Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Разделение конверта клетки для Грам-отрицательных бактерий в Внутренние и Внешние фракции Membrane с Технически регулировками для Acinetobacter baumannii

doi: 10.3791/60517 Published: April 10, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Грамотрицательные бактерии производят две пространственно сегрегированные мембраны. Внешняя мембрана разделена из внутренней мембраны периплазмой и пептидогликанским слоем. Способность изолировать двойные двуслойные эти микробы имеет решающее значение для понимания их физиологии и патогенеза.

Abstract

Этот метод работает путем раздела оболочки грамотрицательных бактерий на общую, внутреннюю и внешнюю мембрану (ОМ) фракции и завершается анализами для оценки чистоты двуслойных. ОМ имеет повышенную общую плотность по сравнению с внутренней мембраной, в основном из-за присутствия липулигосахаридов (LOS) и липополисахаридов (LPS) в пределах внешней листовки. Молекулы LOS и LPS являются амфипатические гликолипииды, которые имеют аналогичную структуру, которая состоит из липидов-а disaccharolipid и ядра-олигосахарида заменить. Однако, только молекулы LPS украшены третьим субединицей, известной как O-полисахарид, или O-антиген. Тип и количество гликолипидов, присутствующих будет влиять на плотность ОМ организма. Поэтому мы проверили, могут ли мембраны бактерий с разнообразным содержанием гликолипидов быть также изолированы с помощью нашей техники. Для LPS-производящих организмов, Salmonella enterica serovar Typhimurium и Escherichia coli, мембраны были легко изолированы и LPS O-антигена moiety не повлияло на расставание двухслойных. Acinetobacter baumannii производит молекулы LOS, которые имеют аналогичную массу O-антигена, недостаточное молекулы LPS; однако, мембраны этих микробов не могли первоначально быть разделены. Мы рассудили, что ОМ A. baumannii был менее плотным, чем у Enterobacteriaceae, поэтому градиент сахарозы был скорректирован и мембраны были изолированы. Таким образом, метод может быть адаптирован и модифицирован для использования с другими организмами.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Грамотрицательные бактерии производят две мембраны, которые разделены периплазмическим пространством и пептидогликанской клеточной стенкой1. Внутренняя мембрана (IM) заключает цитозол и является симметричным двухслойным фосфолипидами. Пептидогликан защищает от тургорского давления и обеспечивает бактерию клеточной формой, а также крепится к внешней мембране (ОМ) липопротеинами2,,3. ОМ окружает периплазм и преимущественно асимметрично. Внутренняя листовка состоит из фосфолипидов и внешняя листовка состоит из гликолипидов, известных как липулигосахариды (LOS) или липополисахариды (LPS)4,5. Липидная асимметрия и биохимия молекул LOS/LPS во внешней листовке придают барьерные свойства поверхности клетки, которые защищают бактерию от опасностей в ее окружающей среде6,,7.

Молекулы LPS состоят из трех составляющих: липидный дизакчаролип, ядро олигосахарида и О-полисахарид или O-антиген. Липид А является умножить acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharides состоят из 10-15 сахаров, известных как грубые LPS или R-LPS. Ядро подразделяется на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-манно-восьмилозоновой кислоты (кдо) и одного или нескольких остатков гептоза, а также внешней области, которая состоит, как правило, из гексосов (глюкоза или галактоза) и гептозов, или ацетамамидо сахара5. Область внешнего ядра более изменчива по своим компонентам и структуре, чем внутреннее ядро. В Salmonella spp., только одна основная структура была описана; однако, в Escherichia coli есть пять различных основных структур (обозначенных K-12, R1, R2, R3 и R4)8. E. coli K-12 DH5, который мы используем в этой процедуре несет мутации, что приводит к производству R-LPS9. Молекулы R-LPS не имеют O-антигена moiety и имеют аналогичный молекулярный вес молекул LOS.

Добавление O-антигена к R-LPS превращает эту молекулу в гладкую LPS, или S-LPS. O-антигены построены из коротких 3-4 углеводных субъединиц и состоят из нескольких методов с различной длиной цепи10. Некоторые LPS-производящих бактерий, как Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium), дисплей тримодального распределения молекул LPS на их поверхности10,11. Очень длинная цепь O-антигенов может содержать более ста субъединиц и весить более ста килодальтонов. O-антигены обеспечивают поверхностные свойства бактерии, которые необходимы, чтобы противостоять антибиотикам, уклоняться от хипризавания бактериофагами, и вызывать болезни.

Виды Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria и другие генерируют молекулы ЛОС вместо молекул LPS на их поверхности12. Молекулы LOS состоят из липидов А и ядра олигосахаридов, но не хватает O-антигена. Эти типы грамотрицательных бактерий модифицировать их основные олигосахариды с дополнительными сахарами и комбинациями сахаров, чтобы изменить свойства поверхности12. Как LOS, так и LPS-производящие микробы произвностируют фосфаты на липидных и основных молекулах с катионными муатиами7. Эти дополнения включают фосфоэтаноламин, галактозамин и аминоарабиноззамены, которые функционируют путем нейтрализации анионического поверхностного заряда и тем самым защиты от катионных антимикробных пептидов. Грамотрицательные бактерии также изменить структуру ядра олигосахарида с переменной не-stoichiometric замены сахара, или дополнительные молекулы кдо, и изменить количество ацил цепи на липид-A disaccharolipids7.

Способность изолировать чат от ОМ Грам-отрицательных бактерий сыграла важную роль для понимания роли клеточной оболочки в устойчивости к противомикробным препаратам и патогенезаболезни 11,12. Выводы этого подхода были использованы для вывода механизмов сборки, обслуживания и реконструкции белка, фосфолипида и гликолипидов для ОМ.

Наша лаборатория регулярно выполняет бактериальные липидомные анализы для изучения белково-опосредованной липидной регуляции и липидной функции в различных грамотрицательных видов. Объемы, используемые в протоколе, отражают рутинное использование этой процедуры для анализа нерадиомаркированных фосфолипидов тонким слоем хроматографии и жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии13,14.

Протокол начинается с разоблачения охлажденной подвески грамотрицательных бактерий к высокому осмолялярному раствору сахарозы и добавлению лизозима, чтобы отделить ОМ от основного пептидогликанского слоя (Рисунок 1)12. EDTA затем добавляется для облегчения проникновения лизозима, так как распущенный секвестр катионов нарушает боковое электростатическое взаимодействие между соседними молекулами LOS/LPS15. Первоначальный протокол, из которого был адаптирован наш, требовал образования сферопластов, грамотрицательных бактериальных клеток, которые состоят из плазменной мембраны и цитозола, но не имеют пептидогликанского слоя и ОМ. Не исключено, что сферопласты производятся адаптированным методом; однако, техника не полагается или предназначаю на их образовании для успеха. Вместо этого, лизозим-EDTA обработанные бактерии быстро собирают центрифугирование и повторно подвешены в сахарозный раствор меньшей концентрации перед давлением лизиса. OMs, которые могли бы быть освобождены путем формирования сферопластов, теоретически должны быть собраны из супернатантов обработанных клеток, но этот подход не подробно описан в настоящем. В конечном счете, обработанные клетки подвергаются обычной гомогенизации и лизис, что повышает эффективность и воспроизводимость процедуры разделения мембраны16.

После лизиса, общая мембраны собираются ультрацентрифугации и применяется к прерывистой сахарозы градиент плотности для фракции IM и Омс. Классический подход использует более непрерывный градиент, который состоит по крайней мере из пяти различных решений сахарозы11,12. Прерывистый градиент в нашем протоколе состоит из трех сахарозных растворов и разделов двухслойных на две отдельные фракции17. Молекулы LOS и LPS в пределах OMs Грам-отрицательных бактерий диск конверт для раздела в верхней коричневой низкой плотности IM фракции и нижней белой высокой плотности OM фракции(Рисунок 1 и рисунок 2).

Acinetobacter baumannii являются важными мультирезистентными человеческими патогенами, которые производят молекулы LOS в их ОМ и возводят клеточную оболочку, которую трудно отделить18,,19. Последние работы показывают, что производные протокола мы представляем здесь могут быть использованы для раздела двухслойных этих организмов20. Поэтому мы протестировали наш протокол на A. baumannii 17978. Первоначально эта процедура была неадекватной. Тем не менее, мы изменили концентрацию сахарозы раствора средней плотности и значительно улучшили разделение(рисунок 2). Тест NADH дегидрогеназы и LOS / LPS добычи и обнаружения процедура была использована для подтверждения разделения для A. baumannii, дикий тип S. Тифимурий и два O-антигена дефицитных энтеробактериальных генотипов; а именно, galE-мутант S. Тифимурий и лабораторный штамм, E. coli DH5 "(рисунок 3 и рисунок 4).

