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Immunology and Infection

Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.

Abstract

Questo metodo funziona partizionando l'involucro di batteri Gram-negativi in frazioni di membrana totale, interna ed esterna (OM) e si conclude con saggi per valutare la purezza dei bistrati. L'OM ha una densità complessiva aumentata rispetto alla membrana interna, in gran parte a causa della presenza di lipooligosaccori (LOS) e lipopolysaccharides (LPS) all'interno del volantino esterno. Le molecole LOS e LPS sono glicolipidi anfipatici che hanno una struttura simile, che consiste in un lipidico-Asaccharolipid e nucleo-oligosaccharide substituente. Tuttavia, solo le molecole LPS sono decorate con una terza sottounità nota come O-polysaccharide, o O-antigen. Il tipo e la quantità di glicolididi presenti influiranno sulla densità OM di un organismo. Pertanto, abbiamo testato se le membrane di batteri con contenuto glicolico vario potrebbero essere isolate in modo simile utilizzando la nostra tecnica. Per gli organismi che producono LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli, le membrane erano facilmente isolate e la moiety LPS O-antigene non ha influenzato il partizionamento del bistrato. Acinetobacter baumannii produce molecole LOS, che hanno una massa simile alle molecole LPS carenti di O-antigen; tuttavia, le membrane di questi microbi non potevano inizialmente essere separate. Abbiamo ragionato sul fatto che l'OM di A. baumannii era meno denso di quello di Enterobacteriaceae, quindi il gradiente di saccarosio è stato regolato e le membrane sono state isolate. La tecnica può quindi essere adattata e modificata per l'uso con altri organismi.

Introduction

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I batteri Gram-negativi producono due membrane separate da uno spazio periplasmico e da una parete cellulare peptidoglycan1. La membrana interna (IM) racchiude il citosol ed è un bistrato simmetrico di fosfolipidi. Peptidoglycan protegge dalla pressione del turgor e fornisce al batterio una forma cellulare, ed è attaccato alla membrana esterna (OM) da lipoproteine2,3. L'OM circonda il periplasma ed è prevalentemente asimmetrico. Il volantino interno è costituito da fosfolipidi e il volantino esterno è costituito da glicolipidi noti come lipooligosaccori (LOS) o lipopoliosaccori (LPS)4,5. L'asimmetria lipidica e la biochimica delle molecole LOS/LPS nel foglio esterno conferiscono proprietà di barriera alla superficie cellulare che proteggono il batterio dai pericoli nel suo ambiente6,7.

Le molecole LPS sono costituite da tre costituenti: il lipido A disaccharolipid, l'oligosaccharide del nucleo e l'O-polysaccharide o O-antigen. Il lipid A è un disaccatipio moltiplicato. Core-oligosaccharides sono costituiti da 10-15 zuccheri noti come LPS grezzi o R-LPS. Il nucleo è suddiviso nella regione interna, composta da 2-keto-3-deossiosa-D-manno-octuloniciati (kdo) e uno o più residui di eptosi, e una regione esterna che consiste generalmente di esrossi (glucosio o galactose) ed eptosi, o zuccheri di acetamido5 . L'area del nucleo esterno è più variabile nei suoi componenti e struttura rispetto al nucleo interno. In Salmonella spp., è stata descritta solo una struttura centrale; tuttavia, in Escherichia coli ci sono cinque diverse strutture centrali (designato K-12, R1, R2, R3 e R4)8. E. coli K-12 DH5, che usiamo in questa procedura porta una mutazione che si traduce nella produzione di R-LPS9. Le molecole R-LPS non hanno la moiety O-antigene e hanno un peso molecolare simile alle molecole LOS.

L'aggiunta di O-antigen a R-LPS trasforma questa molecola in LPS lisci, o S-LPS. Gli antigeni O sono costruiti da brevi sottounità di carboidrati 3-4 e consistono in molteplici modalità con diverse lunghezze di catena10. Alcuni batteri che producono LPS, come la Salmonella enterica siriburia Typhimurium (S. Typhimurium), visualizzare una distribuzione trimodale di molecole LPS sulla loro superficie10,11. Gli antigeni O-antigeni a catena molto lunga possono contenere oltre cento sottounità e pesare oltre cento chilodaltoni. Gli antigeni O forniscono proprietà superficiali al batterio che sono necessarie per resistere agli antibiotici, eludere la predazione da batteriofagi e causare malattie.

Specie di Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e altri generano molecole LOS invece di molecole LPS sulla loro superficie12. Le molecole LOS sono costituite da oligosaccaridi lipidi e core, ma non hanno l'antigene O. Questi tipi di batteri Gram-negativi modificano le loro oligosaccoridi del nucleo con zuccheri aggiuntivi e combinazioni di zuccheri per alterare le proprietà della superficie12. Sia i microbi che loS e i microbi che producono LPS derivano i fosfati sul lipido A e sulle molecole centrali con moieties cationiche7. Queste aggiunte includono fosfoetanolamina, galactosamine e sostituti aminoarabinosi, che funzionano neutralizzando la carica superficiale anionica e proteggendo così contro i peptidi antimicrobici cationici. I batteri Gram-negativi modificano anche la struttura del nucleo dell'oligosaccoride con sostituzioni variabili non stoichiometriche di zuccheri, o molecole extra kdo, e alterano il numero di catene di acili su lipid-A disaccharolipids7.

La capacità di isolare l'IM dall'OM dei batteri Gram-negativi è stata fondamentale per comprendere il ruolo dell'involucro cellulare nella resistenza antimicrobica e nella patogenesi della malattia11,12. Le derivazioni di questo approccio sono state utilizzate per dedurre i meccanismi di assemblaggio, manutenzione e rimodellamento della proteina, del fosfolipido e dei costituenti glicolipidi per l'OM.

Il nostro laboratorio esegue regolarmente analisi lipidomiche batteriche per studiare la regolazione dei lipidi mediati da proteine e la funzione lipidica in una varietà di specie Gram-negative. I volumi utilizzati nel protocollo riflettono l'uso di routine di questa procedura per analizzare fosfolipidi non etichettati con etichettatura non radiografica mediante cromatografia a strati sottili e spettrometria di massa tandem di cromato liquida13,14.

Il protocollo inizia esponendo una sospensione refrigerata di batteri Gram-negativi a una soluzione ad alta osmolare di saccarosio e aggiungendo lysozyme per dissociare l'OM dallo strato peptidoglycan sottostante (Figura 1)12. L'EDTA viene quindi aggiunto per facilitare la penetrazione del liso, poiché il sequestro della cation divalente interrompe le interazioni di bridging elettrostatico laterale tra molecole LOS/LPS adiacenti15. Il protocollo originale da cui è stato adattato il nostro richiedeva la formazione di sferoplasti, una forma di cellule batteriche Gram-negative che consistono in una membrana plasmatica e un citosol, ma manca dello strato peptidoglycan e di un OM. È possibile che gli sferoplasts siano prodotti con il metodo adattato; tuttavia, la tecnica non si basa o intende sulla loro formazione per il successo. Invece, i batteri trattati lysozyme-EDTA vengono rapidamente raccolti dalla centrifugazione e ri-sospesi in una soluzione di saccarosio di minore concentrazione prima della lissi pressurizzata. Le OM che potrebbero essere state rilasciate formando sferoplasti dovrebbero in teoria essere raccoglibili dai supernatanti delle cellule trattate, ma questo approccio non è dettagliato nel presente documento. In definitiva, le cellule trattate sono sottoposte a omogeneizzazione e lisi convenzionale, che migliora l'efficienza e la riproducibilità della procedura di separazione della membrana16.

Dopo la lisi, le membrane totali vengono raccolte per ultracentrifugazione e applicate a un gradiente di densità di discontinuo di saccarosio per frazionare gli IM e gli OM. L'approccio classico utilizza un gradiente più continuo costituito da almeno cinque diverse soluzioni di saccarosio11,12. Il gradiente discontinuo nel nostro protocollo è costituito da tre soluzioni di saccarosio e divide i bistrati in due frazioni distinte17. Le molecole LOS e LPS all'interno delle OM dei batteri Gram-negativi spingono l'involucro a dividersi in una frazione IM a bassa densità marrone superiore e in una frazione OM bianca ad alta densità inferiore(Figura 1 e Figura 2).

Acinetobacter baumannii sono importanti patogeni umani multifarmacoresistenti che producono molecole LOS nel loro OM ed erigono un involucro cellulare che è difficile separare18,19. Recenti lavori suggeriscono che una derivazione del protocollo che presentiamo qui può essere utilizzata per dividere i bistrati di questi organismi20. Pertanto, abbiamo testato il nostro protocollo su A. baumannii 17978. Inizialmente, la procedura era inadeguata. Tuttavia, abbiamo modificato la concentrazione di saccarosio della soluzione a densità media e migliorato notevolmente la separazione (Figura 2). È stato utilizzato un assaggio di disidrogeno NADH e una procedura di estrazione e rilevazione LOS/LPS per confermare la separazione per A. baumannii, di tipo selvaggio S. Typhimurium e due genotipi enterobatterici carenti di O-antigene; vale a dire, galE-mutant S. Typhimurium e un ceppo di laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 e Figura 4).

L'intento di questo lavoro è quello di fornire un approccio semplificato per isolare riproducibilmente le membrane dei batteri Gram-negativi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare molti tipi di molecole associate alla membrana per questi microbi.

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Protocol

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1. Reagenti generali e preparazione dei supporti per l'estrazione delle membrane

  1. Supporti di crescita batterica: Preparare e sterilizzare 1 L di supporti di brodo in un flacone completamente pulito e autoclaved 2 L.
  2. Buffer di sospensione generale (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissolvere 6,05 g di base Tris in 30 mL di H2O. Regolare il pH a 7,5 con 5 M HCl. Regolare il volume finale a 50 mL con ultrapure H2O.
  3. Stock master della soluzione di chelazione cation divalent (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Aggiungere 18,6 g di disonidio tetraacetate-2H2O a 80 mL di H2O. Stir vigorosamente e regolare il pH a 8,0 con NaOH. Regolare il volume finale a 100 mL con ultrapure H2O.
    NOT: Il sale dissodio di EDTA non si dissolve fino a quando il pH della soluzione non sarà regolato a 8,0 dollari con l'aggiunta di NaOH.
  4. Buffer osmotico A (0,5 M di saccarosio, 10 mM Tris pH 7,5; 1 L): Pesare 171,15 g di saccarosio e trasferire a un cilindro da 1 L. Aggiungere 10 mL di 1 M Tris pH 7.5. Regolare ad un volume finale di 1 L con ultrapure H2O. Memorizzare a 4 gradi centigradi.
  5. Lysozyme (10 mg/mL; 5 mL): Pesare 50 mg di liso-uovo di gallina) lisittarmi e sciogliere in 5 mL ultrapuro H2O. Memorizzare a 4 gradi centigradi.
  6. Soluzione didiluita di chelazione di cation diavalente (1,5 mM EDTA; 500 mL): aggiungere 1,5 mL di 0,5 M EDTA (passaggio 1.3) a 497,5 mL ultrapure H2O. Store a 4 gradi centigradi.
  7. Buffer osmotico B (0,2 M di saccarosio, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): Pesare 136,8 g di saccarosio e trasferire a un cilindro da 2 L. Aggiungere 20 mL di 1 M Tris pH 7.5. Regolare il volume finale a 2 L con ultrapure H2O. Memorizzare a 4 gradi centigradi.
  8. Co-factor di nuclea (1 M MgCl2; 10 mL): Dissolvere 2,03 g di MgCl2x 6H2O in 8 mL di ultrapuro H2O. Regolare il volume a 10 mL. Conservare a temperatura ambiente.
  9. Cocktail di soluzione Nuclease tra cui RNase e DNase enzimi: Vedere Tabella dei materiali. Conservare a -20 gradi centigradi.
  10. Cocktail inibitore Protease: Vedi Tabella dei Materiali. Conservare a 4 gradi centigradi.
  11. Soluzione a gradiente isonico per sofcrosi a bassa densità (20% di saccarosio w/v, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Soluzione; 100 mL): pesare 20 g di saccarosio e trasferirli a un cilindro da 200 mL. Aggiungete 100 l di 1 M Tris Buffer pH 7,5 e 200 l di 0,5 M EDTA pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con ultrapure H2O. Conservare a temperatura ambiente.
  12. Soluzione di gradiente isonico per sofcrosi (53% di saccarosio w/v, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Soluzione; 100 mL): pesare 53 g di saccarosio e trasferirli in un cilindro graduato da 200 mL. Aggiungete 100 l di 1 M Tris Buffer pH 7,5 e 200 l di 0,5 M EDTA pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con ultrapure H2O. Conservare a temperatura ambiente.
    NOT: Preparare questa soluzione in un cilindro graduato per garantire la precisione dovuta all'alta percentuale di saccarosio. Aggiungere una barra magnetica di agitazione e mescolare fino a quando il saccarosio è completamente sciolto in soluzione. Questo processo può richiedere diverse ore.
  13. Soluzione di gradiente isonico per sofcrosi ad alta densità (73% di saccarosio w/v, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Soluzione; 100 mL): Pesare 73 g di saccarosio e trasferirli in un cilindro graduato da 200 mL. Aggiungete 100 l di 1 M Tris Buffer pH 7,5 e 200 l di 0,5 M EDTA pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con ultrapure H2O. Conservare a temperatura ambiente.
    NOT: Preparare questa soluzione in un cilindro graduato per garantire la precisione dovuta all'alta percentuale di saccarosio. Aggiungere una barra magnetica di agitazione e mescolare fino a quando il saccarosio è completamente sciolto. Questo processo può richiedere diverse ore.
  14. Buffer di stoccaggio a membrana isolata (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): aggiungere 1 mL di 1 M Tris Buffer pH 7.5 a un flacone da 1 L e regolare il volume finale a 1 L con ultrapure H2O.
  15. Dinucleotide adenina (NADH) (soluzione da 10 mg/mL): Risospendere 10 mg di NADH in ultrapure H2O. Preparare le scorte fresche, settimanalmente. Conservare a -20 gradi centigradi.
  16. Soluzione fenolo equilibrata con 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Vedi Tabella dei Materiali. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.
  17. Lipopolysaccharide gel macchia kit: Vedi Tabella dei Materiali.
  18. Bradford reagent: Vedi Tabella dei Materiali.
    NOTA: tutte le soluzioni e i supporti devono essere preparati entro la settimana dall'esecuzione dell'esempio per garantire risultati coerenti.

2. Preparazione dei batteri per l'estrazione delle membrane

  1. Streak i batteri da scorte di glicerolo congelati su piastre di agar fresco. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi una volta che si sviluppano le colonie. Inoculare una singola colonia in un tubo da 5 mL riempito con mezzi di brodo e coltura i batteri come desiderato durante la notte.
  2. Diluire la coltura batterica durante la notte in 1 L dei supporti di brodo preferito e coltura i batteri fino a raggiungere la densità ottica desiderata.
    NOT: L'inoculazione di una singola colonia batterica in 1 L di supporti di brodo è raccomandata per i genotipi mutanti che sono inclini a sopprimere i fenotipi della crescita, ma alcuni batteri Gram-negativi crescono semplicemente più lentamente di altri. Se non è possibile ottenere una densità di coltura sufficiente per inoculazione di una singola colonia, la diluizione di una cultura overnight in 1 L di media è una strategia per sincronizzare la crescita. La composizione batterica-membrana varia a seconda della fase di crescita della coltura (fase logaritmica vs stazionaria)13. Le curve di crescita che misurano il cambiamento della densità ottica per le colture batteriche in funzione del tempo devono essere eseguite con tutti i ceppi per correlare la densità della coltura con la fase di crescita.
  3. Impostare i flaconi contenenti le colture di brodo sul ghiaccio. Leggere la densità ottica a 600 nm (OD600)e calcolare il volume di coltura che è equivalente a tra 6,0 e 8,0 x 1011 unità di formazione colonia batterica (cfu). Per S. Typhimurium, questo corrisponde a 1 L di coltura a un OD600 compreso tra 0,6-0,8, dal momento che un OD600 di 1.0 è uguale a circa 1.0x109 cfu/mL. Aggiungere questo volume a un tubo di centrifuga e assicurarsi che le colture rimanenti rimangano sul ghiaccio fino a quando non devono essere utilizzate.
  4. Pellet i batteri per centrifugazione a 4 gradi centigradi a 7.000-10.000 x g in una centrifuga ad alta velocità ad angolo fisso per 10 min.
    NOT: Pre-raffreddare e mantenere le centrifughe a bassa temperatura. Mantenere i campioni sul ghiaccio durante l'intera procedura.
  5. Decant e scartare il supernatante con attenzione.
    NOT: Il pellet può essere congelato flash e/o conservato a -80 gradi centigradi se le frazioni di membrana non verranno estratte immediatamente. Tuttavia, si raccomanda di procedere direttamente con plasmolisi lo stesso giorno in cui vengono raccolte le cellule, ed è particolarmente raccomandato per le specie non enterobatteriche.

3. Dissociazione della membrana esterna e della plasmolisi

  1. Scongelare i pellet cellulari sul ghiaccio se precedentemente conservati a -80 gradi centigradi e conservare i campioni sul ghiaccio per il resto della procedura. Risospendere ogni pellet cellulare all'interno del tubo centrifuga in 12,5 mL del buffer A. Aggiungere una barra di agitazione magnetica alla sospensione delle cellule.
  2. Aggiungere 180 luna di 10 mg/mL lysozyme (concentrazione finale di 144 g/mL) ad ogni sospensione cellulare. Conservare i campioni sul ghiaccio mescolando per 2 min.
  3. Aggiungere 12,5 mL di 1,5 mM di soluzione EDTA a ogni sospensione cellulare e continuare a mescolare sul ghiaccio per ulteriori 7 min.
  4. Decantare la sospensione in un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 9.000-11.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  5. Eliminare i supernatani in un contenitore di rifiuti biologici e conservare i pellet sul ghiaccio.
  6. Aggiungere 25 mL di buffer B al pellet cellulare.
  7. Aggiungere 55 L L di 1 M MgCl2, 1 L di reagente nucleatorizzato RNase/DNase (per evitare problemi di viscosità associati ai batteri sottoposti a plasmolisi prima dell'omogeneizzazione) e 1 LL di cocktail inibitore della proteasi al volume di buffer B che si trova in cima alla pellet cellulare
  8. Risospendere il pellet nella miscela tamponi B. Vigorosamente pipet e vortice fino a osservare una soluzione omogenea.
    NOT: È molto importante avere una soluzione omogenea prima di procedere alla fase 4 di questo protocollo. Le cellule risospese dovrebbero avere una torta-pastella viscosa come l'aspetto e la consistenza.
  9. Vorticare ogni campione per 15 s. Conservare le sospensioni sul ghiaccio e procedere al passo 4.

4. Omogeneizzazione pressurizzata e lisi

NOT: Diversi metodi possono essere utilizzati per la lisi. La Sonicazione non è ideale a causa della generazione di calore. La lisi osmotica può essere raggiunta, ma spesso è inefficiente. Pertanto, si consiglia di lisi ad alta pressione. La lisi ad alta pressione può essere ottenuta utilizzando una varietà di strumenti. Suggeriamo macchine di omogeneizzazione, come la stampa francese o l'Emusliflex. Lavoriamo con molti tipi di batteri Gram-negativi la cui risposta alle soluzioni di saccarosio ad alta osmolare varia. La fase di omogeneizzazione ad alta pressione migliora l'efficienza, la riproducibilità e la resa.

  1. Prechill la cella della French Press a 4 gradi centigradi o inserire la bobina metallica dalla macchina omogenizzatrice sul ghiaccio.
  2. Versare il campione nella cella a pressione francese o nel cilindro del campione di omogeneizzazione e portare la cella sotto la pressione di omogeneizzazione desiderata (10.000 psi dovrebbe essere adeguata quando si utilizza una stampa francese o 20.000 psi quando si utilizza un omogeneizzatore).
  3. Regolare la portata di uscita a circa una goccia al secondo, mantenendo la pressione se si utilizza una pressa francese.
  4. Raccogliere il lisato cellulare in tubi conici da 50 mL mantenendo i campioni sul ghiaccio.
  5. Ripetere i passaggi da 4.2-4.4 a cinque volte per ottenere una lisi completa, tipicamente indicata da un graduale aumento della trasparenza del campione.
    NOT: La camera del campione deve essere lavata e sistemata con la tampone B tra i campioni.
  6. Mantenere le cellule lisci sul ghiaccio.

5. Frazionamento totale della membrana

  1. Centrifugare i campioni batterici lisci a 6.169 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per pellet rimanendo materiale cellulare intatto. (ad esempio, cellule batteriche non indicizzate).
  2. Distribuire la porzione rimanente del supernatore, che ora contiene le membrane omogeneizzate in una bottiglia di policarbonato per l'ultracentrifugatezione.
    ATTENZIONE: Se necessario, i campioni di cellule possono essere bilanciati diluindo con il buffer B.
  3. Ultracentrifuga la cella lisa a 184.500 x g per almeno 1 h, a 4 gradi centigradi. Questo passaggio può essere eseguito durante la notte senza compromettere la qualità delle membrane.
  4. Scartare il supernatante rimanente presente nel tubo di ultracentrifuga e trattenere i pellet a membrana sul ghiaccio(Figura 1).
  5. Risospendere i pellet a membrana in 1 mL della soluzione a gradiente isopycnico-saccarosio-a bassa densità utilizzando un omogeneizzatore in vetro. Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire l'omogeneità del campione in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e trattenere sul ghiaccio.
    NOT: Se si desidera solo l'analisi totale della composizione della membrana, sostituire 1 mL di soluzione di gradiente isopigico-saccarosio-saccarosio-a bassa densità con 1 mL di buffer di stoccaggio a membrana isolata. Passo 5.5 è il punto finale dell'isolamento se si desiderano solo campioni di membrana totale-batterica. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi fino a quando non sono necessarie ulteriori analisi a valle.

6. Sfumatura di densità Ultracentrifugazione per separare le doppie membrane

  1. Raccogliere il numero appropriato di 13 mL di polipropilene o tubi open-top ultra-chiari specificati per un rotore a benna oscillante e un'ultracentrifuga.
  2. Tenere il tubo in una posizione leggermente inclinata e preparare il gradiente di saccarosio aggiungendo lentamente soluzioni di saccarosio da una maggiore densità a densità inferiore nel seguente ordine:
    2 mL di 73% w/v saccarosio,1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
    4 mL di 53% w/v di saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Aggiungere quindi la frazione di membrana totale (1 mL), che è stata risospesa nella soluzione di saccarosio 20% w/v (passaggio 5.5). Evitare di mescolare la frazione di membrana con la soluzione di saccarosio che si trova sotto di essa. Le divisioni devono essere visibili tra ciascuno di questi livelli.
    2. Infine, riempire il tubo con la soluzione di gradiente isopycnic-sucrose a bassa densità (circa 6 mL). Il polipropilene e i tubi open-top ultra-chiari devono essere riempiti il più possibile (2 o 3 mm dalla parte superiore del tubo) per il supporto del tubo.
  3. Regolazione per Acinetobacter baumannii 17978
    1. Adattare un gradiente di saccarosio regolato per l'uso con diversi campioni batterici. Per A. baumannii, il seguente gradiente di saccarosio ha offerto una separazione più completa delle membrane (Figura 2).
      2 mL di 73% w/v di saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
      4 mL di 45% w/v di saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Aggiungere quindi la frazione di membrana totale (1 mL), che è stata risospesa nella soluzione di saccarosio 20% w/v (passaggio 5.5). Evitare di mescolare la frazione di membrana con la soluzione di saccarosio che si trova sotto di essa. Le divisioni devono essere visibili tra ciascuno di questi livelli.
    3. Infine, riempire il tubo con soluzione di gradiente isopigico-saccarosio-saccarosio-saccarosio-forchese a bassa densità (circa 6 mL). Il polipropilene e i tubi open-top ultra-chiari devono essere riempiti il più possibile (2 o 3 mm dalla parte superiore del tubo) per il supporto del tubo.
  4. Ultracentrifuga i campioni utilizzando un rotore oscillante-secchio a 288.000 x g e 4 gradi durante la notte.
    NOT: Per i volumi utilizzati nei passaggi precedenti, si consiglia di centrifugare tempi tra 16 h e 23 h.
  5. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta P1000 a circa 5 mm dal punto. Rimuovere lo strato di IM superiore-marrone utilizzando la pipetta. Trasferire la frazione IM in una bottiglia di policarbonato per l'ultracentrifugazione.
  6. Lasciare circa 2 mL della soluzione di saccarosio sopra l'interfaccia 53-73% per garantire che l'OM bianco inferiore non sia incrociato con la frazione IM. Ripetere la procedura di pipettaggio dal passaggio 6.4 per la frazione OM (Figura 1).
    NOT: Le membrane possono anche essere raccolte forando i tubi di centrifuga sul fondo utilizzando un ago e raccogliendo le membrane come frazioni dropwise.
  7. Riempire il vuoto rimanente del tubo di ultracentrifuga con buffer di stoccaggio a membrana isolata e mescolare per inversione o pipettaggio. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  8. Raccogliere le membrane ora lavate e isolate con ultracentrifugazione a 184.500 x g per 1 h e 4 gradi centigradi.
  9. Scartare il supernatante e risospendere le membrane dounce-omogeneizzazione. Aggiungete 500-1000 l di buffer di archiviazione. Raccogliere campioni in tubi di microcentrifuga da 2 mL.
  10. Conservare i campioni di membrana batterica a -20 gradi centigradi.

7. Conferma della separazione dei bistrati

NOT: La separazione incompleta dei bistrati può verificarsi a causa di un errore tecnico o della composizione unica dell'involucro cellulare di alcune specie. Per confermare la separazione, consigliamo di utilizzare due saggi indipendenti per quantificare il grado di contaminazione incrociata tra i bistrati. Il primo saggio rileva l'attività enzimatica della dehydrogenasi NADH, che esiste esclusivamente nell'IM. Il secondo saggio rileva la presenza di LOS o LPS, che esiste prevalentemente nell'OM.

  1. Conferma dell'isolamento dei messaggi istantanei
    1. Misurare la concentrazione proteica in ogni frazione di membrana isolata utilizzando un test della proteina Bradford.
    2. Aggiungere il volume del campione corrispondente a 50 e 500 g di proteine in un tubo di microcentrifuga vuoto da 2 mL. La concentrazione varia a seconda della specie, ma 50 g è in genere sufficiente per Enterobacteriaceae. Aggiungere il volume appropriato di 10 mM Tris-buffer per ottenere un volume totale di 990 l. Trasferire il contenuto in una cuvette per la spettrofotometria.
    3. Aggiungete al campione 10 l di una soluzione da 10 mg/mL e misurare l'assorbimento iniziale a 340 nm.
    4. Continuare a misurare l'assorbimento ogni 30 s per 5 min.
    5. Compilare i dati e rappresentare graficamente la modifica dell'assorbimento (asse y) rispetto alla variazione nel tempo (asse x) per ogni frazione di membrana (Figura 3).
  2. Conferma dell'isolamento dei messaggi istantanei dalle oM
    1. Aggiungere il volume del campione corrispondente a 50 e 500 g di proteine in un tubo di microcentrifuga vuoto da 2 mL. La concentrazione varia a seconda delle specie batteriche, ma 50 g sono in genere sufficienti per Enterobacteriaceae. Riempire fino a un volume finale di 100 gradi con fosfato tamponato salina, che è in seguito indicato come la fase acquosa.
    2. Aggiungete 5 -L di Proteinase K (stock 800 U/mL) alla fase accomodante e incubate peruna pertutta la notte a 59 gradi centigradi.
    3. Scaldare un'aliquota di 10 mL di Fenolo saturo di Tris per 10 min a 68 gradi centigradi.
    4. Girare verso il basso i campioni di fase acquosi che sono stati trattati con la Proteinase K e aggiungere il Fenolo "caldo" Tris-saturo ad un rapporto 1:1 con la fase acquosa, vortice vigorosamente e incubare a 68 gradi c per 10 min.
    5. Trasferire i campioni ora bianchi come lattiginosi da 68 gradi centigradi a un bagno di acqua ghiacciata e incubare per 10 min.
    6. Centrifugare i campioni a 2.100 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    7. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo e conservare il tubo a -20 gradi centigradi se il campione non deve essere utilizzato immediatamente.
    8. Diluire i campioni nel buffer di caricamento SDS e caricare i pozze di un gel per gradienti Tris-glycine del 4-20%.
    9. Elettroforese per 45 min o fino a quando il colorante-front è sul fondo del gel.
    10. Macchiare il gel utilizzando il kit di colorazione LPS seguendo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

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Questa tecnica fornisce un mezzo efficace per isolare gli IM e oM per i batteri Gram-negativi. Viene illustrato un quadro dell'intera procedura (Figura 1). In generale, la normalizzazione delle colture a un OD600 di 0,6-0,8 in 1 L di supporti, o la raccolta tra 6,0 e 8,0 x 1011 cellule batteriche garantirà che la quantità appropriata di materiale della membrana venga raccolta per la successiva separazione.

Al momento della lisciviatura dei batteri e dell'ultracentrifuga del lisa, un pellet a membrana totale marrone appiccicoso sarà visibile nella parte inferiore del tubo di ultracentrifuga. Dopo la raschiatura, l'omogeneizzazione e l'ultracentrifugia della membrana sul gradiente di densità di sodio discontinuo, l'IM e l'OM devono essere separati come raffigurato (Figura 2). È stato rilevato che il gradiente a densità di saccarosio 20%/53%/73% (w/v) non era sufficiente per partizionare l'involucro di A. baumannii, mentre un gradiente 20%/45% /73% w/v era sufficiente (Figura 2).45%

Vari metodi analitici possono essere utilizzati per valutare la qualità e la purezza di ogni frazione di membrana. La dihydrogenasi NADH è un enzima della membrana interna che catalizza l'ossidazione NADH a NAD (Figura 3). Data la localizzazione cellulare, può essere utilizzato per determinare la contaminazione incrociata tra messaggi istantanei e OM. Secondo gli spettri di assorbimento di entrambe le molecole, NAD e NADH hanno ciascuno un picco di assorbimento a 260 nm, mentre solo NADH ha una massima assorbimento a 340 nm. Pertanto, una diminuzione dell'assorbimento a 340 nm sarebbe indicativa dell'ossidazione di NADH a NAD e quindi della presenza dell'enzima nel campione. Se le membrane si separano correttamente, questa modifica dell'assorbimento dovrebbe verificarsi solo nei campioni di iM (Figura 3). Una diminuzione dell'assorbimento nei campioni OM indicherebbe una contaminazione incrociata con materiali IM. Per A. baumannii,tre volte la quantità di membrana, o 150 g equivalenti proteici, era necessario per dimostrare livelli simili di attività di dehydrogenasi NADH a quanto misurato per i ceppi enterobatterici (Figura 3). Pertanto, è possibile che i livelli di ossidasi NADH siano inferiori per A. baumannii o che l'attività specifica dell'enzima sia diminuita.

Il volantino esterno dell'OM è composto principalmente da molecole LOS o LPS. Pertanto, l'estrazione di LPS/LOS dai campioni IM e OM con successiva elettroforesi e visualizzazione mediante colorazione LPS rifletterà l'arricchimento di queste strutture nell'OM rispetto alle frazioni IM. La sintesi delle molecole LOS e LPS inizia nel citoplasma e viene completata sulla superficie dell'IM5. Le strutture LOS e LPS vengono trasportate in modo unidirezionale all'OM e inserite nel volantino esterno. Poiché la biosintesi comporta l'attaccamento precursore all'IM, si osserva sempre un debole modello di fasciatura per le frazioni IM. Tuttavia, l'intensità delle molecole nella frazione OM è molto maggiore rispetto alla frazione IM, a causa dell'arricchimento delle strutture LOS/LPS (Figura 4). La quantità di membrana ottenuta è stata misurata determinando la concentrazione proteica nella sospensione. Sei volte la quantità di membrana era necessaria per estrarre e rilevare LOS da A. baumannii rispetto alla quantità necessaria per rilevare molecole LPS dagli organismi enterici (Figura 4). Siamo sulla ragione che questo potrebbe riflettere un livello diminuito di molecole DI LOS nell'OM per questi organismi rispetto ai livelli proteici, ma non hanno perseguito questa ipotesi in dettaglio.

Figure 1
Figura 1: Uno schema raffigurante la procedura di isolamento della membrana batterica Gram-negative descritta in questo articolo dei metodi. Mostrata è la procedura utilizzata per raccogliere le cellule batteriche e isolare le membrane totali, interne (IM) e esterne (OM). L'approccio si basa sull'aumento della densità del bistrato OM per questi microbi rispetto alla densità del bistrato IM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi per diverse specie Gram-negative le cui membrane sono state isolate utilizzando i gradienti di densità di saccarosio standard e modificati descritti in questo articolo. Immagini di gradienti di densità di saccarosio discontinua post centrifugazione isopnica per (A) Salmonella enterica sierovar Typhimurium 14028s,(B) galE-mutante S. Typhimurium LT2, che produce molecole LPS prive di O-antigeni, e (C) Escherichia coli K-12 DH5, che produce anche molecole LPS prive di oantigeni. La membrana interna (IM) è separata dalla membrana esterna (OM) e si localizza all'interfaccia di saccarosio 20-53% come materiale marrone. Il livello OM bianco si localizza nell'interfaccia di saccarosio 53-73% a causa della maggiore densità di questa frazione. (D) Le membrane totali del tipo selvaggio Acinetobacter baumanii 17978 non si separavano utilizzando il gradiente diEsaccarosio 20%/53%/73% (w/v), ma si sono separate utilizzando il gradiente di saccarosio 20%/45%/73% (w/v). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati rappresentativi per l'esempio di dicubsi di dicucumarina NADH per testare la purezza della membrana esterna (OM). La presenza dell'enzima, NADH-dehydrogenase, è stata testata in campioni interni (IM) e OM per testare l'efficienza della separazione. (A) L'ossidazione di NADH a NAD è catalizzata da un enzima situato nell'IM batterico. Il substrato di reazione (NADH) ha una massima assorbimento a 340 nm; pertanto, una diminuzione della densità ottica a questa lunghezza d'onda è indicativa della presenza dell'enzima nel campione. Gli IM e gli OM sono stati misurati per (B) wild-type S. Typhimurium, (C) E. coli K-12 DH5 e (D) galE-mutante S. Typhimurium. Queste membrane sono state isolate utilizzando un gradiente di densità di saccarosio isonico del 20%/53%/73% w/v di saccarosio. Per A. baumannii,le membrane sono state isolate con un gradiente del 20%/45%/73% w/v di saccarosio. Il saggio NADH per testare la purezza delle membrane è stato fatto utilizzando (E) 50 g per gli organismi enterobatterici e (F) 150 g di proteine totali per A. baumannii. Una maggiore concentrazione di proteine è stata aggiunta in (F), dal momento che la curva per (E) ha suggerito che i livelli relativi di dehydrogenasi NADH rispetto alla proteina totale erano inferiori per A. baumannii che per S. Typhimurium ed E. coli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Risultati rappresentativi per la procedura di estrazione e visualizzazione LPS e LOS per testare la purezza della membrana interna (IM). Il volume del campione di membrana corrispondente a 50 g di proteine totali è stato utilizzato per estrarre LPS dall'IM e dalla membrana esterna (OM) di S. Typhimurium e E. coli DH5-alfa. Il volume del campione di membrana corrispondente a 300 g di proteine totali è stato utilizzato per estrarre LPS dalle membrane di A. baumannii. I volumi sono stati normalizzati a 100 ol con acqua priva di endotossina e trattati con Proteinase K. LPS o LOS sono stati estratti per estrazione di fenolo caldo (1:1 acqua:fenolo) e 21 gradi di estratti sono stati caricati su un gel di poliacrilammide sfumato del 4-20% e visualizzati dalla colorazione PRO-Q Emerald 300 per valutare la contaminazione incrociata delle frazioni IM con materiali OM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questo metodo continuerà ad aiutare i ricercatori a comprendere il ruolo dell'involucro cellulare nella fisiologia batterica e nella patogenesi. Seguendo i passaggi di ultracentrifugazione sequenziali si può ottenere un totale purificato, interno e una frazione OM. Queste membrane possono essere scansionate in isolamento per testare ipotesi relative alla localizzazione e alla funzione delle proteine della membrana, al trasporto e al traffico attraverso il periplasm e alla composizione dei singoli bistrati in varie condizioni ambientali. Studi biologici che esplorano il coinvolgimento di singoli componenti OM nella patogenesi, come le proteine LOS/ LPS e OM, possono essere condotti anche in modelli animali e cellulari utilizzando frazioni di membrana isolate raccolte da questa tecnica.

La nostra procedura è stata ottimizzata per l'uso con Enterobacteriaceae, in particolare S. Typhimurium, che produce molecole LPS che contengono o-antigeni di lunghezza variabile della catena. Questo protocollo funziona anche per il batterio modello, E. coli K-12, che ha perso la capacità genetica di sintetizzare O-antigeni. Utilizzando il tipo selvaggio e O-antigene carente S. Typhimurium 14028s e E. coli K-12 ceppo DH5, mostriamo che la capacità di separare le membrane per questi microbi non è sostanzialmente influenzata dalla presenza degli o-antigeni. Tuttavia, per separare l'involucro del batterio che produce LOS, A. baumannii 17978, abbiamo dovuto ridurre la concentrazione della soluzione di saccarosio a densità media nel gradiente discontinuo per isolare i bistrati (Figura 2). In particolare, è stato sufficiente spostare la concentrazione della soluzione a densità media dal 53 al 45% per consentire all'OM di partizionarsi nell'interfaccia 45-73% nel gradiente adattato. Quando si utilizza il gradiente 53-73% per A. baumannii, la maggior parte del materiale OM è stato spesso osservato leggermente al di sotto della frazione IM all'interfaccia 20-53% (Figura 2). Il materiale sparse OM era presente all'interfaccia 53-73% per A. baumannii. Questi risultati hanno suggerito che il gradiente 20%/53%/73% è inadeguato per separare i bistrati di A. baumannii in queste condizioni.

In sintesi, è possibile apportare modifiche al gradiente di densità per accogliere organismi con vari contenuti e livelli OM-glicolipi, e l'approccio può essere adattato per altri batteri Gram-negativi.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato da P20GM10344 e R01AI139248 assegnato a D. Dalebroux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

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References

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Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per <em>Acinetobacter baumannii</em>
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Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

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