Summary
Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.
Abstract
Neutrofiele zwermen is een coöperatief proces waarbij neutrofielen verzegelen van een site van infectie en het bevorderen van weefsel reorganisatie. Zwermen is klassiek in vivo bestudeerd in diermodellen die karakteristieke patronen van celmigratie vertonen. Echter, in vivo modellen hebben verschillende beperkingen, waaronder intercellulaire bemiddelaars die moeilijk toegankelijk en te analyseren, evenals het onvermogen om direct te analyseren menselijke neutrofielen. Vanwege deze beperkingen is er behoefte aan een in vitro platform dat zwermen met menselijke neutrofielen bestudeert en gemakkelijke toegang biedt tot de moleculaire signalen die tijdens zwermen worden gegenereerd. Hier wordt een multistep microstempelingsproces gebruikt om een biodeeltjesmicroarray te genereren die zwermen stimuleert door een in vivo infectie na te bootsen. De biodeeltjesmicroarray veroorzaakt neutrofielen om op een gecontroleerde en stabiele manier te zwermen. Op de microarray nemen neutrofielen toe in snelheid en vormen stabiele zwermen rond biodeeltjesclusters. Bovendien werd supernatant gegenereerd door de neutrofielen geanalyseerd en 16 eiwitten werden ontdekt te zijn differentieel uitgedrukt in de loop van zwermen. Dit in vitro zwermplatform faciliteert directe analyse van neutrofiele migratie en eiwitafgifte op een reproduceerbare, ruimtelijk gecontroleerde manier.
Introduction
Neutrofielen, de meest voorkomende witte bloedcellen in de bloedbaan1, krijgen aandacht als potentiële diagnostische en therapeutische doelen2,3 omdat ze betrokken kunnen zijn bij een verscheidenheid van medische aandoeningen, waaronder jicht4, sepsis3, trauma5,6, kanker1,7,8, en diverse auto-immuunziekten5,9. Neutrofiele zwermen is een meertraps, strak gereguleerd proces met een complexiteit die het een bijzonder interessante focus van studie5,10,11maakt. Tijdens zwermen isoleren neutrofielen een ontstekingsplaats van het omringende gezonde weefsel5,10,11. Een goede regulering van neutrofiele zwermen is essentieel om wondgenezing en uiteindelijk ontstekingsresolutie5,12te bevorderen. Neutrofiele zwermen is voornamelijk onderzocht in vivo in knaagdier12,13,14,15 en zebravissen10,11,12,15 modellen. De aard van deze in vivo diermodellen leidt echter tot beperkingen5. Bijvoorbeeld, de bemiddelaars vrijgegeven door neutrofielen tijdens zwermen zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor analyse5. Daarnaast zijn er veel potentiële bronnen voor een bepaalde bemiddelaar in vivo, dus een in vivo experiment moet een genetisch tekort introduceren om cellulaire productie en/of interactie te remmen om de rol van die bemiddelaar in een bepaald proces te onderzoeken13. Een in vitro experiment omzeilt deze complicatie door neutrofiele observatie mogelijk te maken zonder de context van extra cellen. Bovendien is het onderzoek naar menselijke neutrofiele gecoördineerde migratie beperkt16. Op een in vitro zwermen platform, kunnen menselijke neutrofielen direct worden geanalyseerd. Een in vitro zwermen platform zou kunnen uitbreiden op de kennis opgedaan uit in vivo studies door het verstrekken van mogelijkheden om de lacunes achtergelaten door de beperkingen van in vivo studies op te vullen.
Om tegemoet te komen aan de behoefte aan een in vitro platform dat in vivo neutrofiele zwermen nabootst, ontwikkelden we een microstempelplatform dat ons in staat stelt om biodeeltjesmicroarrays te patronen die neutrofiele zwermen op een ruimtelijk gecontroleerde manier stimuleren. We genereren biodeeltjesmicroarrays op glasplaten in een proces in twee stappen. Ten eerste gebruiken we microstempeling om een microarray van kationische polyelektrolyt (CP) vlekken te genereren. Ten tweede voegen we een oplossing toe van biodeeltjes die zich via elektrostatische interactie aan de CP-vlekken hechten. Door eerst de CP-laag te patroon, kunnen we selectief negatief geladen biodeeltjes patroon om het gewenste neutrofiele zwermpatroon te genereren. De positief geladen laag houdt de negatief geladen biodeeltjes vast door de krachtige wasstap die de biodeeltjes verwijdert uit de gebieden op de glasplaat die de CP niet hebben. Bovendien is de HIER gebruikte CP, een copolymeer van acrylamide en quaternized cationic monomeer, biocompatibel, dus het induceert geen reactie van de neutrofielen. Het heeft een zeer hoge oppervlaktelading die de micron-sized biodeeltjes aan de glasdia immobiliseert, waarbij neutrophils worden geremd van het verwijderen van de deeltjes uit de patroonpositie