Summary
ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。
Abstract
好中球による細胞外トラップ(けること)の放出は、慢性炎症に関連する疾患の発症に寄与する要因として同定されている。好中球のNETs(NETs)は、DNA、ヒストンタンパク質、および様々な顆粒タンパク質(すなわち、骨髄ペルオキシダーゼ、エラスターゼ、およびカテプシンG)のメッシュからなる。マクロファージを含む他の免疫細胞も、ETを産生することができる。しかしながら、これは生体内でどの程度起こるのか、そしてマクロファージ細胞外トラップ(MET)が病理学的メカニズムにおいて役割を果たすかどうかは、詳細には調べていない。炎症性病理におけるMETの役割をよりよく理解するために、インビトロで一次ヒトマクロファージからのMET放出を可視化するためのプロトコルが開発され、免疫蛍光実験でも利用できる。これにより、これらの構造のさらなる特性評価と好中球から放出されるEとの比較が可能になります。ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、M1前炎症表現型への分化に続いて異なる炎症刺激にさらされるとMETを産生する。METの放出は、生細胞(例えば、SYTOXグリーン)に含まれる緑色蛍光核酸染色を用いて顕微鏡検査によって可視化することができる。HMDMのような単に単離された一次マクロファージの使用は、潜在的な臨床応用に関連する生体内炎症性イベントのモデリングに有利である。このプロトコルはまた、ヒト単球細胞株からのMET放出(例えば、THP−1)をホルボル酢酸または他のマクロファージ細胞株(例えば、マウスマクロファージ様J774A.1細胞)とのマクロファージへの分化後に使用することもできる。
Introduction
好中球からの尿毒剤の放出は、まず細菌感染1によって引き起こされる自然免疫応答として同定された。それらは、好中球エラスターゼおよび骨髄oxoxidase2を含む抗菌特性を有する種々の顆粒タンパク質が結合するDNA骨格からなる。好中球のNE(NETs)の主な役割は、病原体を捕捉し、その除去を促進することです 3.しかし、免疫防御におけるETの保護的役割に加えて、特に炎症主導疾患の発症時(すなわち、関節リウマチおよび関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症 4).Eの放出は、インターロイキン8(IL-8)および腫瘍壊死因子α(TNFα)5、6を含む様々な炎症性サイトカインによって引き起こされ、およびEの局所的な蓄積は、組織損傷を増加させ、誘発することができる炎症性反応7.例えば、ETは、アテローム性動脈硬化症8の発症に因果的役割を果たし、血栓症9を促進し、心血管リスク10を予測することに関与している。
好中球に加えて、他の免疫細胞(すなわち、肥満細胞、好酸球、およびマクロファージ)も微生物または炎症刺激11、12への曝露時にEを放出できることが認識されている。これは、慢性炎症性疾患の発症、調節、および解決における重要な役割を考慮して、マクロファージの場合に特に重要であり得る。したがって、マクロファージからのET放出と炎症関連疾患発症との間の潜在的な関係をより深く理解することが重要である。最近の研究は、無傷のヒトアテローム硬化性プラークおよび組織化された血栓13におけるMETおよびNETの存在を示している。同様に、METは、炎症反応14の調節を介して腎臓損傷を駆動するのに関与している。しかしながら、好中球とは対照的に、マクロファージからのMET形成のメカニズムに関するデータは限られている。MET形成のヒトin vitroモデルを用いた最近の研究は、各細胞型に関与する経路のいくつかの違いを示す(すなわち、マクロファージによるヒストンシトルリン化の欠如に関して)6.しかし、一部の人々は、ヒストンシトルリン化15がない場合にもNETリリースが発生する可能性があることを示しています。
このプロトコルの全体的な目標は、臨床的に関連するマクロファージモデルでMET放出を評価するための簡単で直接的な方法を提供することです。MET(すなわち、THP-1ヒト単球細胞株および各種マウスマクロファージ細胞株)16を研究するために使用されている多数の異なるin vitroマクロファージ細胞モデルがある。これらのモデルに関連するいくつかの制限があります。例えば、マクロファージに対するTHP-1単球の分化には、通常、プロテインキナーゼC(PKC)依存性経路を活性化するフォルボル菌性酢酸(PMA)の添加などのプライミングステップが必要です。このプロセスは、ETリリース4をトリガすることが知られており、THP-1細胞からの低基底MET放出をもたらす。他の研究は、PMA処理THP-1細胞17と比較して、生体内のマクロファージによって取り付けられた生理活性および炎症応答のいくつかの違いを強調している。
同様に、異なるマウスマクロファージ様細胞株の挙動および炎症応答は、一次ヒトマクロファージ18の応答スペクトルを完全に表すものではない。従って、臨床現場におけるマクロファージET形成を調べる目的で、原発ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、単球性またはマウスマクロファージ様細胞株よりもむしろより関連性の高いモデルであると考えられている。
M1偏光HMDMからのET放出は、ミエロペルオキシダーゼ由来酸化性次亜塩素酸(HOCl)、PMA、TNFα、およびIL-86を含む多数の異なる炎症刺激にこれらの細胞の曝露後に実証されている。ここで説明するプロトコルは、M1表現型にHMDMを偏光させ、これらの炎症刺激への曝露時にその後のMET放出を可視化するプロトコルである。PMAは、好中球を使用した以前の研究との比較を容易にするためにMETリリースの刺激として使用されます。重要なことに、HOCl、IL-8、およびTNFαはまた、生体内の炎症環境のより良いモデルであると考えられているMET放出を刺激するために使用される。ET放出の可視化のための顕微鏡的方法は、SYTOXグリーンを使用して生細胞培養中の細胞外DNAを染色することを含む、 SYTOXグリーン、以前の好中球研究で正常に適用された不浸透性蛍光緑色核酸染色。この方法は、ETリリースの迅速かつ定性的な評価を可能にしますが、ETリリース範囲を定量化するためのスタンドアロンの方法としては適切ではありません。異なる治療条件または介入から生じるET放出の程度を比較するために定量化が必要な場合は、代替方法論を使用する必要があります。
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Protocol
HMDMは、シドニー地方保健地区からの倫理の承認を得て血液銀行から供給されたヒトバフィーコート製剤から分離された。
1. HMDMカルチャー
- リンパ球を単離する市販の調製物を用いて健康なヒトドナーの末梢血から調製したバフィーコート製剤から単球を単離し、続いて逆電流遠心溶血19、 20.
- 単球特性評価用の修飾ギムサ染色による細胞紡糸および染色による単球の存在を確認する。
- 滅菌条件下では、血清を含まないRPMI-1640媒体を使用して、単球の密度を1 x 106細胞/mLに調整します。この細胞懸濁液を12ウェル組織培養プレートの各ウェルに1mL加える。5%CO2の存在下で37°Cの細胞インキュベーター中の培養は、組織培養プレートへの付着を促進する。
- 滅菌条件下で、細胞媒体を取り出し、10%(v/v)プールヒト血清および20mM L-グルタミンを含む完全なRPMI-1640培養媒体と交換します。
- 細胞インキュベーター中の5%CO2の存在下で37°Cで細胞を培養し、2日毎に培養する。
2. HMDMの偏光
- 滅菌条件下で、完全なRPMI-1640培養媒体にインターフェロンγ(IFNγ;20 ng/mL)とリポ多糖(LPS;1μg/mL)を加えてM1プライミング媒体を調製します。完全なRPMI-1640培養メディアにインターロイキン4(IL-4;20 ng/mL)を追加して、M2プライミングメディアを準備します。
- 滅菌条件下では、HMDMを含有する組織培養プレートウェルから吸引媒体を吸引し、セクション1に記載のように播種および培養した。
- 細胞3xを含むウェルを無菌PBSで慎重に洗浄し(37°Cに予温)、PBSの1mLアリコートを使用して洗浄する。
- HMDM を含む各ウェルに M1 または M2 プライミング メディアの 1 mL を追加します (実験に適した方)。
- 細胞インキュベーターに5%CO2の存在下で37°Cで48時間細胞をインキュベートする。
3. METリリースを誘導するHMDMの刺激
- 滅菌条件下で、MET放出の異なる刺激剤(実験に適したもの)を含む培養媒体を完全なRPMI-1640媒体に調製する:PMA(25nM)、ヒト組換えTNFα(25ng/mL)、またはヒト組換えIL-8(50ng/mL)).
- HOCl刺激の実験では、HBSS(37°Cに予温)でHOCl(200μM)を調製し、細胞に添加する直前に調製します。HOCl が完全なセル・メディアで準備されていないことを確認します。
注:HOClの原液の濃度は、溶液の紫外線吸光度を292nm及びpH=116で測定し、350M-1cm-121の消滅係数を用いて定量する。 - セクション2に記載の偏光処理の後、各ウェルから細胞媒体を吸引し、37°Cに予め温めた滅菌PBS(PMA、TNFαおよびIL-8の場合)またはHBSS(HOClの場合)のいずれか1mLアリコートで細胞3xを慎重に洗浄する。
- PMA、TNFα、またはIL-8の実験の場合:最終洗浄工程でPBSを除去した後、PMA、TNFα、またはIL-8を含む完全な媒体を1mL加えます。
- TNFαの実験では、細胞インキュベーター中に5%CO2の存在下で37°Cで6時間細胞をインキュベートする。PMAおよびIL-8の実験では、細胞インキュベーターに5%CO2が存在する場合、37°Cで24時間細胞をインキュベートします。
-
HOCl を使用した実験では、最後の洗浄工程で HBSS を取り外した後、HBSS に HOCl を 1 mL 追加します。次いで、細胞インキュベーター中に5%CO2の存在下で37°Cで15分間細胞をインキュベートする。
- 細胞上清を慎重に吸引し、ステップ3.3に記載されているようにHBSSの1 mLアリコートで細胞3xを洗浄する。
- 最終洗浄工程からHBSSを取り外した後、1mLの完全なRPMI-1640培養媒体を加える。次いで、細胞インキュベーター中の5%CO2の存在下で37°Cで24時間細胞をインキュベートする。
4. 生細胞培養におけるMETの可視化
- 40μMの濃度でHBSSにSYTOX緑色染料を調製します。
- セクション3で説明した処理の終わりにMET放出を誘導し、HMDMを含む各ウェルに40μMの25μLを直接添加する。
- 暗闇の中で5分間、室温(RT)で細胞をインキュベートする。
- HMDMを組織培養井戸に配置し、画像化用の反転蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージに設置します。
-
顕微鏡の手順
- 高解像度カラーデジタルカメラを搭載した広域スペクトル蛍光光源、明視野光源、反転顕微鏡をオンにします(材料表を参照)。
- 組織培養井戸内に含まれる緑色染色サンプルのイメージング用に、緑色蛍光(励起= 504 nm、発光=523nm)の「数2」の位置にフィルターホイールを回転させます。
- 5xの目的を使用して、粗い焦点で画像を焦点を合わせ、次に顕微鏡上の細かい焦点ノブは、画像が鮮明に見えるまで、透明で、顕微鏡の接眼を通して見たときに焦点を合わせます。
- 顕微鏡をカメラモードに切り替えます。
- 関連するソフトウェアを起動します。
- ソフトウェアの[キャプチャ]タブを選択します。
- [再生]ボタンをクリックしてイメージをプレビューし、画像がシャープで鮮明に表示され、ソフトウェアプレビューウィンドウにフォーカスが表示されるまで、顕微鏡の細かいフォーカスノブを調整します。
- [キャプチャ]ボタンをクリックします。
注:キャプチャした画像は、付属のソフトウェアに自動的に表示されます。 - ソフトウェア内で、[ファイル|必要なイメージ ファイルの種類として保存します。
- 顕微鏡で、フィルターホイールを明視野イメージング用の「5番」の位置に回転させ、手順4.5.2~4.5.9を繰り返して、対応する明視野画像を取得します。
- 後続のイメージ集録に必要に応じて、手順 4.5.2 ~ 4.5.10 を繰り返します。
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Representative Results
細胞分化の刺激に対するHMDMの形態変化を示す明視野画像を図1に示す。IFNγおよびLPSに曝露されたHMDMを用いた実験からのM1偏光マクロファージは、図1(中央パネル)の黒い矢印で示されるように細長く紡錘状の細胞形状を示した。比較のために、48時間のIL-4にHMDMを曝露した後のM2偏光マクロファージの形態は、図1(右端パネル)の黒い矢印で示されるように、典型的には円形かつ平坦であった。
図2に示すように、分化されたHMDM表現型がMETを放出する能力は、SYTOX緑色による生細胞蛍光イメージングによって可視化された。 図2Aは、炎症促進が存在しない場合に24時間インキュベートされた各HMDM表現型から得られた対照データを示す。この場合、この染色の細胞不浸透性を考えると、予想通り、非常に限られた緑色染色があった。図2Bは、HOCl、PMA、IL-8、またはTNFαへのM1 HMDMの曝露に起因する、METに対する陽性染色を示した。METは白い矢印で示され、緑色の縞として示され、細胞外DNAの鎖から生じる。HOClでは、細胞外DNAの染色に加えて、細胞内に緑色染色が見られた。この細胞染色はまた、他の刺激とある程度観察され、治療条件の結果としてET非依存性細胞死に起因する膜完全性の喪失を反映すると考えられている。
図2Bはまた、IL-4に曝露されたM2 HMで行われた対応する実験を示す。この場合、細胞外DNAの鎖/ストリークの欠如によって示される細胞からのDNAの放出はなかった。しかし、HOClとTNFαを用いた緑色蛍光色素の細胞取り込みがあった。比較目的で、図3は、4時間TNFα(50ng/mL)に曝露されたTHP-1マクロファージからのMET放出を示す代表的なデータを示す。この場合、細胞の非偏光集団が用いられ、前述の22例に従ってPMA(72時間50ng/mL)による前処理によりTHP-1単球をマクロファージと分化させたことに留意すべきである。
図1:微分偏光HMの形態学的変化非差別化および差別化された HMDM (n ≥5) からの代表的な明るいフィールド画像。HDMは、それぞれ48時間スケールバー=200μmのMNγおよびLPSまたはIL-4への曝露時にM1またはM2表現型にプライミングする前に、ヒト血清およびグルタミンを含む完全な媒体で培養した。矢印は、M1またはM2 HmDMの形態学的特性を示す細胞の例を示しています。
図2:HOCl、PMA、IL-8、およびTNFα刺激に続くM1 HMDMによって生成されるMET。(A)非刺激M1およびM2 HMDMからのSYTOX緑色染色HMDMの代表的な画像は、炎症刺激がない場合に24時間インキュベートし、MET放出の不在を示した。(B)M1およびM2 HMDMを1)HOCl(200μM、15分)、PMA(25nM)、またはIL-8(50 ng/mL)を24時間または2のインキュベーションで処理し、6時間のインキュベーションでMET放出を誘導した。METは、M1 HMDMから上部パネルの白い矢印で示されるように、SYTOXグリーンの添加によって可視化された。M2 HMDMとの対応する実験ではMETSは見られなかった。データはn≥3個体ドナーからの反復培養井戸を代表する。スケール バー = 500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TNFα刺激後の非偏光THP-1マクロファージによって産生されるMET。SYTOX緑色染色TNP-1マクロファージの代表的な画像は、MET放出を誘導するTNFα(50 ng/mL)の存在下で4時間のさらなるインキュベーションの前にPMA(72時間50ng/mL)による前処理によって分化した。METは、SYTOXグリーンを添加して可視化した。データは、n≥3実験からの反復培養井戸の代表である。スケール バー = 100 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
M1分化HmDMを用いたMET形成の生成と可視化は、特に慢性炎症下でこれらのマクロファージ構造の潜在的な病理学的役割を調べるのに有用である可能性のある新しいin vitroモデルを表す条件。これは、ヒト単球またはマウスマクロファージ細胞株との関連研究にも利用することができるMETを放出する原発ヒトマクロファージの刺激のための堅牢なプロトコルを提供する。HMDMによるMET形成の刺激のためのこのプロトコルの成功した実装は、良好な細胞生存率を維持するために慎重な細胞培養および取り扱いに依存する。これにより、観察される MET の範囲と品質が向上します。より良い細胞栄養を提供するために、HMDMを維持するために使用されるRPMI媒体は、胎児ウシ血清だけでなく、L-グルタミンではなく、ヒト血清を含むべきである。この完全なRPMIメディアの各原種ソリューションは、1週間以内に使用する必要があります。メディアの正しいストレージも重要です。メディアは、光がない場合は4°Cで保存する必要があります。
また、HMDMの培養中に顕微鏡で細胞の形状や形態を定期的に観察・モニタリングすることが重要です。IFNγおよびLPSまたはIL-4(マクロファージを偏光させる)の添加前に観察された細胞形状の異常または予期しない変化は、細胞生存率の低下を示し得る。HMDM は付着し、増殖しないようにする必要があります。したがって、通常の8日間の培養期間中に、形態、細胞密度、または付着の喪失の変化がないか細胞を監視することが重要です。最初の2日間の分離後の細胞密度の劇的な低下は、結果として得られるHmDMが後続の実験のために十分に実行可能でない可能性があることを示唆している。原発性ヒト細胞の使用の制限は、ドナー間の変動であり、MET放出の程度に著しく影響を及ぼす可能性がある。加えて、単球の単離のために受け取るバフィーコート製剤の品質は変化し得る。データが細胞のより大きな集団を表していることを確認するために、少なくとも3つの個々の細胞ドナーとの実験を繰り返すことが重要です。
HMDM分化のために記載されたプロトコルは、逆流溶血によってヒトバフィーコート製剤から単離された細胞に最適化されており、高純度単球調製をもたらすことに注意することが重要です。フローサイトメトリーによる偏光処理の検証(表現型を確認する)及びM1マーカーCD86及びM2マーカーCD206の発現の評価は、HMDM6のこの調製物を用いて以前に行われてきた。この単離方法は広くアクセス可能ではないかもしれないこと、および代替の単離方法(すなわち、磁気ビーズ選別)が好ましい可能性があることに理解される。単球または異なる単離プロトコルの代替供給源を使用する場合は、表現型変化を検証するための追加のフローサイトメトリー実験が推奨され、MET放出を刺激する治療条件のいくつかの最適化が必要な場合があります。
最適な蛍光画像を得るには、露出時間を慎重に調整し、接着コーティングを備えたプラスチック培養プレートからの背景蛍光や染色アーティファクトを避けるために、できるだけ短くする必要があります。細胞を含む各ウェルから複数の画像を取ることが重要です。蛍光顕微鏡分析の前に試料がブラインドされている場合に有利である。DNAの細胞外鎖を染色することに加えて、SYTOXグリーンの細胞取り込みのための証拠もあります。これは、MET放出による可能性のある膜完全性の喪失を反映していると考えられており、細胞死の代替経路を明らかにすることもできる(下記も参照)。これは、METリリースを定量化し、さらに特徴付けるために追加の実験を行うことの重要性を強調しています。
異なる治療条件下でのMET放出の程度の定量的比較、またはMET放出を調節するための異なる介入に続く場合には、さらなる分析が必要である。これは、前に6で説明したように、細胞上清中に存在する核およびミトコンドリアDNAのqPCR分析を行うことによって達成することができる。この方法は、通常、MET放出6とは無関係の細胞リシスを制御するために乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイと組み合わされる。SYTOXグリーン染色は、DNase処理後の蛍光プレートリーダーによって定量され、MEを部分的に消化し、培養プレートから放出します。この方法論は、好中球NETs1、2、23の以前の研究で広く使用されています。
このプロトコルの将来の応用は、免疫ヒストケミストリーを用いたMETのさらなる特性評価の機会を提供することに関する。標的抗体(すなわち、シトルリン化ヒストンまたはMPOに対して)を用いてこのアプローチを用いてMETのタンパク質組成をプローブし、より複雑な生物学的試料におけるこれらの構造の役割に関するさらなる洞察を得ることができます。これらの実験はまた、ピロトーシス15のような他の形態の細胞死に続くMET放出の線引きに、より多くの光を流すためにも重要である。私たちの経験では、マクロファージのMETは好中球のNETほどプレートに強く付着せず、免疫ヒスト化学分析をより困難にすることができます。それにもかかわらず、マクロファージが慢性炎症性疾患においてしばしば支配的な役割を果たすという事実を考えると、これらの実験のデータは興味深いであろう。これらの構造のさらなる特性評価は、これまでのところ限られた範囲16にしか行われてきた生体内での役割を評価するために重要である。この目的を達成するためにHMDMを使用して記載された方法は、他の不死化細胞株由来マクロファージ源と比較して、より臨床的に関連している可能性があると考えられている。しかし、これらの細胞株は、ドナー変動の可能性が低いMET特性評価のためのより安定したモデルを提供する上で有用である可能性があります。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、永久的なインパクト・グラント(IPAP201601422)とノボ・ノルディスク財団バイオメディカル・プロジェクト・グラント(NNF17OC0028990)によって支援されました。YZはまた、シドニー大学からオーストラリアの大学院賞を受賞したことも認めています。パット・ピサンサラキット氏とモーガン・ジョーンズ氏の単球分離と組織培養に関する支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
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