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Chemistry

고갈 방법을 사용하여 유기 나노 입자를 분산 된 용액에 대한 짧은 펩타이드 흡착 연구

doi: 10.3791/60526 Published: April 11, 2020

Summary

생체 분자 - 무기 고체 상 상호 작용을 이해하기위한 첫 번째 단계는 흡착 등온을 확립하여 평가 될 수있는 근본적인 물리 화학 상수를 드러내는 것입니다. 액체 상에서 의 흡착은 운동학, 표면 용량, pH 및 경쟁 흡착에 의해 제한되며, 흡착 실험을 설정하기 전에 모두 신중하게 고려해야합니다.

Abstract

무기-유기 상호 작용의 기초는 생명 공학 및 의학에서 활용에 대한 새로운 생물 인터페이스의 발견과 개발에 매우 중요합니다. 최근 연구에 따르면 단백질은 제한된 흡착 부위를 통해 표면과 상호 작용합니다. 아미노산 및 펩티드와 같은 단백질 단편은 복잡한 생물학적 거대분자와 무기 표면 간의 상호 작용 모델링에 사용될 수 있습니다. 지난 3년 동안 등온 적정 열량계(ITC), 표면 플라스몬 공명(SPR), 석영 크리스탈 미세 균형(QCM), 총 내부 반사 형광(TIRF), 감쇠된 총 반사 스펙트럼 분광법(ATR) 등 상호 작용의 물리적 화학 적화학 기초를 측정하기 위해 많은 유효하고 민감한 방법이 개발되었습니다.

흡착 측정을 위한 가장 간단하고 가장 저렴한 기술은 용액 분산 흡착제와의 접촉 후 소르베이트 농도(고갈)의 변화가 계산되고 흡착된 것으로 가정되는 고갈 방법입니다. 고갈 데이터에 기초한 흡착 등온은 모든 기본 물리 화학 데이터를 제공합니다. 그러나 솔루션의 흡착은 비표면적이 높은 운동 제한 및 흡착제로 인해 평형 시간이 길어지므로 거시적 고정 평면 표면에거의 적용되지 않습니다. 또한, 졸의 불안정성, 나노 입자 응집체, 흡착 성 결정체, 나노 입자 크기 분포, 용액의 pH 및 흡착 경쟁과 같은 요인을 고려하면서 펩타이드를 흡착하는 것을 연구해야합니다. 고갈 데이터 등온 구조는 말 그대로 모든 수용성 소르베이트에 대한 포괄적인 물리적 화학 데이터를 제공하지만 고가의 설정이 필요하지 않으므로 가장 접근하기 쉬운 방법론으로 남아 있습니다. 이 기사에서는 무기 산화물에 대한 펩티드 흡착에 대한 실험 적 연구를 위한 기본 프로토콜을 설명하고 공정에 영향을 미치는 모든 중요한 지점을 다룹니다.

Introduction

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지난 50 년 동안 무기 표면과 펩티드 사이의 상호 작용은 재료 과학 및 의학에서 높은 중요성으로 인해 많은 관심을 끌었습니다. 생물 의학 연구는 재생 의학, 조직 공학1,,2,,3및 이식4,,5,,6,,7에직접적인 영향을 미치는 생물 무기 표면의 호환성 및 안정성에 초점을 맞추고 있습니다. 센서 및 액추에이터와 같은 현대 생체 반응 장치는 산화물 반도체 표면8,,9,10,,,11,,1012,13에고정된 기능성 단백질을 기반으로 합니다. 단백질 생산을 위한 현대 정제 관행은 수시로 하류 정제 및 분리에 있는 생체 분자 상호 작용 속성에의존합니다 14.

다중 무기 산화물 중에서, 이산화 티타늄은 생물학적으로 관련된기질(15,,16)과조합하여 가장 많이 활용되고 있다. TiO2기반 바이오 인터페이스 분야의 연구는 생물학적 및 구조적 특성을 변경하지 않고 단백질과 펩타이드의 강력하고 구체적인 결합을 확립하는 데 집중되어 있습니다. 궁극적으로, 주요 목적은 높은 안정성과 티타늄 기반의 생명 공학 및 의료 응용 분야의 생성을 앞당길 것이다 향상된 기능성을 가진 생체 분자의 높은 표면 밀도 층(17)이다.

티타늄 및 그 합금은 몇 나노미터 두께의 표면 TiO2 층이 내식성이 있고 많은 생체 내 응용 분야에서 높은 수준의 생체 적합성을 나타내기 때문에 적어도 6 년 동안 수술 용 임플란트 재료로 광범위하게 사용되어 왔다18,,19,,20. 이산화 티타늄은 또한 생물 미네랄화에서 생산되는 무기 기질로 널리 간주되며, 여기서 단백질 및 펩타이드를 동반한 핵형성 및 무기상 성장은 유망한 촉매 및 광학 적특성(21,,22,,23,,24)을가진 물질을 제공할 수 있다.

특히 무기물질과 생체분자의 상호작용의 높은 관련성을 감안할 때, 특히 단백질-TiO2 상호작용은, TiO2에대한 단백질의 흡착의 조작 및 제어를 해결하기 위한 많은 연구가 있었다.2 이러한 연구로 인해 흡착 역학, 표면 커버리지 및 생체 분자 형태와 같은 이러한 상호 작용의 몇 가지 근본적인 특성이 밝혀졌으며, 생체 인터페이스5,,13의추가 발전에 대한 실질적인 지지를 제공합니다.

그러나 단백질 복잡성은 무기 표면과의 단백질 분자 수준 상호 작용에 대한 완전한 결정과 이해에 상당한 제한을 추가합니다. 생체 분자가 제한된 부위를 통해 무기 표면과 상호 작용한다고 가정하면 알려진 구조와 아미노산 서열을 가진 일부 단백질은 구성 요소 펩티드 및 아미노산으로 감소되어 별도로 연구됩니다. 이들 펩타이드 중 일부는 상당한 활성을 입증하여 이전,단백질 분리25,26,,27,,28,,29,,30의필요없이 흡착 연구의 독특한 대상을 만드는 것으로 나타났습니다.

TiO2 또는 기타 무기 표면에 대한 펩티드 흡착의 정량적 특성은 지난 수십 년 동안 생체 분자를 위해 특별히 조정된 물리적 방법을 통해 달성될 수 있습니다. 이러한 방법에는 등온 적정 열량계(ITC), 표면 플라스몬 공명(SPR), 석영 결정 미세균형(QCM), 총 내부 반사 형광(TIRF), 감쇠된 총 반사 분광법(ATR)이 포함되며, 이 모두는 키 열역학 적데이터를 제공하여 흡착 강도를 검출할 수 있도록 합니다. 깁스 자유 에너지, 엔탈피, 엔트로피31.

무기 물질에 대한 생체 분자의 흡착은 두 가지 방법으로 달성될 수 있습니다: 1) ITC뿐만 아니라 고갈 방법은 고정된 거시표면에 결합하는 용액에 분산된 입자를 사용; 2) SPR, QCM, TIRF 및 ATR은 각각 금 코팅 유리 또는 금속 칩, 석영 결정, 황화물 아연 및 PMMA 칩과 같은 무기 재료로 수정된 거시표면을 사용합니다.

등온 적정 열량계(ITC)는 용액 또는 이기종 혼합물의 적정 시 생성되거나 소비되는 열을 측정하는 라벨없는 물리적 방법입니다. 민감한 열량 계열 세포는 100 나노줄의 작은 열 효과를 감지하여 나노 입자 표면에서 흡착 열을 측정 할 수 있습니다. 연속 첨가-적정 동안 소르베이트의 열 거동은 주어진 온도32,,,33,,34,,35, 36에서엔터피, 결합 상수 및 엔트로피를 드러내는 상호작용의 완전한 열역학적 프로파일을 제공한다.35

표면 플라스몬 공명(SPR) 분광법은 연구된 표면에 근접한 매체의 굴절률의 측정에 기초한 표면에 민감한 광학 기술이다. 그것은 가역 흡착 및 흡착 층 두께를 모니터링하기위한 실시간 및 라벨없는 방법입니다. 바인딩 상수는 연관 및 해리 속도에서 계산할 수 있습니다. 상이한 온도에서 수행된 흡착 실험은 활성화 에너지및 순차적으로 다른 열역학적파라미터(37,,38,,39)의온도 의존도에 대한 정보를 제공할 수 있다.

석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 방법은 흡착 및 탈착 공정 동안 압전 결정의 진동 주파수의 변화를 측정합니다. 결합 상수는 흡착 및 탈착 속도 상수의 비율으로부터 평가될 수 있다. QCM은 상대 질량 측정에 사용되므로 교정25,,27,,40이필요하지 않습니다. QCM은 가스와 액체 모두에서 흡착하는 데 사용됩니다. 액체 기술을 통해 QCM은 다양한 변형표면(41)에대한 증착을 설명하는 분석 도구로 사용될 수 있습니다.

총 내부 반사 형광 (TIRF)은 내부적으로 반사 된 전파와 흥분 흡착 형광의 형광의 측정을 기반으로 민감한 광학 계면 기술이다. 이 방법은 수십 나노미터의 순서로 두께로 표면을 덮는 형광 분자의 검출을 허용하므로 다양한표면42,,43에서거대 분자 흡착의 연구에 사용됩니다. 흡착 및 탈착시 형광 역학의 모니터링에서 흡착 역학 및 따라서 열역학 데이터42,,43을제공한다.

감쇠된 총 반사율(ATR)은 1,600 및 1,525cm-1에서라이신 스펙트럼 밴드를 기반으로 라이신 흡착 등온등을 확립하기 위해 Roddick-Lanzilotta에 의해 사용되었다. 이는 TiO2상에서 펩타이드에 대한 결합 상수가 최초로 내부 적외선방법(44)을사용하여 결정되었다. 이 기술은 폴리리신 펩타이드45 및 산성 아미노산46에대한 흡착 등온등을 확립하는 데 효과적이었다.

상기 언급한 방법과 는 달리, 흡착 파라미터가 여기서 그 단위로 측정되고, 통상의 실험에서 흡착된 생체분자의 양은 표면이 용액에 접촉한 후 의 농도 변화에 의해 측정된다. 흡착 케이스의 대다수에서 소르트염의 농도가 붕괴하기 때문에, 이 방법은 고갈 방법이라고 합니다. 농도 측정은 소르브테의 본질적인 분석 특성에 기초할 수 있거나 라벨링47,,48,,49,,50 또는 이의51,,52 의 유도체화에 기초할 수 있는 검증된 분석 분석이 필요하다.

QCM, SPR, TIRF 또는 ATR을 사용한 흡착 실험에는 흡착 연구에 사용되는 칩과 센서의 특수 표면 준비가 필요합니다. 준비된 표면은 산화물 표면의 불가피한 수화 또는 소르베이트의 화학적 흡수 가능성으로 인해 흡착을 전환할 때 한 번 사용해야 합니다. 고갈 방법에서는 수십 개의 샘플을 실행할 수 있는 반면, 한 번에 하나의 샘플만 ITC, QCM, SPR, TIRF 또는 ATR을 사용하여 실행할 수 있으며, 이 샘플은 온도 조절 용량 및 흡착제 가용성에 의해서만 제한됩니다. 이는 생체 활성 분자의 큰 샘플 배치 또는 라이브러리를 처리할 때 특히 중요합니다. 중요한 것은 고갈 방법은 비용이 많이 드는 장비가 아니라 전적으로 온도 조절장치를 필요로하지 않는다는 것입니다.

그러나, 그것의 명백한 장점에도 불구 하 고 고갈 방법은 성가신 보일 수 있습니다 복잡 한 절차 기능을 필요. 이 문서에서는 고갈 방법을 사용하여 TiO2에 대한 디펩티드 흡착에 대한 포괄적인 물리 화학 적 연구를 수행하는 방법을 제시하고 관련 실험을 수행 할 때 연구원이 직면 할 수있는 문제를 해결합니다.

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Protocol

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1. 디펩타이드 스톡 솔루션 및 희석제 준비

  1. 16 mM 디펩티드 용액의 제조
    1. 멸균 폴리머 시험관에 디펩타이드(Ile-His) 0.183 g(재료 표참조)을 넣고 이중 증류수(DDW)로 35 mL로 희석한 후 격렬하게 교반하여 실온(RT)에서 용해합니다.
      참고 : 교반하는 동안 디펩타이드가 DDW에 용해되지 않으면 디펩티드 용액을 초음파 욕조에 넣고 몇 분 동안 초음파 처리하십시오.
    2. 멸균 시험관에서 DDW의 50 mL에서 건조 2-(N-morpholino)의 0.533 g을 용해시킴으로써N2-(N-morpholino)에 탄설포닉산(MES) 완충액의 50 mM 용액을 제조한다.N DDW 100 mL에 200 mg의 수산화 나트륨을 용해시켜 50 mM 수산화 나트륨 용액을 준비하십시오.
    3. 미리 용해된 디펩타이드 용액의 pH를 16 mM 디펩타이드 용액에 50 mM MES 또는 50 mM 수산화나트륨을 신중하게 첨가하여 7.4로 조정하고, RT에서 교반하고 pH 미터로 pH를 모니터링한다. pH를 조정한 후 용액을 측정 실린더에 붓고 시험관을 헹구고 측정 실린더를 DDW에서 40 mL로 채우면 최종 농도가 16 mM입니다.
  2. 16 mM 재고 용액에서 디펩티드 희석제 의 준비
    1. DDW로 16 mM 디펩티드 용액을 희석하여 0.4~12.0 mM 사이의 농도로 펩티드 희석을 준비합니다. 예를 들어, 8 mM 디펩티드 용액을 준비하기 위해, 16 mM 디펩티드 용액의 10 mL에 DDW의 7 mL을 추가한다. 희석 후, 디펩티드 용액에 50 mM MES 또는 50 mM NaOH 드롭을 추가하여 pH를 7.4로 조정한다(단계 1.1.3 참조). pH를 조정한 후 용액을 측정 실린더에 붓고 시험관을 헹구고 측정 실린더를 DDW로 최대 20 mL까지 채워 디펩티드 농도 8 mM을 만듭니다.
      참고: 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0 및 12.0 mM의 농도를 가진 16 mM 디펩타이드 스톡 용액의 다른 희석은 도 1에따라 제조된다. 각 디펩티드 용액의 pH를 7.4로 조정하는 것은 단계 1.1.3에 기재되어 있다.

2. 티타니아 솔의 준비

  1. DDW 의 500 mL에서 MES 1.066 g을 용해시킴으로써 MES 완충액의 10 mM 용액을 준비한다. pH를 pH 측정기로 교반하고 모니터링할 때 건조한 수산화나트륨으로 pH를 7.4로 조절한다.
  2. 적어도 5 분 동안 박격포에 나노 결정 TiO2의 200 mg을 분쇄 (재료 표참조).
  3. 지상 이산화 티타늄 나노 입자의 40 mg을 실험실 플라스크에 계량하십시오. 실험실 스탠드를 사용하여 플라스크를 초음파 처리 욕조에 넣습니다(재료 참조).
  4. TiO2로 플라스크에 10mMM MES 버퍼 20mL를 넣고 초음파 욕조(5L, 40kHz, 120W)에서 20분 동안 초음파 처리합니다.

3. 혼합 및 열 조절

  1. 온도 조절장치(재료 참조)를 원하는 온도(예: 0.00, 10.00, 20.00, 30.00 또는 40.00°C)로 설정합니다.
  2. 표시된 흡착 바이알에 TiO2의 초음파 처리 된 졸 1 mL을 추가하십시오. 압출 폴리스티렌 폼으로 만든 임시 부양 장치에 해당 디펩티드 희석에 대해 표시된 흡착 바이알을 놓습니다. 표시된 바이알과 상응하는 디펩타이드 희석을 온도 조절장치에 적어도 5분 동안 부양 장치를 놓습니다.
  3. 각 디펩티드 희석액을 해당 표시된 흡착 바이알에 1 mL을 추가하여 모든 혼합 용액이 동일한 온도를 갖도록 합니다. 흡착 평형을 달성하기 위해 24 시간 동안 0.00, 10.00, 20.00, 30.00 또는 40.00 °C에서 온도 조절기상 에 얻은 흡착 샘플 시리즈를 유지하십시오.
    참고 : 온도 조절기에 넣기 전에 얻은 분산물의 모든 샘플을 조심스럽게 흔들어 주십시오.
  4. 때때로 열열 조절 중에 수동으로 흔들어 TiO2 분산액을 혼합합니다.

4. 열성 시료의 여과

  1. 온도 유도 재교정을 피하기 위해 여과를 위해 온도 조절기로부터 한 번에 하나의 샘플을 꺼낸다.
  2. 주사기와 각 유리 유리 병에서 디펩티드 용액의 샘플을 가져 가라, 주사기 바늘을 통해. 주사기에서 바늘을 제거하고 주사기 필터 (재료 표참조)에 넣어 디펩티드 용액을 유리 병으로 필터링합니다. 다른 샘플과 여과를 반복합니다.
  3. 섹션 5에 따라 여과액을 분석한다.
    참고 : 몇 분 정도 걸리고 농도 평형에 변화를 일으킬 수 있으므로 샘플을 원심 분리하지 마십시오.

5. 파생화 및 HPLC 분석

  1. 아세토니트릴에서 트리플루오로아세트산(TFA)의 50 mL 용액을 만드십시오. 측정 실린더에 0.34 mL의 TFA를 추가하고 RT에서 아세토니트릴로 용액의 부피를 50mL로 조정합니다.
    주의 : 삼중 불소 산은 흡입 시 유해하고, 심한 피부 화상을 일으키며, 낮은 농도에서도 수생 생물에 독성이 있기 때문에 배기 환기가있는 연기 후드 에서 TFA로 작업하십시오53.
  2. 그라데이치 실린더에 페닐 이소티오메타네이트 299 μL및 트리에틸아민 347 μL을 배치하고 RT에서 아세톤니트릴로 용액의 부피를 50 mL로 조정하여 유도체 화 용액(즉, Edman 시약54)을준비한다.
  3. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 앞서 크로마토그래피 바이알에서 Edman의 시약으로 샘플을 도출합니다. 에드먼 시약 400 μL과 시료 의 400 μL을 섞는다. 샘플을 60°C에서 15분 동안 가열합니다. 가열 후 TFA 용액의 225 μL로 샘플을 중화하고 샘플을 RT로 냉각하기 위해 몇 분 동안 기다립니다.
  4. HPLC 분석(재료 표참조)을 사용하여 흡착 전후의 디펩타이드 용액의 농도를 확인합니다. 분석된 용액이 있는 크로마토그래피 바이알을 HPLC 자동 샘플러에 넣고 소프트웨어에 의해 설정된 필요한 조건으로 샘플을 분석합니다(재료 참조).
    참고 : 이색 수와 순수 아세토니트릴에서 0.1 % TFA로 구성되며, 아세토니트릴 그라데이션은 286 nm에서 286 nm에서 13 분 동안 삼중 으로 각 샘플을 분석합니다. 이전에 확립된 교정 곡선을 사용하여 디펩티드 용액 농도를 측정합니다(그림2). 크로마토그래피 사양은 Shchelokov 외55를참조하십시오.

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Representative Results

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나노 결정성 이산화 티타늄에 대한 디펩티드의 흡착은 0-40°C의 온도 범위에서 생체 적합성 조건에서 연구되었다. 이산화 티타늄의 표면에 대한 실험디펩티드 흡착(A, mmol/g)을 이산화티타늄으로 평가하였다.

여기서C0 Ce는 각각 밀리몰에서 디펩티드 시작 및 평형 농도; V는 리터 내의 디펩티드 용액의 부피; m은 흡착제의 무게입니다.

디펩티드 흡착의 측정은 헨리 모델을 사용하여 처리된 데이터였다. 이 등온 모델은 흡착체 표면상에서 서로 분리된 소르베이트 분자와 함께 상대적으로 낮은 농도로 흡착을 가정하고 실험 데이터를 설명하기에적합하다(도 3). 그러나 이 모델은 가역적 흡착의 경우에만 적용할 수 있으며, 이는 확인되어야 합니다. 여러 번 헹구는 물질의 IR 분광법은 이러한 목적을 위해 적합하다. TiO2 및 용액상에서 얻어진 평형 펩타이드 양은 선형 방정식에 따라 관련됩니다.

여기서 KH는 헨리의 흡착 상수입니다.

평형 결합 상수 KH는 디펩티드 평형 농도(Ce)에대한 디펩티드 흡착(A)의 의존성의 경사로부터 수득되었다.A 각 온도 T에 대한 표준 깁스 자유에너지(ΔG,kJ/mol)는 Van't Hoff 방정식을 통해 결정되었습니다.

R은 J/mol*K에서이상적인 가스 상수이며 T는 켈빈의 흡착 공정의 온도입니다.

디펩티드 깁스 자유 에너지는 각 온도에서결정(도 4)축을 가진 선형 회귀의 차단으로서 개시된 엔탈피(ΔH)를 개시한다.ΔH 회귀 변수, 프로세스의 엔트로피(ΔS),기본 방정식에서 파생 되었다:

일-그의 평형 결합상수(KH),H표준 깁스에너지(ΔG),엔탈피(ΔH)및 엔트로피(ΔS)의 계산된 값이 표 1에제시되어 있다.ΔS

Figure 1
도 1: 16 mM 디펩티드 스톡 용액의 희석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 상이한 디펩티드 농도에서 의 교정 곡선. 디펩티드 농도는 0.4-16.0 mM 사이였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 디펩티드 흡착 등온은 각 온도에 대해 헨리 모델에 의해 계산된다. 디펩티드 흡착 은 각각(A)0°C(B)10°C(C)20°C(D)30°C, 및(E)40°C에서 등온등을 갖는다. 계산된 상관계수(R2)는 얻어진 모든 헨리 모델 등온에 대해 0.96-0.99 범위로 떨어졌다.2 오차 막대는 세 배로 측정된 각 샘플 농도에 대한 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 표준 깁스의 온도에 대한 디펩티드 흡착의 자유 에너지의 의존성. 오차 막대는 헨리 모델을 기반으로 한 간접 측정값으로 깁스 자유 에너지에 대한 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

T, K KH ΔG0,kJ/몰 ΔH0,kJ/몰 ΔS0,kJ/몰 K
273.15 0.32 ± 0.01 2.6 ± 0.0 - 41 ± 9 - 0.16 ± 0.03
283.15 0.25 ± 0.01 3.2 ± 0.1
293.15 0.17 ± 0.06 4.3 ± 0.9
303.15 0.050 ± 0.002 7.6 ± 0.1
313.15 0.037 ± 0.002 8.3 ± 0.1

표 1: 디펩티드 흡착의 열역학적 파라미터.

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Discussion

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등온 시공용 용액의 흡착은 비표면적이 높은 운동 제한 및 흡착제로 인해 평형화에 더 오랜 시간이 필요합니다. 더욱이, 졸의 불안정성을 고려해야, 나노 입자 응집체, 결정성, 나노 입자 크기 분포, 용액의 pH, 흡착에 대한 경쟁은 아미노산을 흡착하는 동안 고려되어야한다. 그러나, 흡착 등온 시공은 고가의 설치를 필요로 하지 않기 때문에 고갈 방법을 이용한 가장 이용 가능한 방법론으로 남아 있으며, 말 그대로 모든 가용성 소르브에 대한 철저한 물리적 화학 데이터를 제공한다.

결정성 물질이 흡착제로 사용될 때 흡착 모드(즉, 용액 분산 입자 또는 고정 표면)간에 구별되어야 합니다. 하나는 거시적으로 평평한 표면과 입자에 결정면의 분포에 상당한 차이를 기대해야한다. 나노 입자에 펩티드의 흡착에서 결정 된 결과 열역학 매개 변수는 거시적으로 평평한 표면에 펩티드 흡착의 열역학 적 매개 변수에 해당하지 않을 수 있습니다.

무기 표면에 흡착된 펩티드의 평균 양은 극히 낮다. 실온에서이 값은 평방 미터28당 마이크로 그램의 수백에 대 한. 이 소량의 흡착은 잘 발달된 표면을 가진 정확한 측정 방법과 고체가 필요합니다. 따라서 큰 특정 표면 (수백 평방 미터)의 작은 입자 물질은 흡착 실험43,56,,57,,,58,,59,60에사용해야합니다.

펩 티 드, 단백질 처럼, 불안정 한, 그리고 조건의 좁은 범위에서 그들의 기능을 유지. 흡착 실험은 0 °C-40 °C (273.15 K-313.15 K)의 생체 적합성 온도에서 나노 결정 성 이산화 티타늄에서 수행되었으며, 이는 정상, 기능, 살아있는 유기체와 유사합니다. 더 높거나 낮은 온도에서의 흡착은 관련이 없으며 실험에 고려해서는 안 됩니다.

다기능 생물학적 활성 화합물은 또한 표면 전하에 영향을 미치기 때문에 매체의 pH에 높은 감수성을 나타내며, 따라서 충전된 작용기 들 사이의 쿨롬상호작용(61,,62,63)을나타낸다., 산화물 물질의 흡착제 전하또한수화표면(64)에서활성 양성자 교환으로 인해 pH 의존적이다. pH를 안정하여 흡착평형의 완충재를 확립하기 위해서는 완충제의 사용이 요구된다. 본 연구에서, MES 완충제는 그 비코디팅특성(65)을위해 사용되므로, 인산염 완충제(66)와 달리 금속66산화물 표면에 흡착을 위한 펩티드와 경쟁하지 않을 것이다.

이러한 최근 아미노산 흡착 시험은 나노입자상에서의 주요 결합 부위가 표면결함(55)임을보여준다. 표면의 결함 분포는 나노 결정 기판의 가장 낮은 제어 가능한 특징 중 하나이므로 흡착 연구에서 일관성을 유지하기 위해 동일한 배치에서 흡착구를 사용해야합니다.

QCM, 플라스몬 공명 및 ITC는 분광 방법의 조합으로 표면과의 상호 작용 중에 흡착의 구조적 특성을 드러내는 미묘한 감도를 가진 진정한 방법입니다. 그러나, 그들은 운동 제한을 극복하지 않고 여전히 흡착 평형을 달성하기 위해 상당한 시간이 필요합니다. 또한 한 번에 하나의 샘플만 처리할 수 있어 배치 샘플 분석이 어려워집니다. 한편, 제시된 고갈 방법은 간단하고 온도 조절 용량에만 국한되어 많은 수의 시료의 처리가 가능하다.

온도로 인한 재보정을 피하기 위해 온도 조절기에서 제거되는 즉시 열염 샘플을 여과해야 합니다. 새로운 온도에서의 평형은 몇 시간까지 걸릴 수 있지만 흡착 시료를 다른 온도로 유지하는 것은 최소화되어야 합니다. 상층 분리를위한 샘플의 원심 분리는 몇 분까지 걸리고 농도 평형의 변화를 일으킬 수 있기 때문에 권장되지 않습니다. 필터 재료의 선택은 소르베이트 특성에 따라 달라지며 최대 복구를 위해 가능한 필터 결합을 줄여야 합니다. 특정 필터를 선택할 때 공급업체의 지침과 권장 사항을 따르는 것이 가장 좋습니다.

또한, 흡착 연구의 농도 변화는 질량 분석법, 무선 분광법 또는 UV 가시 분광법을 사용하여 검증된 정량화 방법을 사용하여 모니터링해야 한다는 것을 명심해야 합니다. 흡착이 분광활성인 경우, 그렇지 않으면 흡착제의 추가적인 라벨링 또는 유도가 필요한 경우 분석이 용이합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 재정적으로 기초 연구를위한 러시아 재단에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

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고갈 방법을 사용하여 유기 나노 입자를 분산 된 용액에 대한 짧은 펩타이드 흡착 연구
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Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

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