Sequencing lille ikke-kodning RNA fra formalin-fast væv og serum-afledte Exosomer fra Kastrations resistente prostata cancer patienter

Summary

Terapi resistens ofte udvikler hos patienter med fremskreden prostatakræft, og i nogle tilfælde, kræft udvikler sig til en dødelig subtype kaldet neuroendokrine prostatacancer. Vurdering af de små ikke-kodning RNA-medierede molekylære ændringer, der letter denne overgang vil give bedre sygdoms stratificering og identifikation af kausale mekanismer, der fører til udvikling af neuroendokrine prostatakræft.

Abstract

Ablation af Androgen receptor (AR) signalering af androgen berøvelse er målet for den første linje af terapi for prostatakræft, der i første omgang resulterer i kræft regression. Men i et betydeligt antal tilfælde, sygdommen udvikler sig til avanceret, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), som har begrænsede terapeutiske muligheder og er ofte aggressiv. Fjern metastaser observeres for det meste på dette stadium af den aggressive sygdom. CRPC behandles af en anden generation af AR-pathway hæmmere, der i første omgang forbedrer overlevelsen, efterfulgt af fremkomsten af terapi resistens. Neuroendokrine prostatacancer (NEPC) er en sjælden variant af prostatacancer (PCa), der ofte udvikler sig som et resultat af terapi resistens via en transdifferentierings proces kendt som neuroendokrine differentiering (NED), hvori PCa-celler gennemgår en Lineage switch fra adenocarcinomer og vise øget ekspression af neuroendokrine (NE) Lineage markører. Ud over de genomiske ændringer, der driver progression og Trans differentiering til NEPC, epigenetiske faktorer og mikromiljømæssige signaler betragtes som væsentlige aktører i at køre sygdomsprogression. Dette manuskript indeholder en detaljeret protokol til at identificere de epigenetiske drivere (dvs. små ikke-kodning RNAs), der er forbundet med Advanced PCa. Ved hjælp af renset microRNAs fra formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) metastatisk væv og tilsvarende serum-afledte ekstracellulære vesikler (EVs), protokollen beskriver, hvordan man forbereder biblioteker med passende kvalitetskontrol til sekvensering Miornas fra disse eksempel kilder. Isolerende RNA fra både FFPE og EVs er ofte udfordrende, fordi det meste af det er enten forringet eller er begrænset i mængde. Denne protokol vil uddybe forskellige metoder til optimering af RNA-indgange og cDNA-biblioteker for at give de mest specifikke læsninger og data af høj kvalitet ved sekvensering.

Introduction

Prostatakræft er drevet af androgener, der handler via AR signalering. Derfor, målretning af AR pathway er den grundpille behandling for sygdommen¹. Resistens opstår dog ofte som følge af målrettede terapier, og sygdommen udvikler sig til en avanceret metastatisk CRPC². CRPc behandles af anden generation af ar-terapi^{, der omfatter} enzalutamid og abirateronacetat^{2,3, som}i første omgang forbedrer overlevelsen. Men, dødelige varianter såsom NEPC opstår ofte i 25 − 30% af behandlede CRPC tilfælde, der har begrænsede behandlingsmuligheder, hvilket fører til øget dødelighed³. NEPC opstår via en reversibel transdifferentierings proces kendt som NED, hvori PCa-celler gennemgår en Lineage switch fra adenocarcinomer og viser nedsat ekspression af AR og øget ekspression af NE Lineage markører, herunder enolase 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA) og synaptophysin (SYP)⁴. I betragtning af at disse resistens varianter opstår som følge af terapeutiske indgreb, er det vigtigt at dechifrere veje, der fører til generering af denne dødbringende, svære at behandle form af PCa.

Genomforskning af NEPC blev for nylig dechiferet i en udtømmende undersøgelse udført af Beltran et al. hvorved kopier af nummerets ændringer, mutationer, enkelt nukleotidpolymorfier (SNPs) og DNA-methylering fra patient afledte metastatiske væv blev analyseret⁵. Trods betydelige fremskridt i forståelsen af genomforskning af denne aggressive form for PCa, er lidt kendt om de epigenetiske faktorer, herunder de små ikke-kodning RNAs (micrornas), der er involveret i overgangen af CRPc-adenocarcinoma til NEPC. MicroRNAs (miRNAs) er 22 BP lang, dobbeltstrenget RNAs, der handler primært ved at undertrykke genekspression post-transkriptivt af sekvens-specifikke interaktioner med de 3 ‘-ikke-oversatte regioner (UTRs) af cognate mRNA mål⁶. Flere oncomirs og tumor suppressorer er nu blevet identificeret, og deres rolle i reguleringen af sygdomsudbrud og metastase er blevet godt undersøgt i forskellige kræftformer^6,7. Disse små ikke-kodning RNAs ofte tjener som meget vigtige mål i at kontrollere sygdom dødelighed^6,8,9. Nyere forskning har været fokuseret på at forstå paracrine virkninger af miRNAs i Cancer metastaser via deres transport i EVs, såsom exosomer, at strømmen i blodbanen og tillade tumorceller til at sende disse sekundære budbringere til metastatiske steder i en nuclease-fri miljø^10,11,12. EVs transporterer miRNAs fra tumorcellerne for at overføre de transformerende effekter fra værtscellerne¹². Identifikation af evt som sekundære budbringere af tumorceller kan derfor være nyttige i ikke-invasiv påvisning af sygdommens sværhedsgrad.

MiR-1246 er meget upregulated i EVs fra aggressive PCa, og det indikerer sygdommens sværhedsgrad¹³. Disse EV-associerede miRNAs ikke kun fungere som ikke-invasive biomarkører af sygdommen, men også spille funktionelt vigtige roller i kørsel tumorigenesis. Derfor er det vigtigt at forstå betydningen af miRNA repertoire, der er forbundet med resistente former for PCa for at muliggøre bedre identifikation af ikke-invasive biomarkører samt deres funktionelle betydning.

Fremkomsten af næste generation sekvensering har tilbudt den mest omfattende platform til at studere detaljerne i tumor landskab involverer ændringer i genomet såsom mutationer, kromosomale flytninger, chromothripsis, og methylering, som alle bidrager væsentligt til form og karakter af kræft^14,15,16. Ligeledes, det er også et vigtigt redskab til at forstå de store engang ændringer, der opstår i en tumor celle, og som ofte er vigtige aktører i sygdoms sværhedsgrad¹⁷. Med det formål at forstå miRNA-repertoiret i forbindelse med genereringen af NEPC blev der udført små RNA-sekvensering på FFPE metastatisk CRPC-væv og deres tilsvarende serum afledte EVs. RNA afledt af en af disse to prøve kilder er (1) lavt udbytte og (2) af dårlig kvalitet på grund af den nedbrydning, der ofte sker på grund af formalin fiksering og EV isolation. Desuden er generering af cDNA-biblioteker et kritisk, men besværligt trin i en sekvensering. Således metoder til isolering af disse RNAs og bruge dem til at generere biblioteker til små RNA sekvensering kræver optimering for at generere nøjagtige og pålidelige data.

Der er flere metoder til at profilere miRNA-udtryk i forskellige prøver, herunder RT-PCR, microarrays og in-situ-hybridisering (ISH). En protokol, der bruger FFPE vævs afledt RNA til at evaluere miRNA-udtryk ved RT-PCR og ISH, blev for nylig udgivet¹⁸. Nyere teknologier tilbyder mere udtømmende og omfattende platforme til profilering af miRNA-udtryk i en stikprøve. NanoString nCounter tilbyder en følsom miRNA Detection platform¹⁹, men registreringen er ofte begrænset af det antal Mirnas, der er tilgængelige i matrixen (~ 2.000). I et sådant scenario, en mere følsom og udtømmende platform såsom næste generation sekvensering tilbyder meget bredere dybde af miRNA identifikation og samtidige profilering i forskellige prøver²⁰. Metoden er blevet anvendt til at bestemme Mirna-signaturer i urin eller plasma fra PCa-patienter^21,22,23. I den nuværende artikel, en protokol er præsenteret for at bruge en næste generation sekventering platform til at studere Mirna profiler forbundet med aggressive CRPc ved hjælp af FFPE væv og serum-afledte EV RNAs.

Protocol

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i USA’S fælles regel og blev godkendt af det institutionelle udvalg for menneskelig forskning. 1. microdissection Bemærk: FFPE metastatisk CRPc-væv med adenocarcinom-funktioner (CRPc-adeno) eller ne-differentiering (CRPc-ne) blev opnået fra prostata cancer biorepositorienet (pcbn). TEN-micron PCa sektioner på glas slides blev forberedt til manuel microdissection …

Representative Results

Biblioteket blev udarbejdet efter RNA-isolation, og der blev udført en kvalitetskontrol. Gel rensning for det forstærkede cDNA-bibliotek fremstillet af RNA isoleret fra mikrodissekerede væv og serumafledte EVs er vist i figur 1 og figur 2. Produktstørrelsen for adapter ligerede miRNAs svarede til ca. 136 − 160 BP for hver prøve. Figur 1A-B er markeret til at vise det område af gelen, der nøjagtigt skal exci…

Discussion

I denne artikel beskriver vi en protokol for at isolere RNA fra FFPE-væv og serum afledte EVs ved hjælp af kits, der blev optimeret til at øge udbyttet og kvaliteten af isolerede RNAs. Desuden blev de rensede RNAs brugt til at generere cDNA-biblioteker til små RNA-sekvensering. Begge de anførte trin er afgørende for fastsættelsen af kvaliteten og dybden af sekvensering læser, der er det endelige resultat fra Run²⁴. Derfor er optimering af disse afgørende trin afgørende for en vellykket s…

Materials

3M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5X)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
–	–	–	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG