NADH ב באולטרסאונד H2O. הכן מניות טריות, שבועי. חנות ב-20 ° c.
  16. הפתרון פנול באמצעות 10 mM הHCl Tris, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA: לראות את טבלת חומרים. אחסן את הפתרון ב-4 ° c.
  17. ליפופוליסכריד ג'ל כתם: ראה שולחן חומרים.
  18. ברדפורד מגיב: ראה שולחן חומרים.
    הערה: יש להכין את כל הפתרונות והמדיה תוך שבוע ביצוע הקבוע כדי להבטיח תוצאות עקביות.

2. הכנת חיידקים להפקת ממברנה

  1. פס את החיידקים מתוך מניות גליצרול קפוא על לוחית אגר טרי. לאחסן את לוחיות ב 4 ° צ' פעם המושבות להתפתח. האיחסן מושבה בודדת לצינור של 5 מ ל ממולא באמצעי התקשורת והתרבות של החיידק כנדרש בן לילה.
  2. לאחור לדלל את התרבות החיידקית לילה לתוך 1 L של מדיה מרק מועדף ותרבות את החיידקים עד הצפיפות האופטית הרצויה מושגת.
    הערה: העלמת מושבה חיידקית אחת ל-L של מדיית מרק מומלצת לגנוטיפים מוטנטים הנוטים לדכא פנוטיפים לגדילה, אבל חיידקים גראם שליליים פשוט גדלים לאט יותר מהאחרים. אם לא ניתן להשיג צפיפות תרבותית מספקת על ידי מושבה אחת, החזרה מדלל תרבות לילה אל 1 L של מדיה היא אסטרטגיה אחת כדי לסנכרן את הצמיחה. הרכב הממברנה חיידקי משתנה בהתאם לשלב הצמיחה של התרבות (לוגריתמי לעומת שלב נייח)13. הצמיחה עקומות מדידה השינוי בדחיסות אופטית עבור תרבויות חיידקי כפונקציה של זמן צריך להתבצע עם כל הזנים כדי לתאם צפיפות התרבות עם שלב הצמיחה.
  3. הגדר את מבחנות המכילות את תרביות הציר על הקרח. לקרוא את הדחיסות האופטית ב 600 nm (OD600) ולחשב את נפח התרבות כי הוא שווה ערך בין 6.0 ו 8.0 x 1011 המושבה בקטריאלי יחידות (cfu). . לסופרן Typhimurium, זה תואם 1 L של התרבות ב-OD600 של בין 0.6-0.8, מאז od600 של 1.0 שווה בערך 1.0 x109 cfu/mL. הוסף אמצעי אחסון זה לשפופרת צנטריפוגה וודא שהתרבויות הנותרות נשארות על הקרח עד שישמשו אותן.
  4. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° צ' ב 7,000-10000 x g בזווית קבועה במהירות גבוהה צנטריפוגה עבור 10 דקות.
    הערה: טרום קריר ולשמור על הצנטריפוגות בטמפרטורה נמוכה. שמור על הדגימות על הקרח במהלך ההליך כולו.
  5. Decant ולבטל את הסופרנטנט בזהירות.
    הערה: הגלולה יכול להיות הבזק קפוא ו/או מאוחסן-80 ° c אם שברים קרום לא הולך להיות חילוץ מיידית. עם זאת, מומלץ להמשיך ישירות עם פלסמוליזה באותו יום התאים הם נקצרו, והוא מומלץ במיוחד עבור מינים שאינם בידור.

3. דיסוציאציה של הקרום החיצוני והפלסמוליזה

  1. הפשרת כדורי התא על הקרח אם אוחסנו בעבר ב-80 ° c ושמור את הדגימות על הקרח לשארית ההליך. השהה מחדש כל גלולה תא בתוך צינור הצנטריפוגה ב-12.5 mL של מאגר A. הוסף פס מגנטי להשעיה של תאים.
  2. הוסף 180 μl של 10 מ"ג/ml ליזוזים (הריכוז הסופי של 144 μg/ml) לכל תא מחדש. לשמור את הדגימות על הקרח תוך ערבוב עבור 2 דקות.
  3. הוסף 12.5 mL של 1.5 mM הפתרון EDTA לכל תא מחדש ולהמשיך ערבוב על קרח עבור 7 דקות נוספות.
  4. Decant ההשעיה לתוך שפופרת 50 mL ו צנטריפוגה ב 9000-11000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  5. . ולשמור על כדורי הקרח
  6. הוסף 25 מ ל של מאגר B לתוך הגלולה התא.
  7. הוסף 55 μl של 1 M mgcl2, 1 μl של rnase/dnase נוקלאז מגיב (כדי למנוע בעיות צמיגות הקשורים חיידקים שעברו פלסמוליזה לפני המגון), ו 1 μl של קוקטייל פרוטאז מעכבי לנפח של מאגר B היושב על גבי הגלולה תא
  8. השהה מחדש את הגלולה בתערובת B המאגר. במרץ ובמערבולת עד התבוננות הפתרון הומוגנית.
    הערה: חשוב מאוד לקבל פתרון הומוגנית לפני שתמשיך לשלב 4 של פרוטוקול זה. התאים מחדש צריך להיות תערובת עוגה צמיגה כמו מראה ועקביות.
  9. מערבולת כל דוגמה עבור 15 s. שמור על השעיות בקרח והמשך לשלב 4.

4. לווסת את המגון ולוליזיס

הערה: ניתן להשתמש במספר שיטות לפירוק. Sonication אינו אידיאלי בשל דור החום. אוסמוטי לליזה ניתן להשיג אך לעתים קרובות לא יעיל. לכן, אנו ממליצים על פירוק בלחץ גבוה. לפירוק בלחץ גבוה ניתן להשיג באמצעות מגוון רחב של כלים. אנו מציעים מכונות הומוקות, כגון העיתונות הצרפתית או Emusliflex. אנו עובדים עם סוגים רבים של חיידקים גראם שליליים, אשר התגובה שלהם משתנה לפתרונות מסוג אוסמוטי גבוהה. הלחץ הגבוה משפר את שלב ההעצמה ומשפרת את היעילות, התוכסות והתשואה.

  1. הקישו על תא העיתונות הצרפתי ב -4 ° c או הכניסו את סליל המתכת מהמכונה ההומוגנידאלית על הקרח.
  2. יוצקים את הדגימה לתא הלחץ הצרפתי או לצילינדר הומוגניצר-לדוגמה והביאו את התא תחת הלחץ הרצוי של המגון (10,000 psi צריך להיות הולם כאשר משתמשים בעיתונות צרפתית או 20,000 psi כאשר משתמשים בעזרת הומוגניצר).
  3. כוונן את קצב זרימת העודפים לטיפה אחת לשניה תוך שמירה על הלחץ אם אתה מנצל את העיתונות הצרפתית.
  4. לאסוף את התא ליפוסט ב 50 מ ל צינורות חרוט תוך שמירה על הקרח דגימות.
  5. חזור על שלבים 4.2-4.4 שלוש עד חמש פעמים כדי להשיג פירוק מלא, המצוין בדרך כלל על ידי עלייה הדרגתית בשקיפות של המדגם.
    הערה: יש לשטוף את התא המדגם ולבטלו באמצעות מאגר B בין דגימות.
  6. . לשמור על התאים בקרח

5. משבר ממברנה כולל

  1. צנטריפוגה את דגימות בקטריאלי למטה ב 6,169 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צלזיוס כדי גלולה הנותרים חומר תא שלם. (למשל, תאים חיידקיים בלתי מנוצלים).
  2. הפיצו את החלק הנותר של הסופרנטאנט, המכיל כעת את הקרומים המוגניים לתוך בקבוק פוליקרבונט לצורך הסתבכות.
    זהירות: במידת הצורך, ניתן לאזן דגימות תאים על-ידי דילול עם מאגר B.
  3. Ultracentrifuge את התא ליסביטים ב 184,500 x g עבור לפחות 1 h, ב 4 ° c. שלב זה יכול להתבצע לילה מבלי להשפיע על איכות הקרומים.
  4. התעלם מהסופרנטאנט שנותר בצינור הultracentrifuge ושמור על כדורי הקרום על הקרח (איור 1).
  5. השהה מחדש את כדורי הקרום ב-1 מ ל של הפתרון הדרגתי של הצפיפות הנמוכה isopycnic-סוכות, באמצעות מכשיר לייזר מזכוכית. השתמש מזכוכית פסטר הצינור כדי להעביר את מדגם המגון עד שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולשמור על קרח.
    הערה: אם רק ניתוח הרכב הממברנה הכולל רצוי, החלף 1 מ ל בצפיפות נמוכה isopycnic-סוכרוז מעבר הצבע עבור 1 מ ל של מאגר אחסון של ממברנה מבודדת. שלב 5.5 הוא נקודת הקצה של בידוד, אם יש צורך רק בדגימות ממברנה הכולל בקטריאלי. יש לאחסן דגימות ב-20 ° c עד לצורך ניתוח נוסף במורד הזרם.

6. צפיפות מעבר הדרגתי כדי להפריד את הקרומים הכפולים

  1. לאסוף את המספר המתאים של 13 מ"ל פוליפרופילן או ברור במיוחד צינורות העליון שצוין עבור רוטור דלי מנופף ו ultracentrifuge.
  2. החזיקו את הצינור בתנוחה מוטה מעט והכינו את הדרגתי בהדרגה באמצעות הוספה איטית של פתרונות סוכות מדחיסות גבוהה יותר לצפיפות נמוכה יותר בסדר הבא:
    2 מ ל של 73% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    4 מ ל של 53% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 mM טריס pH 7.5
    1. לאחר מכן, להוסיף את שבר הקרום הכולל (1 mL), אשר הושעה מחדש 20% w/v הפתרון השני (שלב 5.5). הימנע מערבוב שבריר של קרום עם הפתרון של סוכות שנמצא מתחתיו. מחלקות צריכות להיות גלויות בין כל אחת משכבות אלה.
    2. לבסוף, למלא את הצינור עם הצפיפות הנמוכה isopycnic-סוכות הפתרון הדרגתי (כ. 6 מ"ל). פוליפרופילן ו אולטרה ברור העליון לפתוח צינורות צריך להיות מלא ככל האפשר (2 או 3 מ"מ מן הצינור העליון) עבור תמיכה tube.
  3. כוונון לביטוח העצמי 17978
    1. התאמת מעבר שיפוע מותאם לשימוש עם דגימות שונות של חיידקים. עבור בעלי הביטוחהעצמי, מעבר הצבע הבאים של סוכות הינו הפרדה מלאה יותר של הקרומים (איור 2).
      2 מ ל של 73% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 mM טריס pH 7.5
      4 מ ל של 45% w/v סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 1 mM טריס pH 7.5
    2. לאחר מכן, להוסיף את שבר הקרום הכולל (1 mL), אשר הושעה מחדש 20% w/v הפתרון השני (שלב 5.5). הימנע מערבוב שבריר של קרום עם הפתרון של סוכות שנמצא מתחתיו. מחלקות צריכות להיות גלויות בין כל אחת משכבות אלה.
    3. לבסוף, למלא את הצינור עם צפיפות נמוכה isopycnic-סוכות הפתרון הדרגתי (כ. 6 מ"ל). פוליפרופילן ו אולטרה ברור העליון לפתוח צינורות צריך להיות מלא ככל האפשר (2 או 3 מ"מ מן הצינור העליון) עבור תמיכה tube.
  4. Ultracentrifuge את הדגימות באמצעות רוטור-דלי מתנדנד ב 288,000 x g ו 4 ° c בלילה.
    הערה: עבור אמצעי האחסון המשמשים בשלבים הקודמים, אנו ממליצים צנטריפוגה פעמים בין 16 h ו -23 שעות.
  5. חותכים את הקצה של מP1000. בערך 5 מ"מ מהנקודה הסר את שכבת הIM הגבוהה בחום באמצעות הפיפטה. העבר את שבר IM לתוך בקבוק פוליקרבונט עבור העברת הודעות.
  6. השאירו כ-2 מ ל של פתרון סוכות מעל 53-73% ממשק כדי להבטיח אום לבן תחתון לא לחצות מזוהם עם שבר IM. חזור על תהליך הליטוף משלב 6.4 עבור שבר ה-OM (איור 1).
    הערה: ניתן גם לאסוף את הקרומים על ידי שתיל את צינורות הצנטריפוגה בתחתית באמצעות מחט ואיסוף הקרומים כמו dropwise שברים.
  7. מלאו את החלל הנותר של הצינור הultracentrifuge עם מאגר אחסון ממברנלי מבודד ומערבבים על ידי היפוך או מלטף. . שמור את הדגימות על הקרח
  8. לאסוף את הקרומים שנשטפו כעת מבודדים על ידי הארכה ב 184,500 x g עבור 1 h ו 4 ° c.
  9. מחק את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הממברנות באמצעות דגרם-הומוגון. הוסף 500-1000 μL של מאגר האחסון. לאסוף דגימות 2 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות.
  10. מאחסנים את דגימות הממברנה החיידקית ב-20 ° c.

7. אישור הפרדת הבילאיירס

הערה: הפרדה לא שלמה של bilayers יכול להתרחש עקב שגיאה טכנית או הרכב ייחודי המעטפה התא של מינים מסוימים. כדי לאשר הפרדה, אנו מייעצים להשתמש בשני מסכים עצמאיים לכמת את מידת הזיהום בין הביאיירס. הפעם הראשונה מגלה את הפעילות האנזימטית של NADH דהידרוגנאז, הקיימת בלעדית ב-IM. הקיום השני מזהה את הנוכחות של לוס או LPS, אשר קיים בעיקר באום.

  1. מאשרת כי ה-OMs מבודדים מ-IMs
    1. למדוד את ריכוז החלבון בכל שבר קרום בודד באמצעות שיטת ברדפורד חלבון.
    2. הוסף את נפח המדגם המתאים בין 50 ו 500 μg של חלבון לצינור ריק מיקרוצנטריפוגה 2 mL. הריכוז יהיה משתנה בהתאם למין, אבל 50 μg הוא בדרך כלל מספיק עבור Enterקובטרסיים. הוסף את הנפח המתאים של 10 מ"מ מאגר Tris כדי להשיג נפח כולל של 990 μL. העבר את התוכן לקובט עבור ספקטרופוטומטר.
    3. הוסף 10 μL של פתרון 10 מ"ג/mL של NADH למדגם ולמדוד את ספיגת הראשונית ב 340 ננומטר.
    4. המשיכו למדוד את ספיגת כל 30 הסוגים במשך 5 דקות.
    5. הידור הנתונים והגרף של השינוי בסדר הספיגה (ציר y) לעומת השינוי בזמן (ציר x) עבור כל שבר ממברנה (איור 3).
  2. מאשרת כי ה-IMs מבודדים מן ה-OMs
    1. הוסף את נפח המדגם המתאים בין 50 ו 500 μg של חלבון לצינור ריק מיקרוצנטריפוגה 2 mL. הריכוז יהיה משתנה בהתאם למין החיידקי, אבל 50 μg הוא בדרך כלל מספיק עבור Enterקובטרסיים. למלא את הנפח הסופי של 100 μL עם תמיסת מלח מאגור פוספט, אשר להלן המכונה שלב מימית.
    2. הוסף 5 μL של פרוטאינאז K (800 U/mL) לשלב המים מימית ולבן לילה ב 59 ° c.
    3. חם 10 מ"ל מטרים של טריס פנול-רוויים במשך 10 דקות ב 68 ° c.
    4. ספין למטה דגימות שלב מימית שטופלו על ידי פרוטאינאז K ולהוסיף את "חם" Tris-רווי פנול ביחס 1:1 עם השלב מימית, מערבולת במרץ ו דגירה ב 68 ° צ' עבור 10 דקות.
    5. העבירו את הדגימות של החלב הלבן עכשיו מ 68 ° צ' לאמבט מים-קרח והמשך 10 דקות.
    6. צנטריפוגה את הדגימות ב 2,100 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    7. העבר את השלב העליון מימית לצינור חדש ולאחסן את הצינור ב-20 ° c אם אין להשתמש במדגם באופן מיידי.
    8. לדלל דגימות במאגר SDS-טעינת ולטעון את הבארות של 4-20% טריס-גליצין ג'ל מעבר הצבע.
    9. אלקטרופורזה עבור 45 דקות או עד הצבע הקדמי הוא בתחתית ג'ל.
    10. הכתם את ג'ל באמצעות ערכת מכתים LPS לאחר הוראות היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טכניקה זו מספקת אמצעים יעילים כדי לבודד את IMs ו-OMs עבור חיידקים גראם שליליים. קו מיתאר של ההליך כולו מומחש (איור 1). באופן כללי, נורמליזציה של תרבויות ל-OD600 של 0.6-0.8 ב 1 L של אמצעי תקשורת, או קציר בין 6.0 ו 8.0 x 1011 תאים חיידקיים יבטיחו כי הכמות המתאימה של חומר ממברנה נאסף עבור הפרדת הבאים.

עם לאחר לשיר את החיידקים ומדרבן את ליפוסט, גלולה חום דביק כולל הקרום יהיה גלוי בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. לאחר הגירוד, הומוגניזציה, ומעבר לקרום הממברנה על הצפיפות הרציפה של הפררוז, יש להפריד בין הודעות הIM והאום כמתואר (איור 2). מצאנו ש-20% 53% (w/v) מעבר הדרגתי של צפיפות הצבע לא היה מספיק כדי לחלק את המעטפה של א. בהביטוחהעצמי, בעוד 45 20%%/73% w/v הדרגתי היה מספיק (איור 2).

שיטות אנליטיות שונות ניתן להשתמש כדי להעריך את האיכות והטוהר של כל שבר ממברנה. נדב-דהידרוגנאז הוא אנזים ממברנה פנימי, המריץ חמצון של NADH ל-NAD (איור 3). בהינתן הלוקליזציה הסלולר שלה, זה יכול לשמש כדי לקבוע זיהום הצולב בין IMs ו-OMs. על פי ספקטרום הספיגה של שתי המולקולות, ל-NAD ו-NADH יש ספיגת שיא ב260 ננומטר, ואילו רק ל-NADH יש ספיגה מקסימלית ב 340 ננומטר. לפיכך, ירידה בספיגת ה340 ננומטר תהיה מעידה על חמצון של NADH ל-NAD ולכן הימצאות האנזים במדגם. אם הקרומים מופרדים כראוי, השינוי בספיגה צריך להופיע רק בדגימות IM (איור 3). ירידה בדגימות ה-OM מצביעה על זיהום צולב בחומרי מיידיות. בשביל הביטוחהעצמי, פי שלושה מכמות הקרום, או 150 μg של חלבון המקבילות, היה צורך להפגין רמות דומות של פעילות הדגנאז של nadh על מה שנמדד עבור הזנים המדומים (איור 3). לכן, ייתכן שרמות ה-NADH אוקסידאז נמוכות יותר עבור משפחת הביטוח העצמי או שהפעילות המסוימת של האנזים מצומצמת.

