Summary

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Published: November 01, 2019
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Summary

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

Abstract

Die Freisetzung von extrazellulären Fallen (ETs) durch Neutrophile wurde als ein Faktor zur Entwicklung von Krankheiten im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen identifiziert. Neutrophile ETs (NETs) bestehen aus einem Netz aus DNA, Histonproteinen und verschiedenen Granulatproteinen (z. B. Myeloperoxidase, Elastase und Kathepsin G). Andere Immunzellen, einschließlich Makrophagen, können auch ETs produzieren; Inwieweit dies jedoch in vivo geschieht und ob extrazelluläre Makrophagenfallen (METs) in pathologischen Mechanismen eine Rolle spielen, wurde jedoch nicht im Detail untersucht. Um die Rolle von METs bei entzündlichen Pathologien besser zu verstehen, wurde ein Protokoll zur Visualisierung der MET-Freisetzung aus primären menschlichen Makrophagen in vitro entwickelt, das auch in Immunfluoreszenzexperimenten genutzt werden kann. Dies ermöglicht eine weitere Charakterisierung dieser Strukturen und deren Vergleich mit ETs, die von Neutrophilen freigesetzt werden. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDM) produzieren METs bei Exposition gegenüber verschiedenen entzündlichen Reizen nach Differenzierung zum m1-pro-inflammatorischen Phänotyp. Die Freisetzung von METs kann durch Mikroskopie mit einem grünen fluoreszierenden Nukleinsäurefleck visualisiert werden, der für lebende Zellen impermeant ist (z.B. SYTOX grün). Die Verwendung von frisch isolierten primären Makrophagen, wie HMDM, ist vorteilhaft bei der Modellierung von in vivo entzündlichen Ereignissen, die für potenzielle klinische Anwendungen relevant sind. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung von menschlichen Monozytenzelllinien (z. B. THP-1) nach Differenzierung in Makrophagen mit phorbolmyristateacetat oder anderen Makrophagenzelllinien (z. B. die murinen Makrophagen-ähnlichen J774A.1-Zellen) zu untersuchen.

Introduction

Die Freisetzung von ETs aus Neutrophilen wurde zuerst als angeborene Immunantwort identifiziert, die durch eine bakterielle Infektion ausgelöst wurde1. Sie bestehen aus einem DNA-Rückgrat, an das verschiedene Granulatproteine mit antibakteriellen Eigenschaften gebunden sind, einschließlich neutrophiler Elastase und Myeloperoxidase2. Die primäre Rolle von neutrophilen ETs (NETs) besteht darin, Krankheitserreger zu erfassen und deren Eliminierung zu erleichtern3. Neben der schützenden Rolle von ETs in der Immunabwehr haben jedoch immer mehr Studien eine Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten entdeckt, insbesondere bei der Entwicklung von entzündungsgetriebenen Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose4). Die Freisetzung von ETs kann durch verschiedene pro-inflammatorische Zytokine ausgelöst werden, einschließlich Interleukin 8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF)5,6, und die lokalisierte Anhäufung von ETs kann Gewebeschäden erhöhen und pro-entzündliche Reaktion7. Zum Beispiel, ETs wurden als eine kausale Rolle in der Entwicklung von Arteriosklerose8beteiligt , Förderung der Thrombose9, und Vorhersage kardiovaskulären Risiko10.

Es ist nun anerkannt, dass neben Neutrophilen auch andere Immunzellen (d. h. Mastzellen, Eosinophile und Makrophagen) ETs bei Exposition gegenüber der mikrobiellen oder pro-inflammatorischen Stimulation freisetzen können11,12. Dies kann besonders bei Makrophagen von Bedeutung sein, wenn man ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung, Regulierung und Lösung chronischer entzündlicher Erkrankungen berücksichtigt. Daher ist es wichtig, ein besseres Verständnis der potenziellen Beziehung zwischen DER FREISETZUNG von ET aus Makrophagen und der entwicklung von entzündungsbedingten Krankheiten zu gewinnen. Jüngste Studien haben das Vorhandensein von METs und NETs in intakten menschlichen atherosklerotischen Plaques und organisierten Thromben13gezeigt. In ähnlicher Weise wurden METs in die Fahrt nierenverletzung durch die Regulierung von Entzündungsreaktionen14verwickelt. Im Gegensatz zu Neutrophilen gibt es jedoch begrenzte Daten über die Mechanismen der MET-Bildung aus Makrophagen. Jüngste Studien mit menschlichen In-vitro-Modellen der MET-Bildung zeigen einige Unterschiede in den Pfaden, die an jedem Zelltyp beteiligt sind (d. h. in Bezug auf das Fehlen einer Histon-Zitrullination mit Makrophagen)6. Einige haben jedoch gezeigt, dass NET-Freisetzung auch ohne Histon-Citrullination15auftreten kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und direkte Methode zur Bewertung der MET-Freisetzung in einem klinisch relevanten Makrophagenmodell bereitzustellen. Es gibt eine Reihe von verschiedenen In-vitro-Makrophagenzellmodellen, die verwendet wurden, um METs zu untersuchen (d. h. die THP-1 menschliche Monozytenzelllinie und verschiedene murine Makrophagenzelllinien)16. Diesen Modellen sind einige Einschränkungen zugeordnet. Beispielsweise erfordert die Differenzierung von THP-1-Monozyten zu Makrophagen in der Regel einen Grundierungsschritt, wie z. B. die Zugabe von Phorbolmyristateacetat (PMA), das selbst Proteinkinase C (PKC)-abhängige Pfade aktiviert. Dieser Prozess ist dafür bekannt, ET-Freisetzung4 auszulösen und führt zu einer niedrigen basalen MET-Freisetzung aus THP-1-Zellen. Andere Studien haben einige Unterschiede in der Bioaktivität und Entzündungsreaktionen durch Makrophagen in vivo im Vergleich zu PMA-behandelten THP-1-Zellen17hervorgehoben.

In ähnlicher Weise stellen das Verhalten und die entzündlichen Reaktionen verschiedener muriner Makrophagen-ähnlicher Zelllinien das Reaktionsspektrum der primären menschlichen Makrophagen18nicht vollständig dar. Daher wird für die Untersuchung der Makrophagen-ET-Bildung im klinischen Umfeld angenommen, dass primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (HMDMs) eher ein relevanteres Modell als monozytäre oder murine makrophagenähnliche Zelllinien sind.

Die ET-Freisetzung von M1 polarisierten HMDMs wurde nach der Exposition dieser Zellen gegenüber einer Reihe verschiedener entzündlicher Reize, einschließlich der myeloperoxidase-abgeleiteten oxidanten Hypochlorsäure (HOCl), PMA, TNF und IL-86,nachgewiesen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, um HMDMs zum M1-Phänotyp zu polarisieren und die nachfolgende MET-Freisetzung bei Exposition gegenüber diesen entzündlichen Reizen zu visualisieren. PMA wird als Stimulus der MET-Freisetzung verwendet, um Vergleiche mit früheren Studien zu erleichtern, die Neutrophile verwendet haben. Wichtig ist, dass HOCl, IL-8 und TNF auch verwendet werden, um die MET-Freisetzung zu stimulieren, die als bessere Modelle der entzündlichen Umgebung in vivo geglaubt werden. Die mikroskopische Methode zur Visualisierung der ET-Freisetzung beinhaltet die Färbung der extrazellulären DNA in lebenden Zellkulturen mit SYTOX-Grün, einem undurchlässigen fluoreszierenden grünen Nukleinsäurefleck, der in früheren Neutrophilenstudien erfolgreich angewendet wurde. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und qualitative Bewertung der ET-Freisetzung, ist jedoch nicht als eigenständige Methode für die Quantifizierung der ET-Freisetzungsausdehnung geeignet. Es sollte eine alternative Methodik angewandt werden, wenn eine Quantifizierung erforderlich ist, um den Umfang der ET-Freisetzung zu vergleichen, die sich aus unterschiedlichen Behandlungsbedingungen oder Interventionen ergibt.

Protocol

Die HMDM wurden von menschlichen, buffy Mantelpräparaten isoliert, die von der Blutbank mit ethischer Genehmigung des Sydney Local Health District geliefert wurden. 1. HMDM Kultur Isolieren Sie die Monozyten aus buffy Mantelpräparaten aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern mit einem kommerziell erhältlichen Präparat zur Isolierung von Lymphozyten, gefolgt von gegenläufiger Zentrifugalelutriation19, 20</sup…

Representative Results

Hellfeldbilder, die die morphologischen Veränderungen von HMDM als Reaktion auf Reize zur Zelldifferenzierung zeigen, sind in Abbildung 1dargestellt. M1 polarisierte Makrophagen aus Experimenten mit HMDM, die IFN und LPS ausgesetzt waren, zeigten eine längliche und spindelartige Zellform, wie die schwarzen Pfeile in Abbildung 1 (mittleres Panel) zeigen. Zum Vergleich: Die Morphologie der polarisierten Makrophagen M2 nach Exposition von HMDM bei IL-4 für 48 h …

Discussion

Die Erzeugung und Visualisierung der MET-Bildung mit M1-differenzierten HMDMs stellt ein neues In-vitro-Modell dar, das für die Untersuchung der möglichen pathologischen Rolle dieser Makrophagenstrukturen, insbesondere bei chronisch entzündlichen Bedingungen. Es bietet ein robustes Protokoll für die Stimulation von primären menschlichen Makrophagen, um METs freizusetzen, die auch in verwandten Studien mit menschlichen Monozyten- oder murinen Makrophagenzelllinien verwendet werden können. Die erfolgreiche Umsetzung …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) und Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990) unterstützt. YZ bestätigt auch den Erhalt eines Australian Postgraduate Award von der University of Sydney. Wir danken Herrn Pat Pisansarakit und Frau Morgan Jones für die Unterstützung bei der Monozytenisolation und Gewebekultur.

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

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Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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