op de glasdia. Dit resulteert in biodeeltjesclusters die in een microarray worden gerangschikt. Toen we neutrofielen aan de microarray toevoegden, vormden ze stabiele zwermen rond de biodeeltjesclusters. Door het volgen van neutrofiele migratie, vonden we dat zwermen neutrofielen actief migreren naar de biodeeltjes clusters. Bovendien gebruikten we dit platform om bepaalde bemiddelaars te analyseren die neutrofielen loslaten tijdens zwermen. We vonden 16 bemiddelaars die differentieel worden uitgedrukt tijdens zwermen. Hun concentraties volgen drie algemene trends in de tijd: verhogen, dalen of pieken. Ons in vitro neutrofiele zwermplatform faciliteert de analyse van ruimtelijk gecontroleerde menselijke neutrofiele zwermen, evenals de verzameling en analyse van bemiddelaars die vrijkomen door neutrofiele zwermen. In een eerdere publicatie toonden we aan dat patiënten met bepaalde medische aandoeningen (trauma, auto-immuunziekte en sepsis) neutrofielen hadden die anders functioneerden dan die van gezonde donoren5. In toekomstige onderzoeken kan ons platform worden gebruikt om de neutrofiele functie bij verschillende patiëntenpopulaties te analyseren. Dit platform kan kwantitatief analyseren van de complexe coördinatie die betrokken zijn bij neutrofiele zwermen. Aanvullende studies kunnen worden gedaan om inzicht te geven in de neutrofiele functie van een specifieke patiëntenpopulatie of neutrofiele reactie op een ziekteverwekker van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De auteurs erkennen de gezonde vrijwilligers die vriendelijk hun bloed schonken. Bloedspecimens werden verkregen na geïnformeerde vrijwillige toestemming volgens institutionele review board (IRB) protocol #2018H0268 beoordeeld door de Biomedical Sciences Committee aan de Ohio State University.
1. Microfabricage van microarray van biodeeltjes
- Met behulp van standaard fotolithografie procedures, het genereren van de master silicium wafer.
- Genereer een bewijs van het gewenste ontwerp met behulp van een computer-aided design (CAD) software, dan sturen naar een fotomasker fabrikant om een chromen fotomasker te produceren. Het ontwerp dat hier wordt gebruikt is 4 mm x 4 mm rechthoekige arrays met een diameter van 30 μm gevuld in cirkels met een afstand van 150 μm van centrum tot midden. Dit ontwerp kan naar wens worden aangepast voor verschillende toepassingen.
- Spincoat een 40 μm dikke laag van een negatieve fotoresist op een silicium wafer. Bak wafer op 65 °C gedurende 5 min en 95 °C gedurende 10 min.
- Stel wafer bloot aan UV-licht door middel van een chromen fotomasker met 150-160 mJ/cm2 (Figuur 1A).
- Bak wafer op 65 °C gedurende 5 min en 95 °C gedurende 10 min. Dompel wafer onder in fotoresist ontwikkelaar gedurende 10 min en spoel af met isopropylalcohol. In dit stadium moet het patroon zichtbaar zijn op de wafer (figuur 1B).
- Meng een 10:1-verhouding van polydimethylsiloxaanprepolymeer en het uithardingsmiddel (d.w.z. 20 g prepolymeer en 2 g uithardingsmiddel) grondig en giet het niet-genezende polydimethylsiloxanemengsel (PDMS) over de hoofdwafer in een petrischaaltje(figuur 1C).
- Vacuüm behandelen de onuitgeharde PDMS mengsel totdat er geen luchtbellen aanwezig zijn over de master wafer. Kuur 's nachts bij 65 °C.
- Gebruik een scalpel om te snijden rond de buitenkant van de patroon sectie van de wafer, en langzaam verwijderen van de genezen PDMS plaat. Plaats de PDMS-plaat op een schone snijplank met de naar boven gerichte patroonzijde(figuur 1D).
- Punch uit individuele stempels van de PDMS plaat met een 8 mm biopsie punch(Figuur 1E). Voor één glazen glijbaan zijn acht stempels nodig.
- Plaats elke stempel naar beneden op de plakband om vuil te verwijderen.
- Bereid vooraf een 1,6 mg/mL oplossing van CP in water.
- Voeg de juiste hoeveelheid van het CP-poeder toe aan water (bijvoorbeeld 0,8 g tot 500 mL).
- Meng op een roerplaat op kamertemperatuur 's nachts, of totdat alle vaste stof is opgelost in het water. De CP-oplossing kan 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Maak deCP-oplossing indien gewenst fluorescerend door poly-L-lysine toe te voegen met fluoresceine isothiocyanaat (PLL-FITC).
- Aliquot ongeveer 10 mL van de CP-oplossing. Voeg een kleine hoeveelheid PLL-FITC (0,05 mg) toe aan het aliquoted volume. De hoeveelheid kan worden gewijzigd om de helderheid van fluorescentie naar wens aan te passen.
- Vortex de CP-oplossing gelabeld met FITC voor 20 s, of totdat de oplossing is een uniforme, lichtgele kleur. Bescherm tegen licht en bewaar tot 1 maand bij 4 °C.
- Met de stempels face-up, priem elke stempel met 100 μL van 1,6 mg/mL oplossing van CP, ervoor te zorgen geen luchtbellen vormen tussen de CP-oplossing en de stempel (Figuur 1F).
- Keer de stempels om op een laag CP-oplossing(figuur 1G).
- Verwijder de stempels na 1 uur uit de CP-oplossing.
- Dep elke natte stempel naar beneden op een schone glazen schuif 6-8x om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Vacuüm behandel de postzegels gedurende 1-2 min.
- Hecht een acht put, 9 mm diameter imaging spacer op de top van een schone glazen glijbaan als een gids voor stempel plaatsing. Met deze spacer kan elke glazen schuif acht microarrays hebben.
- Plaats een stempel naar beneden op de glazen glijbaan in het midden van elke put van de imaging spacer (dat wil zeggen, gebruik acht stempels in totaal).
- Leg een evenwichtig gewicht van 5,6 ± 0,1 g op elke stempel en laat 10 min toe voor het stempelen (figuur 1H). Een evenwichtig gewicht is nodig om ervoor te zorgen dat de stempel gelijkmatig op de glazen schuif wordt gedrukt en zelfs de overdracht van de CP naar de glazen schuif bevordert.
- Verwijder de gewichten en stempels van de glazen plaat(figuur 1I). Laat de CP-laag 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat u de biodeeltjes toevoegt, zoals beschreven in stap 1.17. Als de CP is gelabeld met FITC, kan de effectiviteit van het stempelen op dit punt worden gecontroleerd met een fluorescerende microscoop op 488 nm voordat u verdergaat naar stap 1.17 (figuur 1M).
- Snijd een lege PDMS-plaat op de grootte van de beeldafstandsruimter en gebruik de 8 mm biopsiepunch om putten te maken in de PDMS die aansluiten bij de putten van een beeldafstandsruimte. Plak de PDMS-plaat aan de glazen schuif met de beeldafstandsruimte (figuur 1J).
- Ontdooi een oplossing van biodeeltjes (bijvoorbeeld E. coli of zymosan) en verdun tot 500 μg/mL in water voor injectie (WFI).
OPMERKING: De biodeeltjes hoeven niet te worden geopsoniseerd. Neutrofiele oppervlaktereceptoren herkennen moleculen op deze biodeeltjes19,20,21. - Voeg 100 μL biodeeltjesoplossing toe aan elke PDMS goed op de glasplaat(figuur 1K).
- Rock de glazen glijbaan voor 30 min.
- Spoel de putten grondig af met water. De microarray van het biodeeltjes kan maximaal 3 maanden in een stofvrije omgeving bij 4 °C worden opgeslagen. Op dit punt moet het patroon worden gecontroleerd met een fluorescerende microscoop op 594 nm voordat het overgaat tot stap 2.1 (figuur 1N).
2. Monstervoorbereiding
- Verzamel ten minste 2 mL vers bloed in K2-EDTA buizen van de gewenste donor. De verwachte opbrengst van neutrofielen is 1-2 x 106 cellen/1 mL volbloed. De beeldtest vereist ongeveer 1,5 x 105 neutrofielen, en de analyse van de supernatant vereist 1 x 106 neutrofielen. Gebruik het bloed binnen 4 uur.
- Scheid rode bloedcellen (RBC's) door het toevoegen van een erythrocyte aggregatie middel in een 1:5 verhouding aan het hele bloed. Wacht 45 min op een doorschijnende laag (buffy coat) om te scheiden van de laag RBC's.
- Verwijder de buffy jas en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van 1 mL buffy jas: 9 mL PBS.
- Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.
- Aanzuigen van de supernatant en resuspend de pellet op 5 x 107 cellen / mL.
- Gebruik een negatieve immunomagnetische selectiekit om neutrofielen te isoleren.
- Voeg 50 μL antilichaamcocktail/1 mL celvering toe. Wacht 10 min.
- Voeg 100 μL magnetische kralen/1 mL celvering toe. Wacht 10 min.
- Voeg celvering toe aan een ronde bodembuis en plaats in een cilindrische magneet. Wacht 10 min.
- Giet supernatant in een centrifugebuis. Voeg tot 10 mL PBS toe. Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.
- Aspirate supernatant. Resuspend witte pellet in IMDM met 0,4% menselijk serum albumine.
- Vlekkernen met 20 μg/mL Hoechst 33342 gedurende 10 min bij 37 °C.
- Voeg 5 mL IMDM toe met 0,4% menselijk serumalbumine om te spoelen. Centrifugevoor 5 min bij 190 x g en 20 °C.
- Cellen opnieuw opteschorten op 7,5 x 105 cellen/mL in IMDM met 0,4% menselijk serumalbumine.
- Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan een PDMS-put die een biodeeltjesmicroarray bevat. Zorg ervoor dat de celvering goed over de bovenkant van de PDMS zit en geen bellen bevat.
- Sluit af met een afdekslip met een diameter van 12 mm. Bedek de opening van de PDMS goed met een coverslip met een diameter van 12 mm. Druk voorzichtig op de coverslip met een pincet, zodat de overtollige celvering ontsnapt naar de rand van de put. Gebruik een weefsel om de overtollige celsuspensie te verwijderen.
3. Het uitvoeren van de test- en beeldanalyse
- Laad microdeeltjes array met cellen op de levende cel imaging station met een microscoop uitgerust met een kooi incubator ingesteld op 37 °C, 5% CO2,en 90% relatieve vochtigheid.
- Gebruik time-lapse fluorescerende en brightfield microscopie om beelden op te nemen bij 10x vergroting om de 10 s op 405 nm, 594 nm en brightfield. In een typisch experiment worden beelden verzameld tot 2 uur.
- Gebruik een geautomatiseerde celtrackingsoftware om de migratie van individuele neutrofielen naar de biodeeltjescluster bij te houden.
- Gebruik de automatische regressiemodus van een software voor het bijhouden van spotdetectiecellen. Stel de straal van de spot in op 5 μm (de geschatte grootte van een neutrofiele kern). Stel de minimale spoorlengte in op 120 s en een maximale tussenruimtegrootte van één frame.
- Uit de gegevens gegenereerd door de cel tracking software, extraheren van de bestanden die de neutrofiele positie en snelheid bevatten. Deze bestanden kunnen worden gebruikt met een grafieksoftware om respectievelijk neutrofiele migratiesporen(figuur 2C)en een warmtekaart van snelheid versus tijd(figuur 2D)te genereren.
- Gebruik de 405 nm fluorescerende beelden om zwermgrootte na verloop van tijd bij te houden op een beeldanalysesoftware van uw keuze.
- Definieer gebieden van belang (ROI's) rond elke biodeeltjescluster waar neutrofielen zullen zwermen. Houd de ROI van dezelfde grootte om elke biodeeltjescluster te analyseren.
- Analyseer de gemiddelde fluorescerende intensiteit van de 405 nm beelden binnen elke ROI in de tijd.
- Genereer een kalibratiecurve van gemiddelde fluorescerende intensiteit tot zwermgrootte door handmatige metingen te doen bij verschillende zwermmaten van 0 μm2 tot de maximale zwermgrootte. Gebruik deze kalibratie om de zwermgrootte in de loop van de tijd te berekenen.
4. Supernatant inzameling en eiwitdetectie
- Incubeer de neutrofielen in de putten die de biodeeltjesmicroarray bevatten bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 uur. Neem monsters op de gewenste tijdspunten. Meestal worden monsters genomen op 0, 0,5, 1 en 3 uur. Om de detectiegrens van de test van de eiwitarray te overwinnen, werd het volledige volume van supernatant van één enkele put (200 μL) gebruikt voor elk tijdspunt. Elk tijdpunt werd geanalyseerd in drievoud.
- Controleer met behulp van een brightfield microscoop of zwermen worden gevormd op de microarray.
- Aanzuigen van de supernatant met een 200 μL pipet en belasting in een 0,45 μm centrifuge filterbuis.
- Centrifugeer de supernatant bij 190 x g en 20 °C gedurende 5 min en verzamel het gefiltreerd volume.
- Bewaar monsters bij -80 °C tot de verwerkingstijd.
- Gebruik een microarray kit die een reeks menselijke eiwitten detecteert om monsters te verwerken.
- Voeg 200 μL van elk monster toe aan een aparte dialysebuis die bij de kit is voorzien.
- Plaats de dialysebuizen in een beker met ten minste 500 mL PBS (pH = 8,0). Roer voorzichtig op een roerplaat gedurende ten minste 3 uur bij 4 °C. Verander de PBS in de beker en herhaal deze stap.
- Breng elk monster over op een schone centrifugebuis en centrifuge met 9.000 x g gedurende 5 min om eventuele neerslag te verwijderen. Breng elke supernatant over op een schone buis.
- Biotinylaat elk monster door toevoeging van 36 μL 1x etikettering reagens uit de kit per 1 mg van het totale eiwit in het gedialyseerde monster aan 180 μL van dialyzed monster. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min. Meng voorzichtig om de 5 min.
- Voeg 3 μL stopoplossing toe die met de kit in elke monsterbuis wordt geleverd. Breng elk monster over naar een verse dialysebuis en herhaal de stappen 4.6.2–4.6.3. In dit stadium kan het monster worden opgeslagen bij -20 °C of -80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan.
- De glazen schuif die bij de kit is voorzien, wordt opgeslagen bij -20 °C. Laat het op kamertemperatuur komen. Plaats de geassembleerde glazen schuif in een laminaire stroomkap voor 1-2 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 400 μL van de blokkeerbuffer bij de kit toe aan elke put van de geassembleerde glazen schuif. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Centrifugeer de bereide monsters gedurende 5 min bij 9.000 x g om neerslag of deeltjes te verwijderen. Verdun 5x met het blokkeren van buffer.
- Verwijder de blokkeringsbuffer uit elke put. Voeg 400 μL van de verdunde monsters toe aan de juiste putten. Incubeer voor 2 uur op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
- Decanteer de monsters van elke put. Was 3x met 800 μL van de 1x wasbuffer die ik bij kamertemperatuur heb voorzien gedurende 5 min tijdens het schommelen.
- Dompel in een schone container de geassembleerde glazen schuif onder in 1x wasbuffer I. Was 2x op kamertemperatuur gedurende 5 min tijdens het schommelen.
- Voeg 400 μL 1x Cy3-geconjugeerde streptavidin toe aan elke subarray. Dek af met plastic plakstrips. Bescherm tegen licht voor de rest van het protocol.
- Incubeer voor 2 uur op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
- Decanteer de oplossing en demonteer de glasplaat uit de monsterkamers.
- In de centrifugebuis van 30 mL die bij de kit is voorzien, moet u voorzichtig de glazen schuif en voldoende 1x wasbuffer I toevoegen om de glazen schuif te bedekken. Was 3x voor 10 min elk op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
- In de centrifugebuis van 30 mL was je 2x met 1x wasbuffer II gedurende 5 min bij kamertemperatuur tijdens het schommelen.
- Was de glazen schuif met 30 mL ddH2O gedurende 5 min. Verwijder de glazen schuif uit de centrifugebuis en laat 20 min drogen in een laminaire stroomkap. De voorbereide glazen schuif mag bij -20 °C worden bewaard tot ze klaar zijn om te scannen.
- Scan de glazen schuif met een microarray scanner bij een fluorescentieemissie van 555 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer neutrofielen worden toegevoegd aan de biodeeltjesmicroarray, worden neutrofielen die contact opnemen met de biodeeltjesclusters geactiveerd en initiëren ze de zwermende respons. De biodeeltjesmicroarray werd gevalideerd met behulp van time-lapse fluorescerende microscopie om neutrofiele migratie naar de biodeeltjesclusters te volgen(Video S1). De migratie van individuele neutrofiele kernen wordt bijgehouden wanneer ze migreren naar de biodeeltjescluster. Wanneer neutrofielen de biodeeltjescluster bereiken, overlappen hun kernen zich met andere kernen in de cluster. Het is dus niet mogelijk om een neutrofiel in het cluster nauwkeurig te volgen met behulp van deze methode. Zymosan en E. coli biodeeltjes clusters beide resulteren in de generatie van neutrofiele zwermen. Voor onze resultaten gebruikt figuur 2B gegevens van neutrofiele zwermen gegenereerd door E. coli-deeltjes. Figuur 3 en de andere panelen van figuur 2 gebruiken neutrofiele zwermen gegenereerd door zymosan deeltjes. De verkregen resultaten tonen aan dat biodeeltjesclusters neutrofiele activering stimuleren wanneer een neutrofiel contact opnam met de cluster, wat uiteindelijk leidde tot de vorming van stabiele neutrofiele zwermen rond elke cluster na 30-60 min (figuur 2A, top). Neutrofielen daarentegen toonden geen collectieve migratie bij afwezigheid van biodeeltjesclusters(figuur 2A, bodem en video S2). Met behulp van de fluorescerende intensiteit van gekleurde neutrofiele kernen op 405 nm, bleek de gemiddelde neutrofiele zwermgrootte rond 30 μm diameter E. coli biodeeltjesclusters 1.490 ± 680 μm2 (gemiddelde ± SD, figuur 2B, top) te zijn. De fluorescentieintensiteit van een bepaald gebied van belang waar geen biodeeltjesclusters aanwezig zijn, was in de loop van de tijd ongeveer constant, wat de afwezigheid van collectieve migratie in deze setting bevestigde(figuur 2B, bodem). Sporen van neutrofiele migratie tonen aan dat neutrofielen samenkwamen op een biodeeltjescluster toen er een aanwezig was(figuur 2C, top). Daarentegen werd geen convergentie waargenomen in het controlesysteem(figuur 2C, bodem). De snelheid (afgelegde afstand/tijd) van zwermende en niet-geactiveerde neutrofielen werd gemeten en er werd een statistisch significant verschil in de snelheidsverdelingen gevonden (ANOVA, p < 0,0001), zoals blijkt uit figuur 2D. De gemiddelde snelheid voor zwermende neutrofielen was 20,6 ± 13,0 μm/min (gemiddelde ± SD), en de gemiddelde snelheid voor de controle neutrofielen was 2,0 ± 2,2 μm/min.
Daarnaast werd de concentratie van 16 eiwitten geanalyseerd die neutrofielen vrijkwamen tijdens het zwermen (figuur 3). De genormaliseerde concentratie van elk eiwit op verschillende tijdpunten in het zwermproces (t = 0, 0,5, 1 en 3 uur) werd berekend, waar de genormaliseerde concentratie is (C – Cmin) / (Cmax – Cmin). 10 eiwitten verhoogd in concentratie tijdens zwermen. Deze eiwitten waren adipsin, galectin-3, GROa, IL-6R, MIP-1a, MMP-8, MMP-9, Nidogen-1, TIMP-1 en TLR2. Twee eiwitten (pentraxin 3 en RANK) daalden in concentratie tijdens het zwermen. De overige vier eiwitten (clusterine, PF4, RANTES en Trappin-2) namen toe tijdens het eerste uur van zwermen, maar daalden daarna. Met andere woorden, de concentraties van die eiwitten "spiked" tijdens zwermen. Van de 16 geïdentificeerde eiwitten werden 12 eiwitten geïdentificeerd in onze vorige publicatie5. Adipsin, galectin-3, nidogen-1, pentraxin 3, TIMP-1 en TLR2 bleken zwermspecifiek te zijn, terwijl clusterine, IL-6R, MMP-8 en MMP-9, RANK en trappin-2 niet5waren.
Figuur 1: Productie van biodeeltjesmicroarray. Een silicium wafer bekleed met negatieve fotoresist wordt blootgesteld aan UV-licht door middel van een chroom fotomasker (A). Nadat de siliciumwafer is gebakken en ontwikkeld, blijft er een fotoresist patroon over op het oppervlak van de siliciumwafer. Dit is de master wafer(B). In een petrischaaltje wordt een PDMS-mengsel toegevoegd aan de bovenkant van de masterwafer. De PDMS wordt 's nachts genezen bij 65 °C om de PDMS mal(C)te vormen. De PDMS mal is gesneden uit de master wafer en een biopsie punch wordt gebruikt om punch uit individuele PDMS stempels(D). Een PDMS-stempel(E)is bekleed met CP-oplossing(F). De stempel wordt omgekeerd op een dunne laag CP-oplossing(G). Na het uitbroeden van de CP-oplossing voor 1 uur wordt de stempel op een glazen schuif geveld om overtollige CP te verwijderen. Acht stempels worden vervolgens op een schone glazen schuif gedrukt met een gewicht van 5,6 ± 0,1 g, uitgelijnd met een beeldafstandsruimter(H). Wanneer de stempel wordt verwijderd, blijft een CP-patroon (I). Een PDMS plaat met voorgesneden putten wordt aan de glazen schuif(J)bevestigd. Vervolgens wordt een biodeeltjesoplossing toegevoegd over het CP-patroon(K). De negatief geladen biodeeltjes binden zich via elektrostatische interactie aan de positief geladen polyelektrolyt. De overtollige biodeeltjesoplossing wordt weggespoeld, waardoor biodeeltjes een patroon achterlaten d.m.v. het CP-patroon(L). (M) Fluorescerend beeld van de CP-laag met het label FITC (Schaalbalken = 50 μm, groot beeld; Schaalbalk = 25 μm, inset). (N) Fluorescerend beeld van patroon zymosan biodeeltjes vervoegd met Texas Red (Schaal bar = 100 μm, groot beeld; Schaalbalk = 50 μm, inset). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Neutrofiele zwermgroei rond biodeeltjesclusters. In aanwezigheid van biodeeltjesclusters ondergaan neutrofielen collectieve migratie naar de biodeeltjesclusters (bodem,controle neutrofielen). Wanneer er geen biodeeltjes aanwezig zijn, voeren de neutrofielen geen collectieve migratie uit. (A) In aanwezigheid van zymosan biodeeltjesclusters vormen neutrofielen zwermen in 30 min. Zonder biodeeltjesclusters vormen zich geen zwermen (Schaalstaven = 50 μm). (B) Neutrofiele zwermen groeien tot een gemiddelde grootte van 1.490 ± 680 μm2 (gemiddelde ± SD) rond 30 μm diameter E. coli biodeeltjesclusters. Controle neutrofielen vertonen een constante dichtheid die overeenkomt met geen zwerm groei (ANOVA, p < 0,0001, n = 32 neutrofiele zwermen, N = 1 donor, fout bars = standaarddeviatie). (C) Sporen van zwermende neutrofielen komen samen op de zymosan biodeeltjesclusters, terwijl controleneutrofielen geen convergerende punt vertonen (Schaalstaven = 50 μm). (D) Neutrofielen die naar een zymosan-doel zwermen, hebben een gemiddelde snelheid van 20,6 ± 13,0 μm/min (gemiddelde ± SD), terwijl controleneutrofielen een gemiddelde snelheid van 2,0 ± 2,2 μm/min hebben. Elke telling op de hittekaart vertegenwoordigt neutrophil met de bepaalde ogenblikkelijke snelheid op het bepaalde tijdspunt. Deze warmtekaarten zijn representatief voor één experiment (n = 1 zwerm; N = 1 donor; ANOVA, 6.114 = zwermende neutrofielen, 32.116 = controle neutrofielen, p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Gratis bemiddelaars vrijgelaten door zwermen neutrofielen. Neutrofiele zwermen beïnvloedt de productie van verschillende eiwitten na verloop van tijd. De eiwitconcentratie werd gemeten op 0, 0,5, 1 en 3 uur. De gegevenspunten waren voorzien van vloeiende splines (λ = 0,05). Deze eiwitten hebben de neiging om een van de drie karakteristieke trends te volgen: afnemenin de tijd, in de loop van de tijd toenemen, of stekeling rond 1 uur en vervolgens afnemen (Foutstaven = standaarddeviatie; n = 3 repliceert; N = 1 donor). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video S1: Neutrophil zwermt naar zymosan biodeeltjesclusters. Neutrofiele kernen worden in het blauw weergegeven. Zymosan doelen zijn gemarkeerd met rode cirkels (Schaalbalk = 50 μm; oorspronkelijke aanschaftijd = 60 min). Klik hier om deze video te downloaden.
Video S2: Niet-geactiveerde neutrofiele willekeurige migratie. Neutrofiele kernen worden in het blauw weergegeven (Schaalbalk = 50 μm; oorspronkelijke aanschaftijd = 60 min). Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een microstempelplatform om uniforme arrays van biodeeltjes te genereren om in vitro neutrofiele zwermen te stimuleren. De in vitro aard van ons platform stelt ons in staat om de complicaties die zich voordoen met in vivo zwermen experimenten te omzeilen, namelijk de slechte mogelijkheid om bemiddelaars vrijgegeven door zwermenneutrofielen te analyseren5. Bovendien worden in vivo modellen meestal uitgevoerd bij knaagdieren11,12,13,15,22,23, of zebravissen11,12,15,23. Ons platform maakt gebruik van menselijke neutrofielen, die ons in staat stelt om onze resultaten in de context van de menselijke ziekte directer te interpreteren, hoewel bepaalde overeenkomsten tussen muis en menselijke neutrofielen zijn waargenomen5,11. Daarnaast handhaven we een ruimtelijk gecontroleerde zwermomgeving die ons platform onderscheidt van in vivo modellen door een hoog niveau van reproduceerbaarheid te bieden dat de analyse van menselijke neutrofiele collectieve migratie vergemakkelijkt, evenals het verzamelen en analyseren van bemiddelaars die vrijkomen door zwermende neutrofielen.
Tijdens de ontwikkeling van ons microstempelingprotocol ontstonden verschillende uitdagingen die een zorgvuldige probleemoplossing vereisten. Ten eerste, de CP gebruikt voor de microstempeling is zeer hydrofiel, en de PDMS stempels zijn hydrofoob. Omdat de CP geen hoge affiniteit heeft met PDMS, is onze procedure zorgvuldig ontworpen om de vorming van bellen te voorkomen en bevochtiging te bevorderen. Door eerst de stempel met CP te priming terwijl je face-up hebt (stap 1.8), minimaliseren we de vorming van bellen tussen de CP en de stempel. De stempel wordt vervolgens omgekeerd op een laag CP en geïncubeerd voor 1 uur. Deze lange incubatietijd zorgt ervoor dat elk deel van de stempel nat wordt gemaakt. Ten tweede kan het proces van het verwijderen van overtollige CP voordat u op een schone glazen dia (stap 1.11) stempelt inconsistent zijn. Tijdens het uitvoeren van stap 1.11 moet de stempel zorgvuldig worden onderzocht. Wanneer het patroon zichtbaar begint te worden, is de stempel klaar voor stap 1.12. Bovendien kan de benodigde vacuümtijd om de stempels te drogen (stap 1.12) variëren. Dit is vooral afhankelijk van het weer. Op een warme, vochtige dag is 2 min vacuümtijd vereist. Op een koele, droge dag is 1 min vacuüm vacuüm voldoende.
We hebben aangetoond dat neutrofielen van gezonde donoren stabiele zwermen vormen rond biodeeltjesclusters. Met time-lapse fluorescerende microscopie kunnen we zwermgrootte kwantificeren en neutrofiele migratie volgen, waardoor we neutrofiele chemotaxis kwantitatief kunnen analyseren5. Zo hebben we eerder aangetoond dat dit platform kan worden gebruikt om de chemotactische index (CI, de cosine van de hoek tussen de neutrofiele snelheidsvector en de positievector tussen de neutrofiele en de dichtstbijzijnde biodeeltjescluster), snelheid (afstand die de neutrofiele reizen gedeeld door de tijd), radiale snelheid (de snelheid vermenigvuldigd met CI) en de totale afgelegde afstand (het verschil tussen de oorspronkelijke en laatste neutrofiele positie) van individuele migrerende neutrofielen reizen te berekenen5. In tegenstelling tot de meeste in vitro studies24,25,26, ons platform heeft geen kunstmatige chemotactische gradiënt, dus neutrofiele intercellulaire communicatie is de enige drijvende kracht van neutrofiele migratie. Bovendien is de supernatant gegenereerd door zwermende neutrofielen gemakkelijk toegankelijk. We kunnen het supernatant verzamelen en analyseren voor intercellulaire bemiddelaars die vrijkomen door neutrofielen zonder inmenging van andere celtypen die in vivo aanwezig zijn. 16 eiwitten werden waargenomen waarvan de expressie tijdens zwermen kan worden omschreven als een van de drie trends: toename (10 eiwitten), afname (twee eiwitten) en spike (vier eiwitten). Zes van deze eiwitten bevestigd eerder gemeldtrends tijdens zwermen in de tijd5. Sommige van de geïdentificeerde eiwitten bleken eerder zwermspecifiek te zijn, terwijl andere differentieel werden uitgedrukt door geactiveerde niet-zwermende neutrofielen5. Eiwitten die in de loop van de tijd in concentratie toenemen, worden waarschijnlijk geassocieerd met de pro-ontstekingsrespons. Van sommige eiwitten die in de loop van de tijd in concentratie toenemen, is al bekend dat ze betrokken zijn bij de ontstekingsreactie (bijvoorbeeld galectin-3 en MMP-9)27,28. De relatie tussen andere eiwitten en ontstekingis minder goed begrepen. De eiwitten die spike of verminderen tijdens het zwermen kan worden betrokken bij de regulering van ontsteking. Echter, verder onderzoek is noodzakelijk om de rol in ontsteking van veel van de eiwitten die differentieel worden uitgedrukt tijdens zwermen te begrijpen. Het analyseren van vrijgegeven bemiddelaars samen met neutrofiele migratie kan ons helpen het complexe beeld van ontsteking beter te begrijpen en hoe neutrofielen het omringende weefsel beïnvloeden tijdens het zwermen.
In toekomstige studies kan ons platform worden gebruikt om het vermogen van ongezonde neutrofielen grondig te bestuderen om stabiele zwermen rond biodeeltjesclusters met patroon te genereren. Verschillende medische aandoeningen zijn gerelateerd aan neutrofielen, waaronder sepsis3, trauma6, en kanker1,8,17,18, wat suggereert neutrofielen bij deze patiënten kunnen hebben veranderd functie. Dit platform kan worden gebruikt om verschillen tussen de intercellulaire bemiddelaars die door gezonde en ongezonde neutrofielen worden vrijgegeven te onderzoeken. Bovendien kan dit platform worden aangepast aan patroon levende microben en worden gebruikt om neutrofiele respons op levende microben in vitro te analyseren.
Tot slot hebben we een nieuw platform ontwikkeld voor het analyseren van neutrofiele zwermen in vitro. Het sterk gecontroleerde karakter van ons platform stelt ons in staat om problemen die zich voordoen tijdens in vivo neutrofiele zwermexperimenten te verzachten. Neutrofiele zwermen op een biodeeltjes microarray is gemakkelijk te kwantificeren via time-lapse fluorescerende microscopie. Bovendien kunnen we de bemiddelaars verzamelen die door de neutrofielen vrijkomen zonder de interferentie van andere weefsels die in vivo aanwezig zijn. Dit platform kan worden gebruikt in toekomstig onderzoek om verschillen tussen het migratiegedrag van neutrofielen van gezonde en ongezonde donoren te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering en het Comprehensive Cancer Center aan de Ohio State University. De gegevens die in dit rapport werden gepresenteerd, kwamen van beelden die zijn verwerkt met Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) die beschikbaar zijn op de Campus Microscopy and Imaging Facility, the Ohio State University. Deze faciliteit wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidie P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "The Big Easy" EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18001 | Magnet to use with neutrophil isolation kit |
| Cell Incubator | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolab cage incubator for temperature and CO2 control |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | Inverted research microscope |
| Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag® array |
| Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch | Sigma Aldrich | Z708925 | To cut PDMS stamps |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nucleus fluorescent stain |
| Human L1000 Array | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | High density array to detect 1000 human proteins |
| Human Serum Albumin (HSA) | Sigma Aldrich | A5843 | Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils |
| Iscove's Modified Dulbeccos' Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | To resuspend isolated neutrophils |
| K2-EDTA tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-657-32 | Tubes for blood collection |
| Low Reflective Chrome Photomask | Front Range Photomask | N/A | Dimensions 5" x 5" x 0.09" (L x W x D) |
| Microarray Scanner | Perkin Elmer | ASCNGX00 | Fluorescence reader of protein patterned microdomains |
| Microscopy Image Analsysis Software - Imaris | Bitplane | 9.3.0 | Software for automatic cell tracking analysis |
| NiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation |
| Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution |
| SecureSeal 8-well Imaging Spacer | Grace Bio-Labs | 654008 | 8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μm SSP test |
| Spin Coater | Laurell | WS-650MZ-23NPPB | Used to spincoat a 40-µm layer of photoresist onto silicon wafer |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | Negative photoresist to make silicon master wafer |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer |
| Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS) | Dow | 1673921 | 2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells |
| UV Exposure Masking System | Kloé | UV-KUB 2 | Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light |
| Water | Thermo Fisher Scientific | A1287303 | High quality water to dilute bioparticles |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms "inking solution" for microstamping when dissolved in water |
| Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array |
References
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
- Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
- Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
- Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
- Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
- Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L.
- Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
- Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
- Powell, D. R., Huttenlocher, A.
- Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
- Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
- Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
- Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
- Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
- Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
- Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
- Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
- Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M.
- Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).