העלון החיצוני של האום מורכב בעיקר ממולקולות של לוס או LPS. לכן, החילוץ של LPS/LOS מן הדגימות IM ו-OM עם האלקטרופורזה הבאים ויזואליזציה של LPS כתמים ישקף את העשרת המבנים האלה באום בהשוואה לשברים IM. סינתזה של לוס ו LPS מולקולות מתחיל בציטופלסמה והוא הושלם על פני השטח של IM5. מבני לוס ו-LPS הם בעלי מבנה חד ממדי לאום ומוכנסים לתוך העלון החיצוני. מאחר שביוסינתזה כרוכה בהחזקה מקודמת ל-IM, תבנית של פסים עמומים תמיד נצפתה לשברים IM. עם זאת, האינטנסיביות של המולקולות בשבר אום גדול הרבה יותר מאשר בשבר IM, בשל העשרת המבנים לוס/LPS (איור 4). כמות הקרום שהושג נמדד על ידי קביעת ריכוז החלבון בהשעיה. שש פעמים את כמות הקרום היה הכרחי כדי לחלץ ולאתר את לוס אנג'לס מ . baumannii מוסד לעומת הסכום הדרוש כדי לזהות מולקולות lps מן האורגניזמים בידור (איור 4). אנו מסיבה כי זה עשוי לשקף רמה ירידה של מולקולות לוס אנג'לס ב-OM עבור אורגניזמים אלה לעומת רמות החלבון, אבל לא רדפו השערה זו בפרוטרוט.

Figure 1
איור 1: סכמטי המתאר את הליך הבידוד החיידקי גראם שלילי המתואר במאמר שיטות זה. מוצג הוא ההליך המשמש לאיסוף תאים חיידקיים ובידוד הכולל, הפנימי (IM), והקרומים החיצוניים (OM). הגישה נשענת על צפיפות מוגברת של האום bilayer עבור חיידקים אלה לעומת צפיפות של הודעות IM bilayer. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התוצאות הייצוגיות למינים שונים של גראם שליליים שהקרומים שלהם היו מבודדים באמצעות התקן ומעברי הצבע השונים המתוארים בצפיפות המתואר במאמר זה. תמונות של צפיפות מעברי העמוד ממעברי-הצבע isopycnic צנטריפוגה עבור (A) פראי סוג סלמונלה בידור Serovar typhimurium 14028S, (ב) גייל-מוטציה S. Typhimurium, אשר מייצרת מולקולות lps כי הם נטולי O-אנטיגנים, ו (ג) esהמאביק קולי K-12 DH5α, אשר מייצרת גם מולקולות lps כי חסר O-אנטיגנים. הקרום הפנימי (IM) מופרד מן הקרום החיצוני (OM) ומ20-53% סוכרוז ממשק כחומר חום. שכבת ה-OM הלבנה מוקרת אל 53-73% סוכרוז ממשק בשל צפיפות גבוהה יותר של שבר זה. (ד) הקרומים הכולל של האקניטבק הפראי באואנסיטר 17978 לא הפרידו באמצעות 20%/53% (w/v) מעבר הדרגתי, (E), אך הופרד באמצעות 20%%-73% (w/v) מעבר הצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות הנציג של הבחינה הדגנאז של NADH לבדוק את הקרום החיצוני (OM) טוהר. נוכחות האנזים, נדב-דגנאז, נבדקה בדגימות פנימיות (IM) ו-OM כדי לבחון את יעילות ההפרדה. (א) החמצון של nadh ל-NAD מזרז על ידי אנזים הממוקם ב-IM חיידקי. למצע הריאקציה (NADH) יש ספיגת מקסימום ב 340 ננומטר; לכן, ירידה בצפיפות אופטית באורך הגל הזה מעיד על נוכחות האנזים במדגם. IMs ו-OMs נמדדו עבור (ב) פראי סוג S. Typhimurium, (ג) E. coli K-12 DH5α ו-(ד) גייל-מוטציה S. . סוג של מוטיום הקרומים הללו בודלו באמצעות מעבר צפיפות של 20%/53% w/v סוכרוז. עבור בעלי הביטוחהעצמי, הקרומים היו מבודדים באמצעות מעבר של 20%%/70%/v סוכרוז. שיטת NADH כדי לבדוק את טוהר הקרומים נעשה באמצעות (E) 50 μg עבור אורגניזמים בידור ומסך (F) 150 μg של חלבונים מוחלטים עבור A. באומנביטוח. ריכוז גבוה יותר של חלבון התווסף (F), מאז העיקול (E) הציע כי הרמות היחסיות של nadh de, לעומת חלבון מוחלט היה פחות עבור בעלי . . היסטרמויום ואי קולי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות הנציג של הליך החילוץ וההדמיה של ה-LPS ו-LOS לבדיקת טוהר הממברנה הפנימית (IM). נפח של דגימת ממברנה המקבילה 50 μg של חלבון מוחלט שימש כדי לחלץ LPS מ-IM והקרום החיצוני (OM) של S. . היסטרמויום ואי קולי DH5-אלפא נפח של דגימת ממברנה המקבילה 300 μg של חלבון מוחלט שימש כדי לחלץ LPS מן הקרומים של א. באומנביטוח. אמצעי האחסון היו מנורמלים ל-100 μl עם מים ללא אנדוטוקסין וטופלו באמצעות פרוטטינוז. LPS או לוס הופק על ידי מיצוי חם פנול (1:1 מים: פנול) ו 21 μl של תמציות היו טעונים על 4-20% פוליאקרילמיד ג'ל הדרגתי ודמיינו על ידי PRO-Q אמרלד 300 כתמים כדי להעריך את זיהום הצלב של שברים IM עם חומרים OM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטה זו תמשיך לסייע לחוקרים להבין את התפקיד של מעטפת התא בפיזיולוגיה חיידקי ופתוגנזה. לאחר השלבים הרציפים של שלבים מטוהרים הכולל, הפנימי, ו-OM ניתן להשיג. ממברנות אלה יכולים להיות מותקפים בבידוד כדי לבדוק השערות הקשורות לוקליזציה של חלבון ממברנה ותפקוד, הובלה וסחר ברחבי הפריפלמטר, ואת הרכב של bilayers הפרט בתנאים סביבתיים שונים. מחקרים ביולוגיים לחקור את המעורבות של רכיבי OM בודדים בפתוגנזה, כגון לוס/LPS ו-OM חלבונים, ניתן גם להתנהל במודלים בעלי חיים וסלולר באמצעות שברים קרום מבודדים שנאסף על ידי טכניקה זו.

הנוהל שלנו הותאם במיוחד לשימוש עם בוטקובאכניים, בעיקר S. Typhimurium, אשר מייצרת LPS מולקולות המכילות O-אנטיגנים של שרשרת משתנה אורך. פרוטוקול זה גם עובד עבור החיידק מודל, E. coli K-12, אשר איבד את היכולת הגנטית לסנתז O-אנטיגנים. באמצעות סוג פראי ו-אנטיגן לקוי . 14028s ו- E. coli הזנים K-12 זן DH5α, אנו מראים כי היכולת להפריד את הקרומים עבור חיידקים אלה לא מושפע באופן משמעותי על ידי נוכחות של O-אנטיגנים. עם זאת, כדי להפריד את המעטפה של החיידק בהפקת לוס, A. baumannii לביטוח 17978, היינו צריכים להפחית את הריכוז של הפתרון בצפיפות בינונית במעבר הדרגתי כדי לבודד את הבילאיירס (איור 2). בפרט, העברת הריכוז של פתרון צפיפות האמצע מ 53 כדי 45% היה מספיק כדי לאפשר אום למחיצה ל 45-73% ממשק במעבר הצבע המותאם. בעת שימוש במעבר הצבע 53-73% עבור A. baumanniiרוב החומר אום נצפתה לעתים קרובות מעט מתחת לשבר IM בממשק 20-53% (איור 2). חומר אום דליל הופיע בממשק 53-73% עבור הביטוח העצמי. תוצאות אלה הראו כי 20%/53% הדרגתי אינו מספיק להפריד את הבילאיירס של א. בלנוביטוח בתנאים אלה.

לסיכום, ניתן לבצע התאמות על מעבר הצפיפות כדי להתאים אורגניזמים עם תוכן מגוון-גליקולפיד ורמת, ואת הגישה ניתן להתאים עבור חיידקים גראם שליליים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

העבודה הזאת ממומנת על ידי P20GM10344 ו R01AI139248 הוענק ז. ד. דלבריבלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי <em>הביטוח</em> העצמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter