Summary
Detta protokoll genererar biopartikelmikroarrayer som ger rumsligt kontrollerad neutrofilssvärmar. Det ger enkel tillgång till medlare som neutrofiler släpper under migration och möjliggör kvantitativ bildanalys.
Abstract
Neutrofil swarming är en samarbetsprocess genom vilken neutrofiler spärra av en infektionsplats och främja vävnad omorganisation. Swarming har klassiskt studerats in vivo i djurmodeller som visar karakteristiska mönster av cellmigration. Men in vivo modeller har flera begränsningar, inklusive intercellulära medlare som är svåra att komma åt och analysera, liksom oförmåga att direkt analysera mänskliga neutrofiler. På grund av dessa begränsningar finns det ett behov av en in vitro-plattform som studerar med mänskliga neutrofiler och ger enkel tillgång till de molekylära signaler som genereras under svärmande. Här används en multistegs mikrostämplingsprocess för att generera en biopartikelmikroarray som stimulerar svärmande genom att härma en in vivoinfektion. Biopartikelmikroarrayen inducerar neutrofiler att svära på ett kontrollerat och stabilt sätt. På mikroarrayen ökar neutrofiler i hastighet och bildar stabila svärmar runt biopartikelkluster. Dessutom analyserades supernatant som genererades av neutrofiler och 16 proteiner upptäcktes ha uttryckts differentially under svärmande. Denna in vitro-svärmande plattform underlättar direkt analys av neutrofilmigration och proteinutsläpp på ett reproducerbart, rumsligt kontrollerat sätt.
Introduction
Neutrofiler, den mest rikliga vita blodkroppar i blodomloppet1, får uppmärksamhet som potentiella diagnostiska och terapeutiska mål2,3 eftersom de kan vara inblandade i en mängd olika medicinska tillstånd inklusive gout4, sepsis3, trauma5,6, cancer1,7,8, och olika autoimmuna sjukdomar5,9. Neutrofil swarming är en flerstegs, tätt reglerad process med en komplexitet som gör det till ett särskilt intressant fokus för studie5,10,11. Under svärma, neutrofiler isolera en plats för inflammation från den omgivande friskavävnaden 5,10,11. Korrekt reglering av neutrofil swarming är viktigt att främja sårläkning och i slutändan inflammation upplösning5,12. Neutrofil swarming har främst studerats in vivo hos gnagare12,13,14,15 och zebrafiskar10,11,12,15 modeller. Men arten av dessa in vivo djurmodeller ger upphov till begränsningar5. Till exempel är de medlare som släppts av neutrofiler under svärmar inte lättillgängliga för analys5. Dessutom finns det många potentiella källor för en viss medlare in vivo, så ett in vivo-experiment måste införa en genetisk brist för att hämma cellproduktionen och/eller interaktionen för att undersöka medlarens roll i en viss process13. Ett in vitro-experiment kringgår denna komplikation genom att möjliggöra neutrofil observation utan samband med ytterligare celler. Dessutom är forskning som beskriver human neutrophil samordnad migration begränsad16. På en in vitro-svärmande plattform kan mänskliga neutrofiler analyseras direkt. En in vitro-svärmande plattform skulle kunna utveckla den kunskap som erhållits från in vivo-studier genom att ge möjligheter att fylla de luckor som finns kvar av begränsningarna i in vivo-studier.
För att ta itu med behovet av en in vitro-plattform som efterliknar in vivo neutrophil swarming, utvecklade vi en microstamping plattform som gör det möjligt för oss att mönster biopartikel mikroarrayer som stimulerar neutrofil svärmar på ett rumsligt kontrollerat sätt. Vi genererar biopartikelmikroarrayer på glasrutschbanor i en tvåstegsprocess. Först använder vi mikrostämpling för att generera en mikroarray av katjoniska polyelektrolyt (CP) fläckar. För det andra lägger vi till en lösning av biopartiklar som följer CP-fläckarna via elektrostatisk interaktion. Genom att först mönstra CP-skiktet kan vi selektivt mönster negativt laddade biopartiklar för att generera önskat neutrofils sväringsmönster. Det positivt laddade skiktet håller de negativt laddade biopartiklarna genom det kraftfulla tvättsteget som tar bort biopartiklarna från områdena på glasbilden som inte har CP. Dessutom är den CP som används här, en sampolymer av akrylamid och pittorerad katjonisk monomer, biokompatibel, så det framkallar inte ett svar från neutrofiler. Den har en mycket hög ytladdning som immobiliserar mikronstora biopartiklar till glasbilden, vilket hämmar neutrofiler från att ta bort partiklarna från den mönstrade positionen på glasbilden. Detta resulterar i biopartikelkluster ordnade i en mikroarray. När vi lade till neutrofiler i mikroarrayen bildade de stabila svärmar runt biopartikelhoparna. Genom att spåra neutrofilmigration fann vi att svärmar neutrofiler aktivt migrerar mot biopartikelklustren. Dessutom använde vi denna plattform för att analysera vissa medlare som neutrofiler släpper under svärmande. Vi hittade 16 medlare som uttrycks i differentially under uppvärmningen. Deras koncentrationer följer tre allmänna trender över tiden: ökning, minskning eller spik. Vår in vitro neutrofil swarming plattform underlättar analysen av rumsligt kontrollerad mänsklig neutrophil swarming, liksom insamling och analys av medlare släpptes av neutrofil swarming. I en tidigare publikation visade vi att patienter med vissa medicinska tillstånd (trauma, autoimmun sjukdom och sepsis), hade neutrofiler som fungerade annorlunda än de från friska donatorer5. I framtida forskningsstudier kan vår plattform användas för att analysera neutrofilfunktion bland en mängd olika patientpopulationer. Denna plattform kan kvantitativt analysera den komplexa samordning en svärmning. Ytterligare studier kan göras för att ge insikt om neutrofil funktion av en viss patientpopulation eller neutrofil svar på en patogen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Författarna erkänner friska frivilliga som vänligt donerade sitt blod. Blodprover erhölls efter informerat frivilligt samtycke enligt institutionella granskningsnämnden (IRB) protokoll #2018H0268 granskas av Biomedical Sciences kommittén vid Ohio State University.
1. Mikrotillverkning av biopartikelmikroarray
- Med hjälp av vanliga fotolitografiförfaranden, generera befälhavaren kisel rån.
- Generera ett bevis på önskad design med hjälp av en datorstödd design (CAD) programvara, sedan skicka till en fotomask tillverkare för att producera en krom fotomask. Den konstruktion som används här är 4 mm x 4 mm rektangulära matriser med 30 μm diameter fylld i cirklar med en 150 μm center-to-center avstånd. Den här designen kan ändras efter önskemål för olika program.
- Spincoat ett 40 μm tjockt lager av ett negativt fotoresist på en kiselrån. Grädda wafer vid 65 °C i 5 min och 95 °C i 10 min.
- Exponera wafer till UV-ljus genom en krom fotomask med 150–160 mJ/cm2 (figur 1A).
- Grädda wafer vid 65 °C i 5 min och 95 °C i 10 min. Submerge wafer i photoresist utvecklare i 10 min och skölj med isopropyl alkohol. I detta skede bör mönstret vara synligt på wafer(figur 1B).
- Blanda noggrant ett 10:1-förhållande mellan polydimetylsiloxanprepolymer och dess härdningsmedel (dvs. 20 g förpolymer och 2 g härdningsmedel) och häll den ohärdade polydimetylsiloxanblandningen (PDMS) över huvudrånet i petriskål(figur 1C).
- Vakuum behandla den ohärdade PDMS blandningen tills inga luftbubblor finns över befälhavaren wafer. Cure vid 65 °C över natten.
- Använd en skalpell för att skära runt utsidan av den mönstrade delen av rånet, och långsamt ta bort den härdade PDMS-plattan. Placera PDMS-plattan på en ren skärbräda med den mönstrade sidan vänd uppåt(figur 1D).
- Stansut enskilda stämplar från PDMS-plattan med en 8 mm biopsi punch(bild 1E). För en glasbild behövs åtta frimärken.
- Placera varje stämpel nedåt på tejpen för att ta bort skräp.
- På förhand, förbereda en 1,6 mg/ml lösning av CP i vatten.
- Tillsätt rätt mängd av CP-pulvret i vatten (t.ex. 0,8 g till 500 ml).
- Blanda på en rörplatta i rumstemperatur över natten, eller tills allt fast är upplöst i vattnet. CP-lösningen kan förvaras i rumstemperatur i 6 månader.
- Om så önskas, gör CP-lösningen fluorescerande genom att lägga till poly-L-lysin märkt med fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC).
- Aliquot ca 10 ml av CP-lösningen. Lägg till en liten mängd PLL-FITC (0,05 mg) i den alinoterade volymen. Mängden kan ändras för att justera ljusstyrkan hos fluorescens som önskat.
- Vortex CP-lösningen märkt med FITC för 20 s, eller tills lösningen är en enhetlig, blekgul färg. Skydda mot ljus och förvara vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Med frimärkena face-up, prime varje stämpel med 100 μL av 1,6 mg/ml lösning av CP, vilket säkerställer att inga luftbubblor bildas mellan CP-lösningen och stämpeln(figur 1F).
- Invertera frimärkena på ett lager av CP-lösning (figur 1G).
- Ta bort frimärkena från CP-lösningen efter 1 h.
- Dab varje våt stämpel nedåt på en ren glasbild 6-8x för att ta bort överflödig vätska.
- Vakuum behandla frimärkena i 1–2 min.
- Håll en åtta brunn, 9 mm diameter bilddistans på toppen av en ren glasbild som en guide för stämpelplacering. Med den här distansen kan varje glasbild ha åtta mikroarrayer.
- Placera en stämpel nedåt på glasbilden i mitten av varje brunn av bilddistansen (dvs. använd åtta frimärken totalt).
- Placera en 5,6 ± 0,1 g balanserad vikt ovanpå varje stämpel och låt 10 min för stämpling(figur 1H). En balanserad vikt krävs för att säkerställa att stämpeln trycks jämnt på glasbilden och främjar även överföring av CP till glasbilden.
- Ta bort vikter och frimärken från glasbilden(bild 1I). Låt CP-skiktet torka i rumstemperatur i 24 timmar innan du lägger till biopartiklarna, enligt beskrivningen i steg 1.17. Om CP är märkt med FITC, kan effektiviteten av stämpling kontrolleras på denna punkt med ett fluorescerande mikroskop på 488 nm innan du fortsätter till steg 1,17(figur 1M).
- Skär en tom PDMS platta till storleken på bilddistansen och använd 8 mm biopsi punch för att skapa brunnar i PDMS som överensstämmer med brunnarna hos en bilddistans. Håll PDMS-plattan i glasbilden med bilddistansen(bild 1J).
- Tina upp en lösning av biopartiklar (t.ex. e. coli eller zymosan) och späd till 500 μg/ml i vatten för injektion (WFI).
OBS: Biopartiklarna behöver inte opsonized. Neutrophil ytreceptorer känner direkt igen molekyler på dessa biopartiklar19,20,21. - Tillsätt 100 μl biopartikellösning till varje PDMS väl på glasbilden(bild 1K).
- Häll glasbilden i 30 min.
- Skölj brunnarna noggrant med vatten. Biopartikelmikroarrayen kan förvaras i en dammfri miljö vid 4 °C i upp till 3 månader. Vid denna punkt bör mönstret kontrolleras med ett fluorescerande mikroskop vid 594 nm innan du fortsätter till steg 2.1(figur 1N).
2. Provberedning
- Samla minst 2 ml färskt blod i K2-EDTA-rör från den önskade givaren. Den förväntade avkastningen av neutrofiler är 1–2 x 106 celler/1 ml helblod. Bildanalysen kräver cirka 1,5 x 105 neutrofiler, och analysen av supernatant kräver 1 x 106 neutrofiler. Använd blodet inom 4 h.
- Separata röda blodkroppar (RFC) genom att lägga till ett erytrocytaggregering i ett 1:5-förhållande till hela blodet. Vänta 45 min på ett genomskinligt lager (buffy coat) för att separera från lagret av rfc.
- Ta bort buffy coat och tvätta med fosfat buffrad saltlösning (PBS) med 1 ml buffy coat: 9 ml PBS.
- Centrifug i 5 min vid 190 x g och 20 °C.
- Aspirera supernatanten och resuspend pelleten på 5 x 107 celler/ml.
- Använd en negativ immunomagnetisk urvalssats för att isolera neutrofiler.
- Tillsätt 50 μl antikroppscocktail/1 ml cellsuspension. Vänta 10 min.
- Tillsätt 100 μl magnetiska pärlor/1 ml cellsuspension. Vänta 10 min.
- Tillsätt cellfjädring till ett runda bottenrör och placera i en cylindrisk magnet. Vänta 10 min.
- Häll supernatant i ett centrifugrör. Lägg till upp till 10 ml PBS. Centrifug i 5 min vid 190 x g och 20 °C.
- Aspirera supernatant. Resuspend vit pellet i IMDM med 0,4% humant serum albumin.
- Fläckkärnor med 20 μg/ml Hoechst 33342 i 10 min vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml IMDM med 0,4% humant serum albumin att skölja. Centrifug i 5 min vid 190 x g och 20 °C.
- Resuspend celler på 7,5 x 105 celler/ml i IMDM med 0,4% humant serum albumin.
- Tillsätt 100 μl av cellsuspensionen till en PDMS som innehåller en biopartikelmikroarray. Se till att cellfjädringen är konvex över toppen av PDMS väl och inte innehåller några bubblor.
- Tätning med ett täckslip på 12 mm. Täck öppningen av PDMS brunn med ett täckslip på 12 mm. Tryck försiktigt ner på täckslip med pincett så att överskottcellfjädringen flyr till brunnens kant. Använd en vävnad för att ta bort överskottet cellsuspension.
3. Kör analysen och bildanalysen
- Ladda mikropartikelmatris med celler på den levande cellavbildningsstationen med ett mikroskop utrustat med en burinkubator inställd på 37 °C, 5% CO2och 90 % relativ luftfuktighet.
- Använd time-lapse fluorescerande och brightfield mikroskopi för att spela in bilder på 10x förstoring var 10 s på 405 nm, 594 nm och brightfield. I ett typiskt experiment samlas bilder upp till 2 h.
- Använd en automatiserad cellspårningsprogramvara för att spåra migreringen av enskilda neutrofiler mot biopartikelklustret.
- Använd autoregressionsläget för en cellspårningsprogramvara för dekorsomupptäckt. Ställ platsradien till 5 μm (den ungefärliga storleken på en neutrofilkärna). Ställ in den minsta spårlängden på 120 s och en maximal mellanrumsstorlek på en ram.
- Från de data som genereras av cellspårningsprogrammet extraherar du de filer som innehåller neutrofilpositionen och hastigheten. Dessa filer kan användas med en grafprogramvara för att generera neutrofiler migration spår(Figur 2C) och en värme karta över hastighet kontra tid(figur 2D),respektive.
- Använd 405 nm lysrörsbilder för att spåra svärm storlek över tiden på en bildanalys programvara som du väljer.
- Definiera regioner av intresse (ROI) runt varje biopartikelkluster där neutrofiler kommer att sväras. Behåll avkastningen på samma storlek för att analysera varje biopartikelkluster.
- Analysera medelvärdet av 405 nm-bilderna inom varje avkastningsgrader över tiden.
- Generera en kalibreringskurva med medelvärdet sviddintensitet till svärm storlek genom att ta manuella mätningar i olika svärmstorlekar från 0 μm2 till den maximala svärmstorleken. Använd den här kalibreringen för att beräkna svärmstorleken över tiden.
4. Supernatant insamling och protein detektion
- Inkubera neutrofiler i brunnarna som innehåller biopartikelmikroarrayen vid 37 °C och 5% CO2 för 3 h. Ta prover vid önskade tidpunkter. Vanligtvis kommer prover att tas på 0, 0,5, 1 och 3 h. För att övervinna gränsen för detektion av proteinarrayanalysen användes hela volymen supernatant av en enda brunn (200 μL) för varje gångpunkt. Varje gång punkt analyserades i treexemplar.
- Kontrollera att svärmar bildas på mikroarrayen med ett brightfield-mikroskop.
- Aspirera supernatanten med en 200 μL pipett och ladda i ett 0,45 μm centrifugfilterrör.
- Centrifugera supernatanten vid 190 x g och 20 °C i 5 min och samla in den filterade volymen.
- Förvara proverna vid -80 °C fram till bearbetningstiden.
- Använd en microarray kit som upptäcker en rad mänskliga proteiner för att bearbeta prover.
- Tillsätt 200 μl av varje prov i ett separat dialysrör som medföljer satsen.
- Placera dialysrören i en bägare som innehåller minst 500 ml PBS (pH = 8.0). Rör försiktigt på en rörplatta i minst 3 h vid 4 °C. Ändra PBS i bägaren och upprepa det här steget.
- Överför varje prov till ett rent centrifugrör och centrifuger vid 9 000 x g i 5 min för att avlägsna eventuella fällningar. Överför varje supernatant till ett rent rör.
- Biotinylate varje prov genom att lägga till 36 μl 1x märkningreagens från satsen per 1 mg totalt protein i dialyzed provet till 180 μL dialyzed prov. Inkubera vid 20 °C i 30 min. Blanda försiktigt var 5:e minut.
- Tillsätt 3 μl stopplösning som medföljer satsen i varje provrör. Överför varje prov till ett nytt dialysrör och upprepa steg 4.6.2–4.6.3. I detta skede kan provet förvaras vid -20 °C eller -80 °C tills du är redo att fortsätta.
- Glasrutschbanan som medföljer satsen förvaras vid -20 °C. Låt det komma till rumstemperatur. Placera den monterade glasrutschbanan i en laminarflödeshuva i 1–2 h i rumstemperatur.
- Tillsätt 400 μl av blockeringsbufferten som medföljer satsen i varje brunn i den monterade glasbilden. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Centrifugera de beredda proverna i 5 min vid 9 000 x g för att avlägsna fällningar eller partiklar. Späd 5x med blockerande buffert.
- Ta bort blockeringsbufferten från varje brunn. Tillsätt 400 μl av de utspädda proverna i lämpliga brunnar. Inkubera för 2 h i rumstemperatur medan gunga.
- Dekantera proverna från varje brunn. Tvätta 3x med 800 μL av 1x tvättbuffert en jag försåg satsen vid rumstemperatur i 5 min vardera medan gunga.
- I en ren behållare, doppa den monterade glasbilden i 1x tvättbuffert I. Tvätta 2x vid rumstemperatur i 5 min vardera medan gunga.
- Tillsätt 400 μl 1x Cy3-konjugerat streptavidin i varje undermatris. Täck med tejpade plastremsor. Skydda mot ljus för resten av protokollet.
- Inkubera för 2 h i rumstemperatur medan gunga.
- Dekantera lösningen och demontera glasrutschbanan från provkamrarna.
- I 30 ml centrifugröret medföljer satsen, tillsätt försiktigt glasbilden och tillräckligt med 1x tvättbuffert I för att täcka glasbilden. Tvätta 3x i 10 min vardera i rumstemperatur medan gunga.
- I 30 ml centrifugröret, tvätta 2x med 1x tvättbuffert II i 5 min vardera i rumstemperatur medan gunga.
- Tvätta glasrutschbanan med 30 ml ddH2O i 5 min. Ta bort glasrutschbanan från centrifugröret och låt torka i 20 min i en laminarflödeshuva. Den beredda glasrutschbanan kan förvaras vid -20 °C tills den är klar att skannas.
- Skanna glasbilden med en mikroarrayskanner vid ett fluorescensutsläpp på 555 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När neutrofiler läggs till i biopartikelmikroarrayen aktiveras neutrofiler som kontaktar biopartikelklustren och initierar svärmande svar. Biopartikelmikroarrayen validerades med tidsförfall fluorescerande mikroskopi för att spåra neutrofilmig migration mot biopartikelkluster (Video S1). Migreringen av enskilda neutrofilkärnor spåras när de migrerar mot biopartikelklustret. När neutrofiler når biopartikelklustret överlappar deras kärnor med andra kärnor i klustret. Det är således inte möjligt att korrekt spåra en neutrofil i klustret med den här metoden. Zymosan och E. coli biopartikelkluster resulterar båda i generering en neutrofil svärmar. För våra resultat använder figur 2B data från neutrofilsvärmar som genereras av E. coli partiklar. Figur 3 och de andra panelerna i figur 2 använder neutrofilsvärmar som genereras av zymosanpartiklar. De erhållna resultaten visar att biopartikelkluster stimulerar neutrofilaktivering när en neutrofil kontaktade klustret, vilket i slutändan ledde till bildandet av stabila neutrofilsvärmar runt varje kluster efter 30–60 min (figur 2A, överst). Däremot visade neutrofiler inte kollektiv migration i avsaknad av biopartikelkluster(figur 2A,botten och Video S2). Med hjälp av fluorescerande intensitet en färgade neutrofilkärnor vid 405 nm konstaterades den genomsnittliga neutrofilsvärmstorleken runt 30 μm diameter E. coli biopartikelkluster vara 1 490 ± 680 μm2 (medelvärde ± SD, figur 2B, överst). Fluorescensintensiteten i en viss intresseregion där det inte finns några biopartikelkluster var ungefär konstant över tiden, vilket bekräftade avsaknaden av kollektiv migrering i denna inställning(figur 2B,botten). Spår av neutrofil migration visar att neutrofiler konvergerade på en biopartikel kluster när man var närvarande (Figur 2C, topp). Omvänt observerades ingen konvergens i kontrollsystemet(figur 2C,botten). Hastigheten (tillryggalagd sträcka/tid) av svärmande och icke-aktiverade neutrofiler mättes och en statistiskt signifikant skillnad i hastighetsfördelningarna hittades (ANOVA, p < 0,0001), vilket visas i figur 2D. Medelhastigheten för svärmaneutrofiler var 20,6 ± 13,0 μm/min (medelvärde ± SD) och medelhastigheten för kontrollneutrofiler var 2,0 ± 2,2 μm/min.
Dessutom analyserades koncentrationen av 16 proteiner som neutrofiler som frigjordes under svärmande (figur 3). Den normaliserade koncentrationen av varje protein vid olika tidpunkter i svärmaprocessen (t = 0, 0,5, 1 och 3 h) beräknades, där den normaliserade koncentrationen är (C – Cmin) / (Cmax – Cmin). 10 proteiner ökade i koncentration under hela svärmande. Dessa proteiner var adipsin, galectin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 och TLR2. Två proteiner (pentraxin 3 och RANG) minskade i koncentration under hela svärmande. De återstående fyra proteinerna (clusterin, PF4, RANTES och Trappin-2) ökade under den första timmars svärmande men minskade därefter. Med andra ord, koncentrationerna av dessa proteiner "spetsade" under svärmande. Av de 16 proteiner som identifierats identifierades 12 proteiner i vår tidigare publikation5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 och TLR2 visade sig vara svärmande-specifika, medan clusterin, IL-6R, MMP-8, och MMP-9, RANG och trappin-2 var inte5.
Figur 1: Produktion av biopartikelmikroarray. En kisel wafer belagd med negativ photoresist utsätts för UV-ljus genom en krom fotomask (A). När kiselrånet har bakats och utvecklats finns ett fotoresistmönster kvar på kiselrånets yta. Detta är befälhavaren wafer (B). I en Petri maträtt, en PDMS blandning tillsätts till toppen av befälhavaren wafer. PDMS botas över natten vid 65 °C för att bilda PDMS mögel (C). PDMS mögel skärs från befälhavaren wafer och en biopsi punch används för att slå ut enskilda PDMS frimärken(D). En PDMS stämpel (E) är belagd med CP-lösning (F). Stämpeln är inverterad på ett tunt lager av CP-lösning (G). Efter inkubering i CP-lösningen för 1 h, stämpeln är blottad på en glasbild för att ta bort överflödig CP. Åtta frimärken trycks sedan på en ren glasbild med en 5,6 ± 0,1 g vikt, i linje med en bilddistans(H). När stämpeln tas bort kvarstår ett CP-mönster (I). En PDMS platta med försnittbrunnar följs glasbilden (J). Sedan läggs en biopartikellösning till över CP-mönstret (K). De negativt laddade biopartiklarna binder till den positivt laddade polyelektrolyten via elektrostatisk interaktion. Den överskottsbiopartikellösning tvättas bort, vilket gör att biopartiklar na mönstras ovanpå CP-mönstret (L). (M)Fluorescerande bild av cp-skiktet märkt med FITC (Skala stänger = 50 μm, stor bild; Skalstång = 25 μm, inset). (N) Fluorescerande bild av mönstrade zymosan biopartiklar konjugerat med Texas Red (Skala bar = 100 μm, stor bild; Skalstång = 50 μm, inset). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Neutrofil svärm tillväxt kring biopartikelkluster. I närvaro av biopartikelkluster genomgår neutrofiler kollektiv migrering mot biopartikelhoparna (botten,kontroll neutrofiler). När inga biopartiklar finns utför neutrofiler inte kollektiv migration. (A)I närvaro av zymosan biopartikelkluster bildar neutrofiler svärmar i 30 min. Utan biopartikelkluster bildar inga svärmar (Skala stänger = 50 μm). (B)Neutrofilsvärmar växer till en genomsnittlig storlek på 1 490 ± 680 μm2 (medelvärde ± SD) cirka 30 μm diameter E. koli biopartikelkluster. Kontroll neutrofiler uppvisar en konstant densitet som motsvarar ingen svärm tillväxt (ANOVA, p < 0.0001, n = 32 neutrofil svärmar, N = 1 givare, felstaplar = standardavvikelse). (C)Spår av svärmaneutrofiler konvergerar på zymosan biopartikelkluster, medan kontroll neutrofiler inte visar någon konvergerande punkt (Skala barer = 50 μm). D)Neutrofiler som svärmar mot ett zymosanmål har en medelhastighet på 20,6 ± 13,0 μm/min (medelvärde ± SD), medan manöverneutrofiler har en medelhastighet på 2,0 ± 2,2 μm/min. Varje räkning på värmekartan representerar en neutrofil med den givna momentana hastigheten vid den givna tidpunkten. Dessa värmekartor är representativa för ett experiment (n = 1 svärm; N = 1 givare; ANOVA, 6 114 = svärmaneutrofiler, 32 116 = kontroll neutrofiler, p < 0.0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Fria medlare släpptes av svärmar neutrofiler. Neutrofilsvärmning påverkar produktionen av olika proteiner över tiden. Proteinkoncentrationen mättes vid 0, 0,5, 1 och 3 h. Datapunkterna var utrustade med utjämningsplines (λ = 0,05). Dessa proteiner tenderar att följa en av tre karakteristiska trender: minskar med tiden, ökar med tiden, eller spikning runt 1 h och sedan minska (Felstaplar = standardavvikelse; n = 3 replikat; N = 1 givare). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video S1: Neutrophil svärmar mot zymosan biopartikelkluster. Neutrofilkärnor visas i blått. Zymosan mål är märkta med röda cirklar (Skala bommar = 50 μm; originalförvärvtid = 60 min). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video S2: Icke-aktiverad neutrofil slumpmässig migration. Neutrofilkärnor visas i blått (Skala bommar = 50 μm; originalförvärvstid = 60 min). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade en mikrostämplingsplattform för att generera enhetliga matriser av biopartiklar för att stimulera in vitro neutrophil swarming. In vitro karaktär vår plattform tillåter oss att kringgå de komplikationer som uppstår med in vivo sväring experiment, nämligen den dåliga förmågan att analysera medlare som släppts av svärmar neutrofiler5. Dessutom utförs in vivo-modeller vanligtvis hos gnagare11,12,13,15,22,23eller zebrafiskar11,12,15,23. Vår plattform använder mänskliga neutrofiler, vilket gör det möjligt för oss att mer direkt tolka våra resultat i samband med mänskliga sjukdomar, även om vissa likheter mellan mus och mänskliga neutrofiler har observerats5,11. Dessutom upprätthåller vi en rumsligt kontrollerad svärmande miljö som skiljer vår plattform från in vivo-modeller genom att ge en hög reproducerbarhetsnivå som underlättar analysen av mänsklig neutrofil kollektiv migration samt insamling och analys av medlare som frigörs av svärmande neutrofiler.
Under utvecklingen av vårt mikrostämplingsprotokoll uppstod flera utmaningar som krävde noggrann felsökning. Först är den CP som används för mikrostämpling mycket hydrofila, och PDMS frimärken är hydrofoba. Eftersom CP inte har en hög affinitet för PDMS, var vårt förfarande noggrant utformad för att undvika bildandet av bubblor och främja vätning. Genom att först priming stämpeln med CP medan face-up (steg 1,8), minimerar vi bildandet av bubblor mellan CP och stämpeln. Stämpeln inverteras sedan på ett lager AV CP och ruvade för 1 h. Denna långa inkubationstid säkerställer att varje del av stämpeln är fuktad. För det andra kan processen för att ta bort överflödig CP innan stämpling på en ren glasbild (steg 1.11) vara inkonsekvent. När stämpeln utför steg 1.11 måste den noggrant undersökas. När mönstret börjar bli synligt är stämpeln klar för steg 1.12. Dessutom kan den vakuumtid som krävs för att torka frimärkena (steg 1.12) variera. Detta är främst beroende av vädret. På en varm, fuktig dag krävs 2 minuters vakuumtid. På en sval, torr dag räcker 1 min vakuumtid.
Vi har visat att neutrofiler från friska donatorer bildar stabila svärmar runt biopartikelkluster. Med timelapse fluorescerande mikroskopi kan vi kvantifiera svärmstorlek och spåra neutrofilmigration, vilket gör det möjligt för oss att analysera neutrofil chemotaxis kvantitativt5. Till exempel Vi har tidigare visat att denna plattform kan användas för att beräkna chemotactic index (CI, cosinus i vinkeln mellan neutrofil hastighet vektor och position vektor mellan neutrofil och närmaste biopartikel kluster), hastighet (avstånd neutrofil resor dividerat med tiden), radiell hastighet (hastigheten multipliceras med CI), och det totala avståndet reste (skillnaden mellan inledande och slutlig neutrofil position) av enskilda migrerande neutrofiler5. Till skillnad från de flesta in vitro-studier24,25,26, vår plattform har inte en konstgjord cellotaktisk gradient, så neutrophil intercellulära kommunikation är den enda drivkraften för neutrofil migration. Dessutom är den supernatant som genereras av svärmande neutrofiler lättillgänglig. Vi kan samla in och analysera supernatant för intercellulära medlare som frigörs av neutrofiler utan störningar från andra celltyper som finns in vivo. 16 proteiner observerades vars uttryck under svärmande kunde beskrivas som en av tre trender: ökning (10 proteiner), minskning (två proteiner) och spik (fyra proteiner). Sex av dessa proteiner bekräftade tidigare rapporterade trender under svärma nde över tid5. Några av de identifierade proteinerna har tidigare visat sig vara svärmande specifika, medan andra uttrycktes differentierade av aktiverade icke-svärmande neutrofiler5. Proteiner som ökar i koncentration över tiden är sannolikt förknippade med pro-inflammation svar. Några av de proteiner som ökar i koncentration över tiden är redan kända för att vara inblandade i proinflammatoriska svar (t.ex. galectin-3 och MMP-9)27,28. Förhållandet mellan andra proteiner och inflammation är mindre välförstått. De proteiner som spikar eller minskar under svärmande kan vara inblandade i regleringen av inflammation. Emellertid, ytterligare forskning är nödvändig för att förstå rollen i inflammation i många av de proteiner som är differentially uttryckt under svärma. Analysera släppta medlare tillsammans med neutrofil migration kan hjälpa oss att bättre förstå den komplexa bilden av inflammation och hur neutrofiler påverkar den omgivande vävnaden under svärmande.
I framtida studier kan vår plattform användas för att noggrant studera förmågan hos ohälsosamma neutrofiler att generera stabila svärmar runt mönstrade biopartikelkluster. Olika medicinska tillstånd har varit relaterade till neutrofiler, inklusive sepsis3, trauma6, och cancer1,8,17,18, vilket tyder på neutrofiler hos dessa patienter kan ha förändrat funktionen. Denna plattform kan användas för att undersöka skillnader mellan intercellulära medlare som frigörs av friska och ohälsosamma neutrofiler. Dessutom kan denna plattform ändras för att mönster levande mikrober och används för att analysera neutrofil svar på levande mikrober in vitro.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en ny plattform för att analysera neutrofil svärma in vitro. Den mycket kontrollerade karaktären hos vår plattform gör det möjligt för oss att mildra frågor som uppstår under in vivo neutrophil swarming experiment. Neutrofil svärmar på en biopartikelmikroarray kan lätt kvantifieras via time-lapse fluorescerande mikroskopi. Dessutom kan vi samla in de medlare som frigörs av neutrofiler utan inblandning av andra vävnader som finns in vivo. Denna plattform kan användas i framtida forskning för att kvantifiera skillnader mellan migration beteenden neutrofiler från friska och ohälsosamma givare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från William G. Lowrie Institutionen för kemi och biomolekylär teknik och Comprehensive Cancer Center vid Ohio State University. Data som presenteras i denna rapport kom från bilder som bearbetas med Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) som finns på Campus Microscopy och Imaging Facility, Ohio State University. Denna anläggning stöds delvis av grant P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software - Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