Цель этой работы заключается в обеспечении рационализированный подход для воспроизводимой изоляции мембран грамотрицательных бактерий. Протокол может быть использован для изучения многих типов мембранных молекул для этих микробов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Общие реагенты и медиаподготовка для извлечения мембраны

  1. Бактериальный рост средств массовой информации: Подготовка и стерилизовать 1 л бульона средств массовой информации в тщательно очищены и autoclaved 2 L колбы.
  2. Общий буфер повторной подвески (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 мл): Растворите 6,05 г базы Tris в 30 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,5 с 5 M HCl. Отрегулируйте окончательный объем до 50 мл с ультрачистым H2O.
  3. Мастер ский запас раствора хелации divalent cation (0.5 M EDTA pH 8; 100 мл): Добавьте 18,6 г динатрия этилен тетраацетата 2H2O до 80 мл H2O. Перемешайте и отрегулируйте рН до 8,0 с NaOH. Отрегулируйте окончательный объем до 100 мл с помощью ультрапюры H2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соль динатрия ЭДТА не растворится до тех пор, пока рН раствора не будет скорректирован до 8,0 евро за счет добавления NaOH.
  4. Осмотический буфер А (0,5 М сахароза, 10 мм Tris pH 7.5; 1 L): Вес 171,15 г сахарозы и перенос на цилиндр 1 л. Добавьте 10 мл 1 M Tris pH 7.5. Отрегулируйте к окончательному тому 1 L с ультрачистым H2O. Храните на 4 c.
  5. Лисозим (10 мг/мл; 5 мл): Взвесить 50 мг (куриное яйцо-белое) лизозимима и растворить в 5 мл ультрачистый H2O. Хранить при 4 градусах Цельсия.
  6. Разбавленный раствор хелации divalent (1,5 мм EDTA; 500 мл): Добавить 1,5 мл 0,5 М ЭДТА (Шаг 1,3) до 497,5 мл ультрапюры H2O. Хранить при 4 градусах По Цельсию.
  7. Осмотический буфер B (0,2 М сахароза, 10 мм Tris pH 7.5; 2 L): Вес 136,8 г сахарозы и передача на 2 л цилиндра. Добавьте 20 мл 1 М Tris pH 7.5. Отрегулируйте окончательный том до 2 л с ультрачистым H2O. Храните при 4 градусах Цельсия.
  8. Со-фактор Nuclease (1 M MgCl2; 10 мл): Растворите 2,03 г MgCl2No6H2O в 8 мл ультрачистых H2O. Отрегулируйте объем до 10 мл. Хранить при комнатной температуре.
  9. Коктейль Nuclease раствор, включающий ферменты RNase и DNase: Смотрите Таблица материалов. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  10. Коктейль-ингибитор протеазы: Смотрите Таблица Материалов. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  11. Изопикно-сахарозный градиентный раствор низкой плотности (20% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1 мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Взвешивание 20 г сахарозы и передача в цилиндр 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
  12. Изопикно-сахарозный градиентный раствор средней плотности (53% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Взвешивание 53 г сахарозы и передача в цилиндр мощностью 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте это решение в градуированном цилиндре, чтобы обеспечить точность из-за высокого процента сахарозы. Добавить магнитный перемешать бар и перемешать, пока сахароза полностью растворяется в растворе. Этот процесс может занять несколько часов.
  13. Изопикно-сахарозный градиент ный двигатель (73% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1 мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Вес 73 г сахарозы и передача в цилиндр мощностью 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте это решение в градуированном цилиндре, чтобы обеспечить точность из-за высокого процента сахарозы. Добавить магнитный перемешать бар и перемешать, пока сахароза полностью растворяется. Этот процесс может занять несколько часов.
  14. Изолированные мембраны хранения буфера (10 мм Tris Buffer рН 7,5; 1 L): Добавить 1 мл 1 M Tris Buffer рН 7,5 на 1 l колбу и настроить окончательный объем до 1 L с ультрачистым H2O.
  15. -Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) (10 мг/мл раствор): Отстранить 10 мг NADH в ультрачистых H2O. Подготовка свежих запасов, еженедельно. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  16. Фенол раствор уравновеш— с 10 мм Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Смотрите Таблица материалов. Храните раствор при 4 градусах По Цельсию.
  17. Липополисахарид гель пятно комплект: Смотрите Таблица материалов.
  18. Брэдфорд реагент: Смотрите Таблица материалов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения и средства массовой информации должны быть подготовлены в течение недели после выполнения асссы для обеспечения последовательных результатов.

2. Подготовка бактерий для извлечения мембраны

  1. Полоса бактерий из замороженных запасов глицерола на свежие пластины агара. Храните пластины при 4 градусах Цельсия, как только колонии развиваются. Прививать одну колонию в трубку 5 мл, наполненную бульонными носителями и культурой бактерий по желанию на ночь.
  2. Обратно разбавлять ночь бактериальной культуры в 1 L предпочтительных бульон амприсии и культуры бактерий до желаемой оптической плотности достигается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прививка одной бактериальной колонии в 1 l бульонных носителей рекомендуется для мутантных генотипов, которые склонны к подавлению фенотипов роста, но некоторые грамотрицательные бактерии просто растут медленнее, чем другие. Если невозможно достичь достаточной плотности культуры путем прививки одной колонии, обратно разбавления ночной культуры в 1 L средств массовой информации является одной стратегией для синхронизации роста. Бактерино-мембрановый состав варьируется в зависимости от фазы роста культуры (логарифмический против стационарной фазы)13. Кривые роста, измеряющие изменение оптической плотности для бактериальных культур в качестве функции времени, должны выполняться со всеми штаммами, чтобы соотнести плотность культуры с фазой роста.
  3. Установите колбы, содержащие культуры бульона на льду. Прочитайте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600)и вычислите объем культуры, эквивалентный между 6,0 и 8,0 х 1011 бактериальных колоний, образующих единицы (cfu). Для С. Typhimurium, это соответствует 1 L культуры на OD600 между 0.6-0.8, в виду того что OD600 из 1.0 равен грубо 1.0x109 cfu/mL. Добавьте этот том в центрифуговую трубку и убедитесь, что остальные культуры остаются на льду до тех пор, пока они не будут использоваться.
  4. Пеллет бактерии центрифугирование при 4 градусах по Цельсию при 7000-10000 х г в фиксированном углу высокоскоростной центрифуги в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладить и поддерживать центрифуги при низкой температуре. Поддерживайте пробы на льду в течение всей процедуры.
  5. Декант и отбросить супернатант тщательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут быть флэш-заморожены и/или храниться при -80 градусах По Цельсию, если мембранные фракции не будут извлечены немедленно. Тем не менее, рекомендуется приступить непосредственно с плазмолиза в тот же день клетки собирают, и особенно рекомендуется для не-энтеробактериальных видов.

3. Диссоциация внешней мембраны и плазмолиз

  1. Оттепель клеточных гранул на льду, если ранее хранится при -80 градусов по Цельсию и сохранить образцы на льду на оставшуюся часть процедуры. Приостановите каждую клетку гранулы в центрифуге трубки в 12,5 мл буфера A. Добавить магнитный перемешивание бар сподвеской клеток.
  2. Добавьте 180 л из 10 мг/мл lysozyme (окончательная концентрация 144 мкг/мл) к каждой повторной подвеске клеток. Держите образцы на льду, помешивая в течение 2 мин.
  3. Добавьте 12,5 мл 1,5 мм EDTA раствор для каждой повторной подвески клеток и продолжайте перемешивать на льду еще 7 минут.
  4. Декант подвески в 50 мл конической трубки и центрифуги на 9000-11000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  5. Отбросьте супернатанты в контейнер для отходов биологической опасности и сохраняйте гранулы на льду.
  6. Добавьте 25 мл буфера B в пеллету ячейки.
  7. Добавьте 55 Зл 1 M MgCl2, 1 Зл RNase/DNase nuclease реагент (чтобы избежать проблем вязкости, связанные с бактериями, проходящими плазмолиз до гомогениза), и 1 Зл ингибитора протеазы коктейль к объему буфера B, который сидит на вершине клетки гранулы
  8. Приостановите действие гранул ы в буферной смеси B. Энергично пипетка и вихрь до наблюдения однородного раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно иметь однородное решение, прежде чем перейти к шагу 4 этого протокола. Переведоки клеток должны иметь вязкий торт-тесто, как внешний вид и консистенция.
  9. Vortex каждый образец для 15 s. Сохранить подвески на льду и перейти к шагу 4.

4. Гмогенизация под давлением и лизис

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов могут быть использованы для lysis. Соникация не является идеальным из-за генерации тепла. Осмотический лисис может быть достигнут, но часто неэффективен. Поэтому мы рекомендуем лизас высокого давления. Лиза высокого давления может быть достигнуто с помощью различных инструментов. Мы предлагаем гомогенизации машины, такие как французская пресса или Emusliflex. Мы работаем со многими типами грамотрицательных бактерий, реакция которых на высокоосмолярные растворы сахарозы варьируется. Шаг гомогенизации высокого давления повышает эффективность, воспроизводимость и урожайность.

  1. Прехлл французской пресс-клетки при 4 градусах Цельсия или вставить металлическую катушки из машины гомогенизатора на льду.
  2. Налейте образец во французскую ячейку давления или цилиндр гомогенизатора и довести клетку под желаемым давлением гомогенизации (10000 пси должно быть адекватным при использовании французской прессы или 20000 пси при использовании гомогенизатора).
  3. Отрегулируйте скорость потока розетки примерно до одной капли в секунду, сохраняя при этом давление при использовании французской прессы.
  4. Соберите клеточный лисат в 50 мл конических труб, сохраняя при этом образцы на льду.
  5. Повторите шаги 4.2-4.4 три-пять раз для достижения полного лиза, как правило, указывается постепенным повышением прозрачности выборки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец камеры следует мыть и уравновешивать с буфером B между образцами.
  6. Держите лисицированные клетки на льду.

5. Общая фракция Мембраны

  1. Centrifuge лизоватые бактериальные образцы на 6169 х г в течение 10 мин при 4 кв С, чтобы гранулы оставшиеся нетронутыми клеточного материала. (например, неизлещенные бактериальные клетки).
  2. Распределите оставшуюся часть супернатанта, которая теперь содержит гомогенизированные мембраны в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации.
    ПРЕДЕКТО: При необходимости образцы клеток можно сбалансировать путем разбавления буфером В.
  3. Ультрацентрифуги клеточной лисаты при 184 500 х г, по крайней мере 1 ч, при 4 градусах По Цельсию. Этот шаг может быть выполнен в одночасье, не влияя на качество мембран.
  4. Откажитесь от оставшихся супернатантов, присутствующих в ультрацентрифуге трубки и сохранить мембранные гранулы на льду(рисунок 1).
  5. Оттачивать мембранные гранулы в 1 мл изопикника-сахарозного градиентного раствора низкой плотности с помощью гомогенизатора со стеклянным унцией. Используйте стеклянную пипетку Pasteur для переноса образца гомената в микроцентрифугную трубку 1,5 мл и удержания на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется только тотальный анализ состава мембраны, замените 1 мл изопикно-сахарозного градиентного раствора низкой плотности на 1 мл изолированно-мембранного буфера хранения. Шаг 5.5 является конечной точкой изоляции, если только полностью бактериальные образцы мембраны желательно. Храните образцы при -20 градусах По Цельсию до дальнейшего анализа ниже по течению.

6. Плотность градиента Ультрацентрифугация для отделения двойных мембран

  1. Соберите соответствующее количество 13 мл полипропилена или ультра-прозрачных трубок с открытым верхом, указанных для качающегося ротора ведра и ультрацентрифуга.
  2. Держите трубку в слегка наклоненом положении и подготовьте градиент сахарозы, медленно добавляя сахарозные растворы от более высокой плотности до более низкой плотности в следующем порядке:
    2 мл 73% ж/v сахароза,1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7,5
    4 мл 53% ж/в сахарозе, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис рН 7,5
    1. Затем добавьте общую мембранную фракцию (1 мл), которая была переsuspendedа в 20% раствор е/в сахарозе (шаг 5.5). Избегайте смешивания фракции мембраны с сахарозным раствором, который лежит под ним. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
    2. Наконец, заполните трубку раствором градиента изопикника-сахарозы низкой плотности (около 6 мл). Полипропилен и ультра-прозрачные трубки с открытым верхом должны быть заполнены как можно более полными (2 или 3 мм от верхней трубки) для поддержки трубки.
  3. Корректировка для Acinetobacter baumannii 17978
    1. Адаптируйте скорректированный градиент сахарозы для использования с различными бактериальными образцами. Для A. baumannii, следующий градиент сахарозы позволил более полное разделение мембран(Рисунок 2).
      2 мл 73% w/v сахароза, 1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7.5
      4 мл 45% w/v сахароза, 1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7.5
    2. Затем добавьте общую мембранную фракцию (1 мл), которая была переsuspendedа в 20% раствор е/в сахарозе (шаг 5.5). Избегайте смешивания фракции мембраны с сахарозным раствором, который лежит под ним. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
    3. Наконец, заполните трубку раствором градиента изопикника-сахарозы (около 6 мл). Полипропилен и ультра-прозрачные трубки с открытым верхом должны быть заполнены как можно более полными (2 или 3 мм от верхней трубки) для поддержки трубки.
  4. Ultracentrifuge образцы с помощью размахивая ведро ротора на 288000 х г и 4 кв- с ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов, используемых в предыдущих шагах, мы рекомендуем время центрифугирования между 16 ч и 23 ч.
  5. Вырезать конец P1000 пипетка отзыв около 5 мм от точки. Удалите верхний коричневый слой IM с помощью пипетки. Перенесите фракцию в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации.
  6. Оставьте около 2 мл сахарозы раствора выше 53-73% интерфейса, чтобы гарантировать, что нижняя белая OM не пересекает загрязненных с IM фракции. Повторите процедуру трубачирования с шага 6.4 для фракции OM(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны также могут быть собраны путем проколов центрифуговых труб на дне с помощью иглы и сбора мембран в виде фракций.
  7. Заполните оставшуюся пустоту ультрацентрифуге трубки изолированным мембрановым буфером хранения и смешайте путем инверсии или пипетки. Сохранить образцы на льду.
  8. Соберите теперь промываются и изолированные мембраны ультрацентрифугации на 184500 х г для 1 ч и 4 КС.
  9. Откажитесь от супернатанта и отрепримите мембраны путем выбросить гомогенизацию. Добавьте 500-1000 л буфера хранения. Сбор образцов в 2 мл микроцентрифуговых труб.
  10. Храните образцы бактериальной мембраны при -20 градусов по Цельсию.

7. Подтверждение разделения двухслоев

ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное разделение двухслойных может произойти из-за технической ошибки или уникального состава клеточного конверта некоторых видов. Чтобы подтвердить разделение, мы советуем использовать два независимых анализа для количественной оценки степени перекрестного загрязнения между двухслойными. Первый ассай обнаруживает ферментативную активность Дегидрогеназы NADH, которая существует исключительно в IM. Второй асссговорит определяет наличие LOS или LPS, которое преимущественно существует в ОМ.

  1. Подтверждение того, что ОМ изолированы от IMs
    1. Измерьте концентрацию белка в каждой изолированной фракции мембраны с помощью протеина Брэдфорда.
    2. Добавьте объем образца, соответствующий от 50 до 500 мкг белка, в пустую микроцентрифугную трубку 2 мл. Концентрация будет варьироваться в зависимости от вида, но 50 мкг, как правило, достаточно для Enterobacteriaceae. Добавьте соответствующий объем 10 мМ Tris-буфер для достижения общего объема 990 л. Перенесите содержимое в кювет для спектрофотометрии.
    3. Добавьте в образец 10 qL раствора NADH размером 10 мг/мл и измерьте начальную абсорбцию на уровне 340 нм.
    4. Продолжайте измерять абсорбцию каждые 30 с в течение 5 минут.
    5. Составить данные и составить график изменения в абсорбции (y-оси) по сравнению с изменением времени (x-оси) для каждой мембранной фракции(рисунок 3).
  2. Подтверждение того, что ОМ изолированы от ОМ
    1. Добавьте объем образца, соответствующий от 50 до 500 мкг белка, в пустую микроцентрифугную трубку 2 мл. Концентрация будет варьироваться в зависимости от бактериальных видов, но 50 мкг, как правило, достаточно для Enterobacteriaceae. Заполните до окончательного объема 100 л с фосфатами буферного сольения, который в дальнейшем называют вавной фазы.
    2. Добавьте 5 qL Протеиназа K (запас 800 U/mL) к воднуй фазе и инкубировать на ночь при 59 градусах Цельсия.
    3. Разогрейте аликот 10 мл насыщенного Трисом фенола в течение 10 мин при 68 градусах Цельсия.
    4. Спин вниз aqueous фазы образцов, которые были обработаны с Proteinase K и добавить "горячий" Трис насыщенных фенол в соотношении 1:1 с aqueous фазы, вихрь энергично и инкубировать при 68 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
    5. Перенесите теперь молочно-белые образцы от 68 градусов по Цельсию к ледяной водяной бане и инкубировать в течение 10 минут.
    6. Центрифуги образцы на 2100 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Перенесите верхнюю ваковую фазу в новую трубку и храните трубку при -20 градусов по Цельсию, если образец не будет использоваться немедленно.
    8. Разбавить образцы в SDS-загрузке буфера и загрузить скважины 4-20% Tris-глицин градиент гель.
    9. Электрофорез в течение 45 минут или до тех пор, пока краситель фронт находится в нижней части геля.
    10. Пятно гель с помощью LPS окрашивающий комплект в соответствии с инструкциями производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот метод обеспечивает эффективное средство для изоляции ИМ и ОМ для грамотрицательных бактерий. Иллюстрирован контур всей процедуры(рисунок 1). В целом, нормализация культур до OD600 0,6-0,8 в 1 l носителей, или уборка между 6,0 и 8,0 х 1011 бактериальных клеток будет гарантировать, что соответствующее количество мембранного материала собирается для последующего разделения.

После лизирования бактерий и ультрацентрифугирования лизата, липкая коричневая общая мембрана гранулы будут видны в нижней части ультрацентрифуги трубки. После соскабливания, dounce-гомогенизации, и ultracentrifuging мембраны над прерывистым градиентом плотности сахарозы, IM и OM должны быть разделены как изображено(Рисунок 2). Мы обнаружили, что 20%/53%/73% (w/v) градиент сахарозы плотности был недостаточен для раздела оболочки A. baumannii, в то время как 20%/45%/73% w/v градиент был достаточным(рисунок 2).

Для оценки качества и чистоты каждой мембранной фракции можно использовать различные аналитические методы. NADH-дегидрогеназа является внутренняя мембрана фермента, который катализа NADH окисления NAD(Рисунок 3). Учитывая его клеточной локализации, он может быть использован для определения перекрестного загрязнения между ОМ и ОМ. Согласно спектрам абсорбции обеих молекул, NAD и NADH имеют пиковую абсорбцию на уровне 260 нм, в то время как только NADH имеет максимальную абсорбцию на уровне 340 нм. Таким образом, снижение абсорбции на 340 нм будет свидетельствовать о окислении NADH к NAD и, следовательно, наличие фермента в образце. Если мембраны отделяются должным образом, это изменение в абсорбции должно происходить только в образцах обмена мгновениями(рисунок 3). Снижение абсорбции в образцах ОМ будет свидетельствовать о перекрестном загрязнении материалами, выражаемыми im. Для A. baumannii, в три раза больше мембраны, или 150 мкг белковых эквивалентов, было необходимо, чтобы продемонстрировать аналогичные уровни активности дегидрогеназы NADH к тому, что было измерено для энтеробактериальных штаммов (Рисунок 3). Таким образом, вполне возможно, что уровни Окисидаза NADH ниже для A. baumannii или что специфическая активность фермента снижается.

Внешняя листовка ОМ в основном состоит из молекул LOS или LPS. Таким образом, извлечение LPS/LOS из образцов IM и OM с последующим электрофоразом и визуализацией с помощью окрашивания LPS будет отражать обогащение этих структур в ОМ по сравнению с IM фракциями. Синтез молекул LOS и LPS начинается в цитоплазме и завершается на поверхности IM5. Структуры LOS и LPS однонаправленныпере переносятся в ОМ и вставляются во внешнюю листовку. Так как биосинтез включает в себя вложение прекурсора к чату, слабый рисунок полоскания всегда наблюдается для im фракций. Тем не менее, интенсивность молекул в фракции ОМ гораздо больше, чем в фракции IM, из-за обогащения структур LOS/LPS(рисунок 4). Полученное количество мембраны измерялось путем определения концентрации белка в суспензии. В шесть раз больше мембраны было необходимо для извлечения и обнаружения ЛОС от A. baumannii по сравнению с количеством, необходимым для обнаружения молекул LPS из энтерических организмов (Рисунок 4). Мы считаем, что это может отражать снижение уровня молекул ЛОС в ОМ для этих организмов по сравнению с уровнями белка, но не преследовали эту гипотезу в деталях.

Figure 1
Рисунок 1: Схема, изображающая процедуру изоляции грамотрицательных бактериальных мембран, описанную в этой статье метода. Показана процедура, используемая для сбора бактериальных клеток и изоляции общего, внутреннего (IM) и внешних мембран (ОМ). Подход опирается на увеличение плотности OM двухслойного для этих микробов по сравнению с плотностью IM двухслойного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты для различных грамотрицательных видов, мембраны которых были выделены с использованием стандарта и модифицированных градиентов плотности сахарозы, описанных в этой статье. Изображения прерывистый сахарозы градиентов плотности должность изопикника центрифугирования для (A) дикого типа Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028s, (B) GalE-мутант S. Typhimurium LT2, который производит молекулы LPS, которые лишены O-антигенов, и (C) Escherichia coli K-12 DH5, который также производит молекулы LPS, которые не имеют O-антигенов. Внутренняя мембрана (IM) отделена от внешней мембраны (ОМ) и локализуется до 20-53% сахарозы интерфейс в качестве коричневого материала. Белый слой OM локализуется до интерфейса сахарозы 53-73% из-за более высокой плотности этой фракции. (D) Общие мембраны дикого типа Acinetobacter baumanii 17978 не отделялись, используя 20%/53%/73% (w/v) градиент сахарозы, (E), но отделили с использованием 20%/45%/73% (w/v) градиент сахаровы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель результаты анализа дегидрогеназы NADH для проверки внешней мембраны (ОМ) чистоты. Присутствие фермента, NADH-дегидрогеназы, было протестировано во внутренних (IM) и OM образцов для проверки эффективности разделения. ()Окисление NADH в NAD катализат фермента, расположенного в бактериальном имеватель. Подстрат реакции (NADH) имеет максимальную абсорбцию на уровне 340 нм; поэтому снижение оптической плотности на этой длине волны свидетельствует о наличии фермента в образце. Имик и ОМ были измерены для(B)дикого типа S. Тифимурий, (C) E. coli K-12 DH5 " и (D) galE-мутант S. Тифимурий. Эти мембраны были выделены с использованием изопикно-сахарозной плотности градиента 20%/53%/73% w/v сахарозы. Для A. baumannii, мембраны были изолированы с использованием градиента 20%/45%/73% w/v сахарозы. Анализ NADH для проверки чистоты мембран было сделано с использованием (E) 50 мкг для энтеробактериальных организмов и (F) 150 мкг общего белка для A. baumannii. Более высокая концентрация белка была добавлена в (F), так как кривая для (E) предположил, что относительные уровни NADH дегидрогеназы по сравнению с общим белком были меньше для A. baumannii, чем для S. Тифимурий и кишечная палочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты процедуры извлечения и визуализации LPS и LOS для проверки чистоты внутренней мембраны (IM). Объем мембранного образца, соответствуя 50 мкг общего белка, был использован для извлечения ЛПС из IM и внешней мембраны (ОМ) С. Тифимурий и кишечная палочка DH5-альфа. Объем мембранного образца, соответствуя 300 мкг общего белка, был использован для извлечения ЛПС из мембран A. baumannii. Объемы были нормализованы до 100 л с эндотоксином воды и обработаны Proteinase K. LPS или LOS были извлечены с помощью извлечения горячего фенола (1:1 воды: фенол) и 21 л экстрактов были загружены на 4-20% градиент полиакриламида гель и визуализированы PRO-З Изумруд 300 анализов материалов для перекрестного загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот метод будет продолжать помогать исследователям в понимании роли клеточной оболочки в бактериальной физиологии и патогенеза. После последовательных ультрацентрриффирования шаги очищенной общей, внутренней и ОМ фракции могут быть получены. Эти мембраны могут быть анализированы в изоляции для проверки гипотез, связанных с локализацией мембранного белка и функции, транспортировки и оборота через периплазму, а также состав отдельных двуслой в различных экологических условиях. Биологические исследования, исследующие участие отдельных компонентов ОМ в патогенеза, таких как LOS/ LPS и OM белки, также могут быть проведены в животных и клеточных моделей с использованием изолированных мембранных фракций, собранных этой техникой.

Наша процедура была оптимизирована для использования с Enterobacteriaceae, в частности S. Typhimurium, который производит молекулы LPS, которые содержат O-антигены переменной длины цепи. Этот протокол также работает для модели бактерии, E. coli K-12, которая потеряла генетическую способность синтезировать O-антигены. Использование дикого типа и O-антигена недостаточно S. Typhimurium 14028s и E. coli K-12 штамм DH5 , мы показываем, что способность отделить мембраны для этих микробов не существенно зависит от присутствия O-антигенов. Однако, чтобы отделить оболочку лос-производящей бактерии, A. baumannii 17978, нам пришлось уменьшить концентрацию раствора сахарозы средней плотности в прерывистом градиенте, чтобы изолировать двуляры(рисунок 2). В частности, смещение концентрации раствора средней плотности с 53 до 45% было достаточным для того, чтобы ОМ могла перегородиться на интерфейс 45-73% в адаптированном градиенте. При использовании 53-73% градиента для A. baumannii, большинство материала OM часто наблюдалось немного ниже фракции чата на 20-53% интерфейса(рисунок 2). Sparse OM материал присутствовал на 53-73% интерфейс для A. baumannii. Эти результаты показали, что градиент 20%/53%/73% недостаточен для разделения двухслойных A. baumannii в этих условиях.

Таким образом, можно внести коррективы в градиент плотности, чтобы приспособить организмы с разнообразным содержанием и уровнем ОМ-гликолипидов, и этот подход может быть адаптирован для других грамотрицательных бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликта интересов не было заявлено.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована P20GM10344 и R01AI139248, присужденными З.Д. Далебру.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene VWR 525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap VWR 10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth VWR 10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well BIORAD 4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL BIORAD 1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes VWR 89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles VWR 71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter Life Sciences 355622
Agar Powder VWR A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe VWR 89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) ThermoFisher Scientific 50136146
Benzonase Nuclease MilliporeSigma 70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR 4040-01
EmulsiFlex-C3 Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor ThermoFisher Scientific 75006526
Hydrochloric acid 6.0 N VWR BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker Fischer Scientific 15-453-211
LB Broth Miller VWR 214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade VWR VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich M2670
NADH Sigma Aldrich 10107735001
Optima XPN-80 - IVD Beckman Coulter Life Sciences A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS  Fischer Scientific NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology Sigma - Millipore P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit Thermofisher 23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit Thermofisher P20495
Proteacease -50, EDTA free G Biosciences 786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade New England Biolabs P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99% VWR AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge ThermoFisher Scientific 36-101-0816
Sucrose MilliporeSigma SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter Life Sciences 331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker VWR JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter Life Sciences 339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm Beckman Coulter Life Sciences 344059
Vortex-Genie 2 VWR 102091-234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140, (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
Разделение конверта клетки для Грам-отрицательных бактерий в Внутренние и Внешние фракции Membrane с Технически регулировками для <em>Acinetobacter baumannii</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).More

Cian, M. B., Giordano, N. P., Mettlach, J. A., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (158), e60517, doi:10.3791/60517 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter