Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Studie av kort peptid adsorption på lösning spridda oorganiska nanopartiklar med utarmning metod

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526

Summary

Det första steget i att förstå biomolekyl-oorganiska solid fas interaktion är att avslöja grundläggande fysikaliskkemiska konstanter som kan utvärderas genom att fastställa adsorption isotherms. Adsorption från vätskefasen begränsas av kinetik, ytkapacitet, pH och konkurrenskraftig adsorption, som alla bör övervägas försiktigt innan du ställer in ett adsorptionsexperiment.

Abstract

Grunderna i oorganisk-organiska interaktioner är av avgörande betydelse för upptäckten och utvecklingen av nya biointerfaces mottagliga för användning inom bioteknik och medicin. Nyligen genomförda studier visar att proteiner interagerar med ytor genom begränsade adsorptionsplatser. Proteinfragment som aminosyror och peptider kan användas för interaktionsmodellering mellan komplexa biologiska makromolekyler och oorganiska ytor. Under de senaste tre decennierna har många giltiga och känsliga metoder utvecklats för att mäta de fysikaliska kemigrunderna i dessa interaktioner: isotermmal titreringskalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR), kvartskristallmikrobalans (QCM), total intern reflektionsfluorescens (TIRF) och försvagad total reflektansspektroskopi (ATR).

Den enklaste och mest prisvärda tekniken för mätning av adsorption är utarmningsmetoden, där förändringen i srbate koncentration (utarmning) efter kontakt med lösningsdispergerad sorbent beräknas och antas adsorberas. Adsorption isotherms baserat på utarmning data ger alla grundläggande fysikaliskkemiska data. Adsorption från lösningar kräver dock längre jämviktstider på grund av kinetiska begränsningar och sorbenter med en hög specifik yta, vilket gör det nästan otillämpbart för makroskopiska fasta planytor. Dessutom bör faktorer som instabilitet i sols, nanopartikelaggregat, sorbent kristalllinitet, nanopartikelstorleksfördelning, pH-värdet och konkurrensen om adsorption beaktas när man studerar adsorberande peptider. Utarmning data isotherm konstruktion ger omfattande fysikalisk kemi data för bokstavligen varje löslig sorbate men är fortfarande den mest tillgängliga metoden, eftersom det inte kräver dyra inställningar. Denna artikel beskriver ett grundläggande protokoll för experimentell studie av peptid adsorption på oorganisk oxid och täcker alla kritiska punkter som påverkar processen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under de senaste 50 åren har samspelet mellan oorganiska ytor och peptider väckt stor uppmärksamhet på grund av dess stora betydelse inom materialvetenskap och medicin. Biomedicinsk forskning är inriktad på kompatibilitet och stabilitet av bioorganiska ytor, som har direkta konsekvenser för regenerativ medicin, vävnadsteknik1,,2,,3och implantation4,,5,,6,7. Moderna bioresponsiva enheter, såsom sensorer och ställdon, är baserade på funktionella proteiner immobiliserade på oxid halvledande ytor8,,9,10,,11,12,13. Moderna reningsmetoder för proteinproduktion är ofta beroende av biomolekylinteraktionsegenskaper vid nedströmsrening och separation14.

Bland flera oorganiska oxider är titandioxid fortfarande den mest utnyttjade i kombination med biologiskt relevanta substrat15,16. Forskningen inom tio2-baseradebiointerfaces har koncentrerats på att etablera stark och specifik bindning av proteiner och peptider utan att ändra deras biologiska och strukturella egenskaper. I slutändan är det viktigaste målet en hög yttäthet lager av biomolekyler med hög stabilitet och ökad funktionalitet som kommer att främja skapandet av titan-baserade biotekniska och medicinska tillämpningar17.

Titan och dess legeringar har använts i stor utsträckning som ett kirurgiskt implantatmaterial i minst sex decennier eftersom en yta TiO2 lager med en tjocklek på några nanometer är korrosionsbeständig och uppvisar en hög nivå av biokompatibilitet i många in vivo applikationer18,19,20. Titandioxid anses också allmänt vara ett oorganiskt substrat som produceras i biomineralisering, där kärnbildning och oorganisk fastillväxt tillsammans med proteiner och peptider kan ge material med lovande katalytiska och optiska egenskaper21,22,23,24.

Med tanke på den stora relevansen av samspelet mellan oorganiska material och biomolekyler i allmänhet och protein-TiO2 interaktioner i synnerhet, har det funnits en hel del forskning för att ta itu med manipulering och kontroll av adsorption av proteiner på TiO2. På grund av dessa studier, vissa grundläggande egenskaper hos denna interaktion har avslöjats, såsom adsorptionskinetik, yttäckning och biomolekylkonformation, vilket ger betydande stöd för ytterligare framsteg i biointerfaces5,13.

Proteinkomplexitet tillför dock betydande begränsningar för fullständig bestämning och förståelse av ett proteins molekylära interaktion med oorganiska ytor. Förutsatt att biomolekylerna interagerar med de oorganiska ytorna genom begränsade platser, har vissa proteiner med kända strukturer och aminosyrasekvenser reducerats till sina komponenter-peptider och aminosyror- som studeras separat. Några av dessa peptider har visat betydande aktivitet, vilket gör dem till ett unikt ämne för adsorption studier utan behov av tidigare proteinseparation25,26,27,28,29,30.

Kvantitativ karakterisering av peptidadsorption på TiO2 eller andra oorganiska ytor kan åstadkommas med hjälp av fysiska metoder som har anpassats speciellt för biomolekyler under de senaste decennierna. Dessa metoder inkluderar isotermmal titrering calorimetry (ITC), yta plasmon resonans (SPR), kvarts kristall mikrobalans (QCM), total intern reflektion fluorescens (TIRF), och försvagad total reflektans spektroskopi (ATR), som alla möjliggör detektion av adsorption styrka genom att tillhandahålla viktiga termodynamiska data: Bindning konstant, Gibbs fri energi, entalpi, och entropi31.

Adsorption av biomolekyler till det oorganiska materialet kan åstadkommas på två sätt: 1) ITC samt utarmningsmetoden använder partiklar som sprids i en lösning som binder till fasta makroskopiska ytor; 2) SPR, QCM, TIRF och ATR använder makroskopiska ytor som modifierats med oorganiskt material, såsom guldbelagt glas eller metallchips, kvartskristaller, zinksulfidkristaller respektive PMMA-chips.

Isotermmal titreringskalorimetri (ITC) är en etikettfri fysisk metod som mäter den värme som produceras eller konsumeras vid titrering av lösningar eller heterogena blandningar. Känsliga calorimetric celler upptäcka värmeeffekter så små som 100 nanojoule, vilket gör mätning av adsorption värme på nanopartikelytor möjligt. Termiskt beteende av sorbat under kontinuerlig tillägg- titrering, ger en fullständig termodynamisk profil av interaktionen avslöjar entalpi, bindande konstant, och entropi vid en given temperatur32,33,34,3535,36.

Ytplasmonresonans (SPR) spektroskopi är en ytkänslig optisk teknik baserad på mätning av brytningsindexet för media i närheten av den studerade ytan. Det är en realtids- och etikettfri metod för övervakning av reversibel adsorption och adsorbesängd lagertjocklek. Bindningskonstanten kan beräknas utifrån associations- och dissociationsfrekvenserna. Adsorptionsexperiment som utförs vid olika temperaturer kan ge information om aktiveringsenergins temperaturberoende och sekventiellt andra termodynamiska parametrar37,,38,39.

Kvartskristallmikrobalansen (QCM) metoden mäter förändringen i oscillerande frekvensen av piezoelektriska kristaller under adsorption och desorption processer. Bindningskonstanten kan utvärderas från förhållandet mellan adsorption och desorptions konstanter. QCM används för relativa massmätningar och behöver därför ingen kalibrering25,,27,40. QCM används för adsorption från både gas och vätska. Vätsketekniken gör att QCM kan användas som analysverktyg för att beskriva nedfall på olika modifierade ytor41.

Total intern reflektion fluorescens (TIRF) är en känslig optisk interfacial teknik baserad på mätning av fluorescens av adsorberas fluorofores upphetsad med internt reflekterade evanescent vågor. Metoden möjliggör detektion av fluorescerande molekyler som täcker ytan med tjocklekar i storleksordningen tiotals nanometer, varför det används i studien av makromolekylär adsorption på olika ytor42,43. In situ övervakning av fluorescensdynamiken vid adsorption och desorption ger adsorptionskinetik och därmed termodynamiska data42,43.

Försvagad total reflektans (ATR) användes av Roddick-Lanzilotta för att etablera lysinasorptionsotthermer baserade på lysinspektrala band på 1 600 och 1 525 cm-1. Detta är första gången som bindningskonstanten för en peptid på TiO2 fastställdes med hjälp av en in situ infraröd metod44. Denna teknik var effektiv vid fastställandet av adsorption isotherms för polylysin peptider45 och sura aminosyror46.

Till skillnad från ovannämnda metoder, där adsorptionsparametern mäts på plats, mäts mängden adsorberas biomolekyler i ett konventionellt experiment genom koncentrationsförändringen efter det att ytan har kontaktat lösningen. Eftersom koncentrationen av en sorbat sönderfaller i en stor majoritet av adsorption fall, denna metod kallas utarmning metod. Koncentrationsmätningar kräver en validerad analys, som kan baseras på en inneboende analytisk egenskap hos sorbat eller på grundval av märkningen47,,48,,49,,50 eller derivat51,,52 i dessa.

Adsorptionsexperiment med QCM, SPR, TIRF eller ATR kräver särskild ytpreparering av de chips och sensorer som används för adsorptionsstudier. Beredda ytor bör användas en gång och kräva förändring vid byte av adsorbat, på grund av den oundvikliga hydrering av oxidytan eller eventuell chemisorption av en sorbat. Endast ett prov i taget kan köras med ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, medan man i utarmningsmetoden kan köra dussintals prover, för vilka kvantiteten endast begränsas av termostatkapaciteten och sorbenttillgängligheten. Detta är särskilt viktigt vid bearbetning av stora provpartier eller bibliotek av bioaktiva molekyler. Viktigt är att utarmningsmetoden inte kräver dyr utrustning utan enbart en termostat.

Trots dess uppenbara fördelar kräver utarmningsmetoden emellertid komplexa procedurmässiga egenskaper som kan verka besvärliga. Den här artikeln presenterar hur man utför en omfattande fysikalisk kemisk studie av dipeptid adsorption på TiO2 med hjälp av utarmningsmetoden och tar upp problem som forskare kan ställas inför när de utför relevanta experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Beredning av dipeptidlagerlösningar och utspädningar

  1. Beredning av 16 mM dipeptidlösning
    1. Placera 0,183 g av en dipeptid (Ile-His) (se Materialförteckning) i ett sterilt polymert provrör, späd till 35 ml med dubbeldestillerat vatten (DDW) och lös upp vid rumstemperatur (RT) under kraftig omrörning.
      OBS: Om dipeptiden inte löses upp i DDW under omrörning, placera dipeptidlösningen i ett ultraljudsbad och sonikerat i några minuter.
    2. Förbered en 50 mM-lösning på 2-( N-morpholino)etanestyr (MES) buffert genom att lösa upp 0,533 g torr 2-(N-morpholino)etanestulfensyra i 50 ml DDW i det sterila provröret.N Förbered en 50 mM natriumhydroxidlösning genom att lösa upp 200 mg natriumhydroxid i 100 ml DDW.
    3. Justera pH-värdet för den predissolved dipeptidlösningen till 7.4 genom att noggrant tillsätta (mikrolitertitrering) 50 mM MES, eller 50 mM natriumhydroxid till 16 mM dipeptidelösningen, rör om vid RT och övervakning av pH-värdet med en pH-mätare. Efter justering av pH, häll lösningen i en mätcylinder, skölj provröret och fyll mätcylindern med DDW till 40 ml för att göra en slutlig koncentration på 16 mM.
  2. Beredning av dipeptidsutspädningar från 16 mM-stamlösning
    1. Förbered peptidutspädningar med koncentrationer mellan 0,4 och 12,0 mM genom att späda ut 16 mM-dipeptidlösningen med DDW. För att till exempel förbereda en 8 mM dipeptidlösning, tillsätt 7 ml DDW till 10 ml av 16 mM dipeptidlösningen. Justera pH-värdet efter utspädning till 7,4 genom att tillsätta 50 mM MES eller 50 mM NaOH droppe för droppe till dipeptidlösningen (se steg 1.1.3). Efter justering av pH, häll lösningen i en mätcylinder, skölj provröret och fyll mätcylindern upp till 20 ml med DDW för att göra dipeptidkoncentrationen 8 mM.
      ANMÄRKNING: Andra utspädningar på 16 mM dipeptide-stamlösning med koncentrationer på 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 och 12,0 mM, bereds i enlighet med figur 1. Justeringen av varje dipeptidlösning pH till 7.4 beskrivs i steg 1.1.3.

2. Beredning av titania sol

  1. Förbered en 10 mM-lösning av MES-bufferten genom att lösa upp 1,066 g MES i 500 ml DDW. Justera pH-värdet till 7,4 med torr natriumhydroxid vid omrörning och övervakning av pH-värdet med pH-mätaren.
  2. Slipa 200 mg nanokristallin TiO2 i en murbruk i minst 5 min (se Tabell över material).
  3. Väg 40 mg av marken titandioxid nanopartiklar i ett laboratorium kolv. Lägg kolven i ultraljudsbehandling badet (se Tabell av material)med hjälp av laboratoriet monter.
  4. Tillsätt 20 ml 10 mM MES-buffert i kolven med TiO2 och sonikerat i ett ultraljudsbad (5 L, 40 kHz, 120 W) i 20 min.

3. Blandning och termostatering

  1. Ställ termostaten (se Materialtabellen)till önskade temperaturer (dvs. 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 eller 40,00 °C).
  2. Lägg till 1 ml av den sonicated sol av TiO2 till markerade adsorption injektionsflaska. Placera de markerade adsorptionsflaskan mot motsvarande dipeptidutspädning i en provisorisk flytanordning av extruderat polystyrenskum. Placera flytanordningen med de märkta injektionsflaskarna och motsvarande dipeptidsutspädningar i termostaten i minst 5 minuter.
  3. Tillsätt 1 ml av varje dipeptidutspädning till motsvarande markerade adsorptionsflaska och se till att alla blandningslösningar har samma temperatur. Förvara serien med erhållna adsorptionsprover på termostaten vid 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 eller 40,00 °C i 24 timmar för att uppnå adsorptionsjämvikten.
    OBS: Skaka försiktigt alla prover av erhållna dispersioner innan de sätts in i termostaten.
  4. Blanda ibland TiO2 2-dispersionerna genom att manuellt skaka dem under termostatning.

4. Filtrering av termostatproverna

  1. För att undvika temperaturinducerad reequilibration ta ut ett prov i taget från termostaten för filtrering.
  2. Ta ett prov av dipeptidlösningen från varje glasflaska med en spruta, genom en sprutanål. Ta bort nålen från sprutan och sätt på sprutfiltret (se Materialbord)för att filtrera in dipeptidlösningen i glasflaskan. Upprepa filtreringen med de andra proverna.
  3. Analysera filtratet i enlighet med avsnitt 5.
    OBS: Centrifugera inte proverna eftersom det tar några minuter och kan orsaka en förändring i koncentrationsjämvikten.

5. Derivat- och HPLC-analys

  1. Gör en 50 ml-lösning av trifluoracetisk syra (TFA) i acetonitril. Tillsätt 0,34 ml TFA i mätcylindern och justera lösningens volym till 50 ml med acetonitril vid RT.
    VARNING: Arbeta med TFA under en rökhuva med frånluftsventilation, eftersom trifluoracetisk syra är skadligt vid inandning, orsakar svåra brännskador i huden och är giftigt för vattenlevande organismer även vid låga koncentrationer53.
  2. Förbered härledningslösningen (dvs. Edman-reagens54) genom att placera 299 μL fenylisothiocyanat och 347 μL trietylamin i en graderad cylinder och justera volymen av lösningen till 50 ml med acetonitril vid RT.
  3. Före den högpresterande analysen av vätskekromatografi (HPLC) härleds proverna med Edmans reagens i kromatografiflaskan. Blanda 400 μL av provet med 400 μL av Edmans reagens. Värm provet vid 60 °C i 15 min. Efter uppvärmning, neutralisera provet med 225 μL av TFA-lösningen och vänta i några minuter för att kyla provet till RT.
  4. Använd HPLC-analys (se Tabell över material)för att bestämma koncentrationen av dipeptidlösningen före och efter adsorption. Placera kromatografi injektionsflaska med de analyserade lösningarna i HPLC autosampler och börja analysera proverna med de nödvändiga villkoren, som ställs in av programvaran (se Tabell över material).
    OBS: Den mobila fasen består av 0,1% TFA i avjoniserat vatten och ren acetonitril, med acetonitril gradienter från 20-90% vid 286 nm i 13 min. Analysera varje prov i tre exemplar. Mät koncentrationen av dipeptidlösningen med hjälp av den tidigare fastställda kalibreringskurvan (figur 2). För kromatografispecifikationer se Shchelokov et al.55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorption av en dipeptid på nanokristallina titandioxid studerades vid de biokompatibla förhållandena i ett temperaturområde på 0−40 °C. Experimentell dipeptid adsorption (A, mmol/g) på ytan av en titandioxid utvärderades som

Om C0 och Ce är dipiltidsstart- respektive jämviktskoncentrationerna i millimol, V är volymen av en dipeptidlösning i liter; och m är vikten av sorbent i gram.

Mätningarna av dipeptide-adsorptionen behandlades med Henry-modellen. Denna isothermmodell förutsätter adsorption vid relativt låga koncentrationer med sorberatmolekylerna isolerade från varandra på en sorbent yta och är lämplig för att beskriva experimentella data (figur 3). Observera dock att denna modell endast kan tillämpas vid reversibel adsorption, vilket också bör bekräftas. IR-spektroskopi av det sköljda materialet flera gånger är lämplig för detta ändamål. De erhållna jämviktspeptidmängderna på TiO2 och lösningen är relaterade i enlighet med den linjära ekvationen:

där KH är Henrys adsorption konstant.

Jämviktsbindande konstant KH erhölls från lutningen av beroendet av dipeptid adsorption (A) på dipeptide jämviktskoncentrationen (Ce). Standarden Gibbs fri energi(ΔG, kJ / mol) för varje temperatur T fastställdes genom Van't Hoff ekvation:

där R är den idealiska gaskonstanten i J/mol*K, och T är temperaturen i adsorptionsprocessen i Kelvin.

Dipeptid Gibbs fria energier som bestäms vid varje temperatur(figur 4) lämnas entalpy (ΔH) som en avlyssning av den linjära regressionen med axeln. Regressionsvariabeln, entropinsen för processen (ΔS), härleddes från den grundläggande ekvationen:

De beräknade värdena för jämviktsbindningskonstanten (KH), standard Gibbs energy (ΔG), enthalpy (ΔH) och entropin (ΔS) för Ile-His presenteras i tabell 1.

Figure 1
Figur 1: Utspädning av 16 mM dipeptidelagerlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringskurva vid olika dipeptidkoncentrationer. Dipeptidkoncentrationerna var mellan 0,4-16,0 mM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Dipeptide-adsorptionsotertionsoteringsisotherms som beräknas av Henry-modellen för varje temperatur. Dipeptidsansorption isotherms vid(A) 0 °C(B)10 °C(C)20 °C(D)30 °C och (E) 40 °C, respektive. De beräknade korrelationskoefficienterna (R2) föll i ett 0,96−0,99-intervall för alla erhållna Henry-modellisothermer. Felstaplar representerar konfidensintervallet på 95 % för varje provkoncentration mätt i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Beroende av den vanliga Gibbs fri energi av dipeptide adsorption på temperatur. Felstaplar representerar konfidensintervallet på 95 % för Gibbs fria energi som indirekt mätning baserad på Henry Model. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

T, K KH ΔG0, kJ/mol ΔH0, kJ/mol ΔS0, kJ/mol K
273.15 0,32 ± 0,01 2,6 ± 0,0 - 41 ± 9 - 0,16 ± 0,03
283.15 0,25 ± 0,01 3,2 ± 0,1
293.15 0,17 ± 0,06 4,3 ± 0,9
303.15 0,050 ± 0,002 7,6 ± 0,1
313.15 0,037 ± 0,002 8,3 ± 0,1

Tabell 1: Termodynamiska parametrar för dipeptid adsorption.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorption från lösningar för isothermkonstruktion kräver en längre tid för jämvikt på grund av kinetiska begränsningar och sorbenter med en hög specifik yta. Dessutom bör instabilitet hos sols, nanopartikelaggregat, kristalllinitet, nanopartikelstorleksfördelning, pH-material och konkurrens om adsorption övervägas medan adsorberande aminosyror. Adsorption isotherm konstruktion med hjälp av utarmning metoden är dock den mest tillgängliga metoden, eftersom det inte kräver dyra inställningar, och ändå ger uttömmande fysikalisk kemi data för bokstavligen varje löslig sorbat.

Man måste skilja mellan adsorptionslägen (dvs. lösningsdispergerade partiklar eller på en fast yta) när ett kristallint material används som sorbent. Man bör förvänta sig en betydande skillnad i fördelningen av kristallina ansikten på makroskopiskt plana ytor och på partiklar. Resulterande termodynamiska parametrar bestäms från adsorption av peptider på nanopartiklar kanske inte motsvarar de termodynamiska parametrarna för peptid adsorption till makroskopiskt plana ytor.

Den genomsnittliga mängden peptider adsorberas på de oorganiska ytorna är extremt låg. Vid rumstemperatur är detta värde ungefär flera hundra mikrogram per kvadratmeter28. Denna lilla mängd adsorbat kräver noggranna mätmetoder och fasta ämnen med välutvecklade ytor. Därför bör små partikelämnen med en stor specifik yta (hundratals kvadratmeter) användas för adsorptionsexperiment43,,56,57,58,59,60.

Peptider är, liksom proteiner, instabila, och behålla sin funktionalitet på ett smalt spektrum av villkor. Adsorptionsexperiment utfördes på nanokristallina titandioxid vid biokompatibla temperaturer på 0 °C-40 °C (273,15 K-313,15 K), som liknar dem som tillhör en normal, fungerande, levande organism. Adsorption vid högre eller lägre temperaturer är irrelevanta och bör inte beaktas för experimentet.

Multifunktionella biologiskt aktiva föreningar uppvisar också hög känslighet för pH av media, eftersom det påverkar ytladdningen och därmed Coulomb interaktioner mellan laddade funktionella grupper61,62,63. Sorbentladdningen av oxidmaterial är också pH-beroende tack vare aktiv protonutbyte på den hydratiseradeytbehandlar 64. För att fastställa stabilt pH-tillstånd för adsorptionsjämvikt krävs användning av en buffert. I denna studie används MES-bufferten för dess icke-samordnande egenskap65, så att den inte skulle konkurrera med peptiden för adsorption på metalloxidytan, till skillnad från fosfatbuffertar66.

Detta senaste test av aminosyra adsorption visar att den viktigaste bindande platsen på nanopartikeln är ytdefekten55. Defektfördelning på ytan är en av de minst kontrollerbara egenskaperna hos nanokristallinssubstraten, därför bör man använda sorbent från samma parti för att upprätthålla konsekvensen i adsorptionsstudier.

QCM, plasmon resonans och ITC är äkta metoder med subtil känslighet som i en kombination av spektroskopiska metoder avslöjar strukturella egenheter adsorbat under samspel med ytan. De övervinner dock inte kinetiska restriktioner och kräver fortfarande avsevärd tid för att uppnå adsorptionsjämvikt. Dessutom kan endast ett prov i taget bearbetas, vilket gör batchprovanalysen utmanande. Å andra sidan är den utarmningsmetod som presenteras enkel och begränsas endast till termostatkapaciteten, vilket gör det möjligt att bearbeta ett stort antal prover.

De termostaterade proverna bör filtreras så snart de avlägsnas från termostaten för att undvika temperaturinducerad reequilibration. Även om jämvikt vid en ny temperatur kan ta upp till några timmar, bör det minimeras att adsorptionsproverna vid en annan temperatur håller adsorptionsproverna vid en annan temperatur. Centrifugering av proverna för supernatant separation rekommenderas inte heller, eftersom det tar upp till några minuter och kan orsaka en förändring i koncentrationsjämvikten. Valet av filtermaterial beror på sorbate natur och bör minska eventuella filterbindning för maximal återvinning. Det är bäst att följa leverantörsinstruktioner och rekommendationer när du väljer specifika filter.

Dessutom bör man komma ihåg att koncentrationsförändringen i adsorptionsstudierna bör övervakas med hjälp av validerad kvantifieringsmetod med masspektrometri, radiospektroskopi eller UV-synlig spektroskopi. Analysen är enkel om adsorbaten är spektroskopiskt aktiv, annars krävs ytterligare märkning eller härledning av adsorbaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete fick ekonomiskt stöd av Ryska stiftelsen för grundforskning (anslag nr 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, A. J. Interfaces to Control Cell-Biomaterial Adhesive Interactions. Polymers for Regenerative Medicine. 203, Chapter 71 171-190 (2006).
  2. Mahmood, T. A., et al. Modulation of chondrocyte phenotype for tissue engineering by designing the biologic-polymer carrier interface. Biomacromolecules. 7, (11), 3012-3018 (2006).
  3. Gandavarapu, N. R., Mariner, P. D., Schwartz, M. P., Anseth, K. S. Extracellular matrix protein adsorption to phosphate-functionalized gels from serum promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 9, (1), 4525-4534 (2013).
  4. Horbett, T. Biological Activity of Adsorbed Proteins. Surfactant Science Series. 110, 393-413 (2010).
  5. Ratner, B. D., Hoffman, A. S., Schoen, F. J., Lemons, J. E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine. Elsevier Academic Press/Academic Press. San Diego. (2004).
  6. Jahangir, A. R., et al. Fluorinated surface-modifying macromolecules: Modulating adhesive protein and platelet interactions on a polyether-urethane. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (1), 135-147 (2002).
  7. Shen, M., et al. PEO-like plasma polymerized tetraglyme surface interactions with leukocytes and proteins: In vitro and in vivo studies. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 13, (4), 367-390 (2002).
  8. Wisniewski, N., Moussy, F., Reichert, W. M. Characterization of implantable biosensor membrane biofouling. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry. 366, (6-7), 611-621 (2000).
  9. Geelhood, S. J., et al. Passivating Protein Coatings for Implantable Glucose Sensors: Evaluation of Protein Retention. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81, 251-260 (2007).
  10. Knowles, J. R. Enzyme catalysis: not different, just better. Nature. 350, (6314), 121-124 (1991).
  11. Blankschien, M. D., et al. Light-triggered biocatalysis using thermophilic enzyme - Gold nanoparticle complexes. ACS Nano. 7, (1), 654-663 (2013).
  12. Wu, H., et al. Catechol modification and covalent immobilization of catalase on titania submicrospheres. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 92, 44-50 (2013).
  13. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Current Opinion in Structural Biology. 14, (1), 110-115 (2004).
  14. Hlady, V., Buijs, J. Protein adsorption on solid surfaces. Current Opinion in Biotechnology. 7, (1), 72-77 (1996).
  15. Kulkarni, M., et al. Titanium nanostructures for biomedical applications. Nanotechnology. 26, (6), 062002 (2015).
  16. Yin, F. Z., Wu, L., Gui Yang, H., Su, H. Y. Recent progress in biomedical applications of titanium dioxide. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, (14), 4844-4858 (2013).
  17. Rezania, A., Johnson, R., Lefkow, A. R., Healy, K. E. Bioactivation of metal oxide surfaces. 1. Surface characterization and cell response. Langmuir. 15, (20), 6931-6939 (1999).
  18. Schenk, R. The Corrosion Properties of Titanium and Titanium Alloys. Titanium in Medicine. Brunette, D. M., et al. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 145-170 (2001).
  19. Bozzini, B., et al. An electrochemical impedance investigation of the behaviour of anodically oxidised titanium in human plasma and cognate fluids, relevant to dental applications. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (11), 3443-3453 (2008).
  20. Popa, M. V., et al. Long-term assessment of the implant titanium material - Artificial saliva interface. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (1), 1-9 (2008).
  21. Kim, J. K., et al. Lysozyme-mediated biomineralization of titanium-tungsten oxide hybrid nanoparticles with high photocatalytic activity. Chemical Communications. 50, 12392-12395 (2014).
  22. Suriyaraj, S. P., Selvakumar, R. Room temperature biosynthesis of crystalline TiO2 nanoparticles using Bacillus licheniformis and studies on the effect of calcination on phase structure and optical properties. RSC Advances. 4, 39619-39624 (2014).
  23. Inoue, I., et al. Thermo-stable carbon nanotube-TiO2 nanocompsite as electron highways in dye-sensitized solar cell produced by bio-nano-process. Nanotechnology. 26, (28), 285601 (2015).
  24. Gardères, J., et al. Self-assembly and photocatalytic activity of branched silicatein/silintaphin filaments decorated with silicatein-synthesized TiO2 nanoparticles. Bioprocess and Biosystems Engineering. 39, (9), 1477-1486 (2016).
  25. Chen, H., Su, X., Neoh, K. G., Choe, W. S. QCM-D analysis of binding mechanism of phage particles displaying a constrained heptapeptide with specific affinity to SiO2 and TiO2. Analytical Chemistry. 78, (14), 4872-4879 (2006).
  26. Iucci, G., et al. Peptides adsorption on TiO2 and Au: Molecular organization investigated by NEXAFS, XPS and IR. Surface Science. 601, (18), 3843-3849 (2007).
  27. Gronewold, T. M. A., Baumgartner, A., Weckmann, A., Knekties, J., Egler, C. Selection process generating peptide aptamers and analysis of their binding to the TiO2 surface of a surface acoustic wave sensor. Acta Biomaterialia. 5, (2), 794-800 (2009).
  28. Gitelman, A., Rapaport, H. Bifunctional designed peptides induce mineralization and binding to TiO2. Langmuir. 30, (16), 4716-4724 (2014).
  29. Tada, S., Timucin, E., Kitajima, T., Sezerman, O. U., Ito, Y. Direct in vitro selection of titanium-binding epidermal growth factor. Biomaterials. 35, (11), 3497-3503 (2014).
  30. Micksch, T., Liebelt, N., Scharnweber, D., Schwenzer, B. Investigation of the peptide adsorption on ZrO2, TiZr, and TiO2 surfaces as a method for surface modification. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, (10), 7408-7416 (2014).
  31. Limo, M. J., Perry, C. C., Thyparambil, A. A., Wei, Y., Latour, R. A. Experimental Characterization of Peptide-Surface Interactions. Bio-Inspired Nanotechnology: From Surface Analysis to Applications. 37-94 (2013).
  32. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 87, 313-325 (2014).
  33. Omanovic-Miklicanin, E., Manfield, I., Wilkins, T. Application of isothermal titration calorimetry in evaluation of protein-nanoparticle interactions. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 127, 605-613 (2017).
  34. Jing, X., et al. Interaction of peptidomimetics with bilayer membranes: Biophysical characterization and cellular uptake. Langmuir. 28, (11), 5167-5175 (2012).
  35. Mizuguchi, C., et al. Effect of phosphatidylserine and cholesterol on membrane-mediated fibril formation by the N-terminal amyloidogenic fragment of apolipoprotein A-I. Scientific Reports. 8, (1), 5497 (2018).
  36. Bisker, G., et al. Insulin Detection Using a Corona Phase Molecular Recognition Site on Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Sensors. 3, (2), 367-377 (2018).
  37. Singh, N., Husson, S. M. Adsorption thermodynamics of short-chain peptides on charged and uncharged nanothin polymer films. Langmuir. 22, (20), 8443-8451 (2006).
  38. Seker, U. O. S., et al. Thermodynamics of engineered gold binding peptides: Establishing the structure-activity relationships. Biomacromolecules. 15, (7), 2369-2377 (2014).
  39. Beutner, R., Michael, J., Schwenzer, B., Scharnweber, D. Biological nano-functionalization of titanium-based biomaterial surfaces: A flexible toolbox. Journal of the Royal Society Interface. 7, (Suppl 1), S93-S105 (2010).
  40. Sultan, A. M., et al. Aqueous Peptide-TiO2 Interfaces: Isoenergetic Binding via Either Entropically or Enthalpically Driven Mechanisms. ACS Applied Materials and Interfaces. 8, (28), 18620-18630 (2016).
  41. Teichroeb, J. H., Forrest, J. A., Jones, L. W., Chan, J., Dalton, K. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption kinetics on poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Journal of Colloid and Interface Science. 325, (1), 157-164 (2008).
  42. Lok, B. K., Cheng, Y. L., Robertson, C. R. Protein adsorption on crosslinked polydimethylsiloxane using total internal reflection fluorescence. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 104-116 (1983).
  43. Nakanishi, K., Sakiyama, T., Imamura, K. On the Adsorption of Proteins on Solid Surfaces, a Common but Very Complicated Phenomenon. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91, (3), 233-244 (2001).
  44. Roddick-Lanzilotta, A. D., Connor, P. A., McQuillan, A. J. An In Situ Infrared Spectroscopic Study of the Adsorption of Lysine to TiO2 from an Aqueous Solution. Langmuir. 14, 6479-6484 (1998).
  45. Roddick-Lanzilotta, A. D., McQuillan, A. J. An in situ infrared spectroscopic investigation of lysine peptide and polylysine adsorption to TiO2 from aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 217, (1), 194-202 (1999).
  46. Roddick-Lanzilotta, A., McQuillan, A. An in situ infrared spectroscopic study of glutamic acid and of aspartic acid adsorbed on TiO2: implications for the biocompatibility of titanium. Journal of Colloid and Interface Science. 227, (1), 48-54 (2000).
  47. Chan, B. M. C., Brash, J. L. Adsorption of fibrinogen on glass: reversibility aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 82, (1), 217-225 (1981).
  48. van Enckevort, H. J., Dass, D. V., Langdon, A. G. The adsorption of bovine serum albumin at the stainless-steel/aqueous solution interface. Journal of Colloid And Interface Science. 98, (1), 138-143 (1984).
  49. Arnebrant, T., Nylander, T. Sequential and competitive adsorption of β-lactoglobulin and κ-casein on metal surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 111, (2), 529-533 (1986).
  50. Van Dulm, P., Norde, W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 248-255 (1983).
  51. Gonçalves, T. Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chemical Reviews. 109, (1), 190-212 (2009).
  52. Roth, K. D. W., Huang, Z. H., Sadagopan, N., Watson, J. T. Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 17, (4), 255-274 (1998).
  53. AppliChem, P. Safety Data Sheet According to Regulation (EU) 830/2015 3317 Trifluoroacetic Acid. http://pub.panreac.com/msds/ing/3317.htm 112 (2018).
  54. Heinrikson, R. L., Meredith, S. C. Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate. Analytical Biochemistry. 136, (1), 65-74 (1984).
  55. Shchelokov, A., et al. Adsorption of Native Amino Acids on Nanocrystalline TiO2: Physical Chemistry, QSPR, and Theoretical Modeling. Langmuir. 35, (2), 538-550 (2019).
  56. Fair, B. D., Jamieson, A. M. Studies of Protein Adsorption on Polystyrene Latex Surfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 77, (2), 525-534 (1980).
  57. Kim, J. C., Lund, D. B. Adsorption behavior of p-lactoglobulin onto stainless steel surfaces. Journal of Food Processing and Preservation. 21, (607), 303-317 (1997).
  58. Kondo, A., Oku, S., Murakami, F., Higashitani, K. Conformational changes in protein molecules upon adsorption on ultrafine particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1, 197-201 (1993).
  59. Itoh, H., Nagai, T., Saeki, T., Sakiyama, T., Nakanishi, K. Adsorption of Protein onto Stainless Steel Particle Surface and its Desorption Behavior. Developments in Food Engineering. 811-813 (1994).
  60. Itoh, H., Nagata, A., Toyomasu, T., Sakiyama, T., Nagai, T. Adsorption of β-Lactoglobulin onto the Surface of Stainless Steel Particles. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59, (9), 1648-1651 (1995).
  61. Mudunkotuwa, I. A., Grassian, V. H. Histidine adsorption on TiO2 nanoparticles: An integrated spectroscopic, thermodynamic, and molecular-based approach toward understanding nano-bio interactions. Langmuir. 30, 8751-8760 (2014).
  62. Pászti, Z., Guczi, L. Amino acid adsorption on hydrophilic TiO2: A sum frequency generation vibrational spectroscopy study. Vibrational Spectroscopy. 50, (1), 48-56 (2009).
  63. Costa, D., Savio, L., Pradier, C. M. Adsorption of Amino Acids and Peptides on Metal and Oxide Surfaces in Water Environment: A Synthetic and Prospective Review. Journal of Physical Chemistry B. 120, (29), 7039-7052 (2016).
  64. Kosmulski, M. The significance of the difference in the point of zero charge between rutile and anatase. Advances in Colloid and Interface Science. 99, (3), 255-264 (2002).
  65. Kandegedara, A., Rorabacher, D. B. Noncomplexing tertiary amines as "better" buffers covering the range of pH 3-11. Temperature dependence of their acid dissociation constants. Analytical Chemistry. 71, (15), 3140-3144 (1999).
  66. Susumu, O., Teruaki, A., Koichi, T. The Adsorption of Basic a-Amino Acids in an Aqeous Solution by Titanium(IV) Oxide. Bulletin of the Chemical Society of Japan. 54, 1595-1599 (1981).
Studie av kort peptid adsorption på lösning spridda oorganiska nanopartiklar med utarmning metod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter