Summary
La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.
Abstract
La ablación del receptor de andrógenos (AR) señalización por privación de andrógenos es el objetivo de la primera línea de terapia para el cáncer de próstata que inicialmente resulta en la regresión del cáncer. Sin embargo, en un número significativo de casos, la enfermedad progresa a cáncer de próstata avanzado y resistente a la castración (CRPC), que tiene opciones terapéuticas limitadas y a menudo es agresivo. La metástasis distante se observa principalmente en esta etapa de la enfermedad agresiva. La CRPC es tratada por una segunda generación de inhibidores de la vía AR que mejoran la supervivencia inicialmente, seguido de la aparición de resistencia terapéutica. El cáncer de próstata neuroendocrino (NEPC) es una rara variante del cáncer de próstata (PCa) que a menudo se desarrolla como resultado de la resistencia terapéutica a través de un proceso de transdiferenciación conocido como diferenciación neuroendocrino (NED), en el que las células PCa se someten a un interruptor de linaje adenocarcinomas y muestran una mayor expresión de marcadores de linaje neuroendocrino (NE). Además de las alteraciones genómicas que impulsan la progresión y transdiferenciación a la NEPC, los factores epigenéticos y las señales microambientales se consideran actores esenciales para impulsar la progresión de la enfermedad. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para identificar los controladores epigenéticos (es decir, pequeños ARN no codificantes) que están asociados con PCa avanzado. Utilizando microRNAs purificados a partir de tejidos metastásicos incorporados en parafina fijada de formalina (FFPE) y las correspondientes vesículas extracelulares derivadas del suero (EV), el protocolo describe cómo preparar bibliotecas con el control de calidad adecuado para la secuenciación microRNAs de estas fuentes de muestra. Aislar el ARN de FFPE y EVs es a menudo difícil porque la mayor parte de él está degradado o es limitado en cantidad. Este protocolo elaborará diferentes métodos para optimizar las entradas de ARN y las bibliotecas de ADNr para producir la mayoría de las lecturas específicas y los datos de alta calidad tras la secuenciación.
Introduction
El cáncer de próstata es impulsado por andrógenos que actúan a través de la señalización AR. Por lo tanto, apuntar a la vía de AR es el tratamiento principal para la enfermedad1. Sin embargo, la resistencia a menudo se produce como resultado de terapias dirigidas y la enfermedad progresa a un CRPC2metastásico avanzado. CRPC es tratado por la segunda generación de arretroterapia que incluye enzalutamida y abiraterona2,3 que mejora la supervivencia inicialmente. Sin embargo, las variantes letales como la NEPC a menudo emergen en el 25-30% de los casos de CRPC tratados que tienen opciones de tratamiento limitadas, lo que conduce a un aumento de la mortalidad3. EL NEPC surge a través de un proceso de transdiferenciación reversible conocido como NED, en el que las células DeC se someten a un cambio de linaje de adenocarcinomas y muestran una disminución de la expresión de AR y una mayor expresión de marcadores de linaje NE incluyendo enolase 2 (ENO2), cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP)4. Dado que estas variantes de resistencia surgen como resultado de intervenciones terapéuticas, es esencial descifrar vías que conducen a la generación de esta forma mortal, difícil de tratar de PCa.
La genómica de NEPC fue descifrada recientemente en un exhaustivo estudio realizado por Beltrán y otros en el que se analizaron alteraciones del número de copias, mutaciones, polimorfismos de nucleótido único (SNP) y metilación del ADN de tejidos metastásicos derivados del paciente5. A pesar de los avances significativos en la comprensión de la genómica de esta forma agresiva de PCa, poco se sabe sobre los factores epigenéticos, incluyendo los pequeños ARN no codificantes (microARN) que están involucrados en la transición del CRPC-adenocarcinoma a NEPC. Los MicroRNAs (miRNAs) son ARN de 22 bp de largo y doble cadena que actúan principalmente suprimiendo la expresión génica post-transcripción mediante interacciones específicas de secuencia con las 3 regiones no traducidas (UTR) de las metas de ARNm cognado6. Ahora se han identificado varios oncomiRs y supresores de tumores, y su papel en la regulación de la aparición de la enfermedad y la metástasis ha sido bien estudiado en diferentes cánceres6,7. Estos pequeños ARN no codificantes a menudo sirven como objetivos muy importantes en el control de la mortalidad por enfermedad6,8,9. Investigaciones más recientes se han centrado en la comprensión de los efectos paracrinos de los miRNAs en la metástasis oncológica a través de su transporte en vehículos eléctricos, como los exosomas, que fluyen en el torrente sanguíneo y permiten que las células tumorales envíen a estos mensajeros secundarios a lugares metastásicos en un ambiente libre de nucleasas10,11,12. Los vehículos eléctricos transportan miRNAs de las células tumorales para transferir los efectos transformadores de las células huésped12. Por lo tanto, la identificación de los vehículos eléctricos como mensajeros secundarios de las células tumorales puede ser útil en la detección no invasiva de la gravedad de la enfermedad.
El miR-1246 está altamente regulado en vehículos eléctricos de PCa agresivo, e indica la gravedad de la enfermedad13. Estos miRNAs asociados a EV no sólo sirven como biomarcadores no invasivos de la enfermedad, sino que también desempeñan funciones funcionalmente importantes en la conducción de la tumorigenesis. Por lo tanto, es esencial entender la importancia del repertorio miRNA que se asocia con formas resistentes de PCa para permitir una mejor identificación de los biomarcadores no invasivos, así como su significado funcional.
El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha ofrecido la plataforma más completa para estudiar los detalles del paisaje tumoral que implican alteraciones en el genoma como mutaciones, reubicaciones cromosómicas, cromoripsis y metilación, todas las cuales contribuyen significativamente a la forma y naturaleza del cáncer14,15,16. Del mismo modo, también es una herramienta esencial para entender los vastos cambios epigenómicos que se producen en una célula tumoral y que a menudo son actores importantes en la gravedad de la enfermedad17. Con el objetivo de entender el repertorio de miRNA asociado con la generación de NEPC, se realizó la secuenciación de ARN pequeño en los tejidos CRPC metastásicos FFPE y sus correspondientes vehículos eléctricos derivados del suero. El ARN derivado de cualquiera de estas dos fuentes de muestra es (1) bajo en rendimiento y (2) de mala calidad debido a la degradación que a menudo ocurre debido a la fijación de formalina y aislamiento EV. Además, la generación de bibliotecas de ADNc es un paso crítico, pero engorroso, de una ejecución de secuenciación. Por lo tanto, los métodos para aislar estos ARN y usarlos para generar bibliotecas para la secuenciación de ARN pequeño requieren optimización para generar datos precisos y confiables.
Existen varios métodos para perfilar la expresión de miRNA en diferentes muestras, incluyendo RT-PCR, microarrays e hibridación in situ (ISH). Recientemente se publicó un protocolo que utiliza ARN derivado del tejido FFPE para evaluar la expresión de miRNA por RT-PCR e ISH18. Las tecnologías más recientes ofrecen plataformas más exhaustivas y completas para la generación de perfiles de expresión de miRNA en una muestra. NanoString nCounter ofrece una plataforma de detección de miRNA sensible19, pero la detección a menudo está limitada por el número de miRNAs que están disponibles en la matriz (2.000 euros). En tal escenario, una plataforma más sensible y exhaustiva como la secuenciación de próxima generación ofrece una profundidad mucho más amplia de identificación de miRNA y perfilado simultáneo en diferentes muestras20. El método se ha utilizado para determinar las firmas de miRNA en orina o plasma de los pacientes con PCa21,22,23. En el artículo actual, se presenta un protocolo para utilizar una plataforma de secuenciación de próxima generación para estudiar perfiles de miRNA asociados con CRPC agresivo utilizando tejidos FFPE y ARN EV derivados del suero.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Regla Común de los Estados Unidos y fue aprobado por el Comité Institucional de Investigación Humana.
1. Microdisección
NOTA: Los tejidos CRPC metastásicos FFPE con características de adenocarcinoma (CRPC-Adeno) o diferenciación NE (CRPC-NE) se obtuvieron de la Red de Birepositorios de Cáncer de Próstata (PCBN). Se prepararon secciones de PCa de diez micras en portaobjetos de vidrio para microdisección manual, como se discutió anteriormente18. Para resumir brevemente:
- Desparaffinizar las secciones de tejido empapando los portaobjetos en xileno (2x, 10 min cada uno). A continuación, rehidrata las secciones incubando los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol clasificado (100%, 95%, 90%, 80% y 70%), seguido de un lavado de agua destilado y tinción con hematoxilina (30 s empapado).
- Después de la tinción de hematoxilina, lave las secciones tisulares con agua. Luego deshidrata las secciones de tejido colocándolas en etanol calificado (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min cada uno) seguido de xileno (5 min).
- Analizar las diapositivas correspondientes de hematoxilina y eosina (H&E) para identificar las áreas tumorales (es decir, adenocarcinomas o NED) y marcar estas áreas tumorales y áreas adyacentes normales con la ayuda de un patólogo certificado por la junta. Usando estas diapositivas de H&E como hojas de ruta, marque los tejidos manchados de hematoxilina obtenidos en el paso anterior para distinguir entre el tumor y las áreas normales.
- Diseccionar el tejido marcado cuidadosamente debajo del microscopio usando una cuchilla de bisturí.
- Recoger el tejido diseccionado de las áreas normales y cancerosas en tubos separados utilizando puntas de pipeta de carga de gel cargadas electrostáticamente. La punta cargada atrae el tejido diseccionado y permite la máxima recuperación del tejido después de la disección. Una vez que el tejido se pegue a la punta cargada, corte la punta en un tubo de recogida vacío de 2 ml.
2. Isolating Suero-derivado sivor de vehículos eléctricos
NOTA: Las muestras de suero para pacientes congelados recogidas de pacientes con CRPC metastásica con características de adenocarcinoma (CRPC-adeno) o diferenciación NE (CRPC-NE) se adquirieron de PCBN utilizando un protocolo IRB aprobado y se almacenaron a -80 oC antes de su uso. Se recogieron muestras de suero del mismo conjunto de pacientes que las utilizadas para tejidos microdiseccionados para permitir la comparación entre los tejidos correspondientes y los vehículos eléctricos derivados del suero. Se utilizó un reactivo de aislamiento EV sérico disponible comercialmente para recoger los vehículos eléctricos.
- Descongelar muestras de suero para pacientes congelados a 4oC.
- Utilice 110 l de muestra sérica desaliñada y gire a 2.000 x g durante 30 min.
- Recoja el sobrenadante para el posterior aislamiento ev/exosomio y deseche el pellet de escombros. Añadir 30 s de reactivo de aislamiento de exosomas séricos al sobrenadante e incubar a 4 oC durante 30 min.
- Gire a 10.000 x g durante 10 min. Recoja cuidadosamente el suero agotó el EV sin alterar el pellet en un tubo separado de 1,5 ml y guárdelo a -80 oC para su análisis futuro, si es necesario.
- Resuspenda el gránulo EV en 70 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) preparada en agua libre de nucleasas. Mantenga una alícuota para el sistema de análisis de seguimiento de partículas para evaluar la calidad y el número de partículas. Almacene el resto de la muestra a -80 oC hasta su posterior análisis.
3. Aislamiento de ARN de tejidos de próstata microdiseccionados y vehículos eléctricos
NOTA: El ARN total se aisló de tejidos microdiseccionados y los vehículos eléctricos purificados utilizando un kit disponible comercialmente(Tabla de Materiales)según las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. En las secciones siguientes se describen brevemente estos procedimientos con especial énfasis en los pasos importantes:
- Aísle el ARN de los tejidos microdiseccionados.
- Resuspenda el tejido ffPE microdiseccionado en 150 ml de tampón de proteinasa K. Mezclar por vórtice y pipetear el tejido residual de la punta. Gire a 11.000 x g durante 1 min.
- Añadir 10 ml de proteinasa K al pellet. Espere 2 minutos hasta que el pellet se vuelva blanco. Pipetear hacia arriba y hacia abajo un par de veces.
- Incubar a 56oC durante 16 min. Vortex cada 3 min.
- Retirar las muestras y dejar que el bloque de calor alcance los 80 oC. Incubar las muestras en el bloque durante 16 min.
- Incubar sobre hielo durante 3 min.
- Gire a 20.000 x g durante 15 min. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml.
- Añadir 16 l de tampón de refuerzo DNase seguido de 10 l de DNase I. Mezclar invirtiendo el tubo suavemente e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
- Añadir 320 l de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Mezcle invirtiendo el tubo y luego agregue 1.120 ml de etanol al 100%. Transfiera inmediatamente en columnas de giro almacenadas a 4oC. Gire a 8.000 x g durante 30 s.
- Lave las columnas 2x con tampón de lavado y gire las columnas a 20.000 x g durante 5 min para eliminar el tampón de lavado residual.
- Deje que la columna de centrifugado se seque al aire durante 2 x 3 minutos, luego eluye con 19 l de agua libre de RNase. Cuundar el ARN purificado en un espectrofotómetro y normalizar la muestra a 40 ng/L.
- Aislamiento de ARN de vehículos eléctricos derivados del suero.
- Aísle el ARN exosomal con un kit. Añadir 75 ml de tampón de lisis A y 9,3 l de tampón de lisis B a 50 s de la suspensión ev purificada.
NOTA: Siga mezclando la muestra invirtiendo el tubo durante unos 10 minutos para permitir la lisis completa de los vehículos eléctricos. - Añadir 130 s de etanol al 100% y mezclar inmediatamente invirtiendo la muestra. Transfiera en una columna de giro y luego gire a 3.300 x g durante 1 min.
- Lave la columna 2x con el tampón de lavado. Gire la columna a 1.300 x g durante 3 min para eliminar completamente el tampón de lavado.
- Dejar que la columna se seque al aire durante 2 min. Añadir 18 sL de tampón de elución a la columna y dejar que se siguió durante 2 min.
- Repita el paso 3.2.4 con el tampón eludado incluido en el kit para aumentar el rendimiento del ARN de la muestra.
- Cuantifique la muestra en un espectrofotómetro y normalícela a 40 ng/L.
- Aísle el ARN exosomal con un kit. Añadir 75 ml de tampón de lisis A y 9,3 l de tampón de lisis B a 50 s de la suspensión ev purificada.
4. Preparación de la biblioteca para la secuenciación de ARN pequeño
NOTA: Se utilizó un pequeño kit de preparación de bibliotecas de ARN(Tabla de materiales)para generar bibliotecas de ADNr a partir de las muestras de ARN aisladas. Los pasos para generar bibliotecas, purificarlas y comprobarla antes de ejecutarlas en un secuenciador son cruciales para cualquier protocolo de secuenciación, ya que finalmente determinan la calidad de los datos de salida de una ejecución. Por lo tanto, proceda cuidadosamente con cada paso. Las directrices del fabricante sugieren el uso de un mínimo de 50 ng de ARN. Dada la mala calidad y las bajas cantidades de ARN total obtenidas de estas dos fuentes de muestra, este protocolo está optimizado para concentraciones de ARN tan bajas como 100 ng. El protocolo siguiente es para una muestra de una biblioteca.
- Generar ADNc ligado por adaptador.
- Utilice 5 ml de una muestra de ARN normalizada (40 ng/L). Añadir 1 adaptador de 3'. Precalentar el ciclor térmico a 70 oC antes de incubar las muestras. Incubar durante 2 min. Transfiera inmediatamente las muestras sobre hielo antes de pasar al siguiente paso.
- En un tubo separado, mezcle 2 ml de tampón de ligación, 1 l de inhibidor de la RNase y 1 l de ARN Ligadosa 2 T4, un mutante de eliminación. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo y agregue 4 ml de esta mezcla al tubo con el adaptador RNA/3'.
- Pasar al ciclor térmico que ha sido precalentado a 28oC e incubar durante 1 h.
- Añadir 1 l de solución de parada manteniendo las muestras en el bloque térmico. Incubar a 28oC durante otros 15 min.
- Retire los tubos y manténgalos en hielo inmediatamente después de este paso.
- En un tubo separado, añadir 1 l de adaptador de 5'.
- Pasar a un ciclor térmico que ha sido precalentado a 70oC e incubar durante 2 min.
- Coloque inmediatamente el tubo sobre hielo para evitar que se vuelvan a colocar los adaptadores.
- Añadir 1 l de 10 mM de ATP al tubo del adaptador desnaturalizado de 5'. Mezcle con pipeteo y agregue 1 l de ligados de ARN T4 a la mezcla. Mezclar con pipeteo y añadir 3 l de esta mezcla al tubo que contiene el ARN ligado al adaptador de 3'. Transferencia en el ciclor térmico que ha sido precalentado a 28oC e incubar durante 1 h.
- Transfiera inmediatamente al hielo y continúe con las muestras o almacene a -20 oC para su uso futuro.
- Para realizar RT-PCR, utilice 6 ml de cada ARN ligado por el adaptador y agréguele 1 l de imprimación de ARN RT. Traslado al ciclor térmico que ha sido precalentado a 70oC. Incubar durante 2 min.
- En un tubo separado, mezcle 2 ml de tampón de hebra de 5x, 0,5 ml de dNTPs de 12,5 mM, 1 ml de TDT de 100 mM, 1 l de inhibidor de la RNase y 1 l de transcriptasa inversa. Añadir 5,5 ml de esta mezcla al ARN ligado por el adaptador y transferirlo al ciclor térmico que se ha precalentado a 50oC. Incubar durante 1 h.
- Transfiera el ADNc ligado al adaptador inmediatamente al hielo.
- En un tubo separado, mezcle 25 ml de mezcla de PCR, 2 ml de imprimación de ARN PCR, 2 ml de índice de imprimación de ARN PCR y 8,5 ml de agua libre de RNase. Añadir 37,5 ml de esta mezcla a 12,5 ml de ADNc con ligadura de adaptador. Traslado al ciclor térmico que ha sido precalentado a 98oC. Programe el ciclor térmico como se sugiere en el protocolo del fabricante con el número de ciclo modificado a 15 en lugar de 11.
NOTA: Las secuencias de todas las imprimaciones utilizadas se enumeran en Tabla de materiales. - Mantenga las muestras a 4 oC después de la finalización. Proceda con ellos o almacene a -80 oC para su uso futuro.
- Purificar y realizar un control de calidad para el ADNC ligado.
NOTA: El ADNc amplificado fue purificado en gel siguiendo el protocolo del fabricante, excepto por algunas modificaciones para mejorar la calidad y el rendimiento de las muestras de ADC purificadas como se explica a continuación.- Utilice geles de poliacrilamida TBE al 6% para purificar el ADNc amplificado. Diluir la escalera de alta resolución (HRL) y la escalera de ARN personalizada (CRL) con volúmenes iguales de tinte de carga de ADN.
- Añadir 10 l de tinte de carga de ADN a cada muestra de ADNc. Ejecutar 30 l de cada muestra en dos carriles separados adyacentes entre sí con CRL y HRL en el espacio intermedio entre las dos muestras diferentes.
- Ejecute el gel en 1 x tampón TBE a 145 V durante aproximadamente 30 x 40 min.
NOTA: Lleve un registro del frente azul inferior del tinte de carga. Detenga la electroforesis cuando se acerque a la parte inferior del gel. - Transfiera el gel en 1 tampón TBE con Bromuro de etidio (EtBr) a 0,5 g de EtBr/1 mL 1x TBE.
PRECAUCION: EtBr es un carcinógeno conocido y cada paso desde aquí hasta la escisión del gel debe realizarse con extrema precaución. - Visualice el gel en un transiluminador y corte el gel con precisión entre el marcador de 145 bp y 160 bp.
NOTA: Los atenuadores del adaptador se ejecutan muy cerca del marcador de 145 bp. Por lo tanto, corte el gel ligeramente por encima del marcador de 145 bp para evitar la contaminación con el dimer adaptador. - Transfiera el gel a tubos de ruptura de ADN mantenidos en tubos de recolección de 2 ml. Gire a 20.000 x g durante 2 min. Añadir 300 l de agua libre de RNase y permitir que gire suavemente en un balancín durante la noche en RT.
- Para realizar la precipitación del ADN, al día siguiente transfiera el contenido del tubo a tubos de filtro de 5 m. Gire a 600 x g durante 10 s.
NOTA: No deje que los tubos giren más de 10 s a medida que el gel pasa a través del filtro. - Añadir 2 ml de glucógeno, 30 ml de 3 M de NaOAc, 2 ml de pintura de pellets de 0,1x y 975 ml de etanol 100% al ADN eludado. Girar a 17.000 x g a 4oC durante 20 min.
- Deseche el sobrenadante y agregue 75% de etanol para lavar el pellet. Girar a 17.000 x g a 4oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante e incubar los tubos a 37oC para evaporar completamente el etanol.
- Resuspenda el pellet con 12 ml de 10 mM Tris-HCl pH 8.5.
- Realice una comprobación de la calidad de la biblioteca diluyendo el ADNc purificado por 10x (1:10) y usando 1 l de ADNc diluido para ejecutarse en un bio-analizador.
- Asegúrese de que el tamaño del producto cDNA corresponde al rango de ARN pequeño (136-160 bp) en el electroferograma. Calcular la molaridad total para cada muestra. Normalice cada muestra a 2 nM utilizando Tris-HCl pH 8.5.
- Desnaturalizar y secuenciar el ADNc purificado.
- Agrupa las bibliotecas mezclando volúmenes iguales de cada muestra de 2 nM en un solo tubo PCR de 200 ml. Añadir 10 l de NaOH recién preparado a 10 l de biblioteca agrupada.
- Mezclar inmediatamente por vórtice, y girar a 280 x g durante 1 min. Incubar a RT durante 5 min.
- Añadir 10 ml de 200 mM Tris-HCl pH 7 a 20 l de la biblioteca desnaturalizada. Mezclar por vórtice y girar a 280 x g durante 1 min.
- Añadir 970 l de búfer de hibridación preenfriada a la biblioteca y mezclar bien mediante vórtice. La biblioteca está a una concentración de 20 pM. Mantener en hielo hasta que finalmente se diluya.
NOTA: La dilución final se realiza justo antes de ejecutarse en el secuenciador. - Añadir 117 l de la biblioteca desnaturalizada a 1.183 ml de búfer de hibridación preenfriada. Mezclar invirtiendo el tubo y la centrífuga de pulso. La concentración final de la biblioteca es ahora de 1,8 pM.
- Añadir 1,3 l de PhiX a los 1,3 ml de la biblioteca final. Para iniciar una ejecución en un secuenciador, siga los pasos en pantalla de la interfaz de software, revise los parámetros de ejecución, incluido el tipo de lectura (lectura única), la longitud de lectura (número de ciclos para cada lectura), el identificador de biblioteca y seleccione Iniciar.
5. Análisis de datos
- Al final de la ejecución del secuenciador, obtenga los datos de secuenciación resultantes como archivos fastQ. Utilice el software adecuado para analizar los datos de secuenciación resultantes.
- Abra la aplicación del kit de herramientas fastQ y pulse el botón Iniciar.
- Seleccione los archivos de la lista de muestras en el software y seleccione dónde se guardarán los datos.
- Agregue un nombre de cadena que se aplique a cada secuencia recortada. Mantenga la rigelidad a 0.9. Introduzca la secuencia del adaptador para recortarla como "TGGAATTCGGGTGCCAAGG" del extremo 3 de cada muestra secuenciada. Expanda la pestaña Leer filtrado y seleccione una longitud de lectura mínima de "5". Seleccione el cuadro Confirmar y pulse el botón Continuar para iniciar el recorte. Los archivos recortados se guardarán en la carpeta del proyecto al final del análisis.
- Abra la pequeña aplicación RNA v.1.0 en el software y pulse el botón Iniciar.
- Seleccione el proyecto donde se guardarán y enviarán los archivos después del análisis.
- Seleccione la función Nuevos mORs y MiRs diferenciales en la aplicación. Segregar los grupos como"Control"y"Prueba"para el análisis diferencial y añadir los archivos recortados para ser analizados en sus respectivos grupos.
- Seleccione el botón Iniciar para iniciar el análisis. Tras los análisis, descargue los archivos resultantes.
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Representative Results
La biblioteca se preparó después del aislamiento del ARN y se realizó un control de calidad. La purificación de gel para la biblioteca de ADNamplificado preparada a partir de ARN aislado de tejidos microdiseccionados y vehículos eléctricos derivados del suero se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. El tamaño del producto para los miRNAs ligados por adaptadores correspondió a aproximadamente 136 a 160 bp para cada muestra. La Figura 1A-B se marcan para mostrar el rango del gel que se debe extirpar con precisión para la preparación de la biblioteca de ARN pequeño. La Figura 2A-B muestra la electroforesis de gel y los electroferogramas para el tejido microdiseccionado y los vehículos eléctricos derivados del suero. La Figura Suplementaria 1 muestra un resultado representativo de la máquina de electroforesis y el método para calcular la molaridad.
Se realizaron los pasos para obtener las métricas de la biblioteca antes de ejecutarse en un secuenciador. La Figura 3 muestra las métricas representativas de una pequeña ejecución de secuenciación de ARN que muestra la densidad de clúster esperada, la puntuación de control de calidad, el porcentaje de filtro de paso del clúster y las tasas de error y rendimiento estimados. La Figura 3A y la Figura 3C muestran las tablas con todos los parámetros de ejecución y el gráfico para la puntuación de control de calidad en diferentes ciclos. La Figura 3B,D son representaciones gráficas de las tasas de error para la alineación de PhiX en diferentes ciclos. Los datos proporcionados provienen del software de análisis in situ.
Se utilizó una aplicación de software disponible comercialmente(Tabla de materiales)para analizar las muestras secuenciadas de tejido microdiseccionado y vehículos eléctricos derivados del suero. Las muestras secuenciadas se recortaron de las secuencias del adaptador utilizando el kit de herramientas FASTq seguido de un análisis en la aplicación"Arn pequeño v.1.0". La Figura 3 muestra los datos resultantes tras el análisis. La Tabla 1 y la Tabla 2 muestran las lecturas totales del tejido microdiseccionado y de la secuenciación de vehículos eléctricos derivados del suero. La Figura 3A y la Figura 3B muestran la distribución de la longitud del ARN pequeño para las dos fuentes de muestra.
Figura 1: Preparación de la biblioteca para la secuenciación de ARN pequeño sin codificación. Gel de poliacrilamida cDNA para las bibliotecas amplificadas de (A) ARN tejido FFPE microdiseccionado y (B) ARN de vehículos eléctricos purificados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comprobación de calidad para secuenciar ARN pequeño no codificante. Imagen representativa de la electroforesis de gel y electroferograma para la biblioteca de ADNes purificada para(A) tejido FFPE microdiseccionado y (B) vehículos eléctricos derivados del suero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejecute métricas para la ejecución de secuenciación de ARN pequeña. Representación tabular y gráfica de los parámetros de ejecución % Q 30, densidad de racimo, filtro de paso de clúster %, rendimiento estimado y Puntuación Q para secuenciación de ejecuta ción(A) tejido FFPE microdiseccionado y (C) vehículos eléctricos derivados. Representación gráfica de las tasas de error para la alineación de PhiX en diferentes ciclos de secuenciación desde (B) tejido FFPE microdiseccionado y (D) vehículos eléctricos derivados del suero. Las barras de errores representan la desviación estándar para las tasas de error para cada ciclo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados esperados de una pequeña ejecución de secuenciación de ARN no codificante. Longitudes de lectura de ARN pequeño para la biblioteca de (A) Tejido ffPE microdiseccionado y (B) vehículos eléctricos derivados del suero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Lecturas de secuenciación total |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
Tabla 1: Lecturas de secuenciación total para una secuenciación de ARN pequeña a partir de tejido FFPE microdiseccionado. Porcentaje de lecturas correspondientes a pequeños ARN para muestras de FFPE secuenciadas que se obtuvieron después del análisis.
| Muestra | Lecturas de secuenciación total |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
Tabla 2: Lecturas de secuenciación total para una secuenciación de ARN pequeña a partir de vehículos eléctricos derivados del suero purificados. Porcentaje de lecturas correspondientes a pequeños ARN para muestras de EV secuenciadas obtenidas después del análisis.
Figura suplementaria 1: Comprobación de calidad para la secuenciación de ARN pequeño no codificante. Resultados representativos de una máquina de electroforesis que muestra la molaridad total de la muestra indicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, describimos un protocolo para aislar el ARN de los tejidos FFPE y los vehículos eléctricos derivados del suero utilizando kits optimizados para aumentar el rendimiento y la calidad de los ARN aislados. Además, los ARN purificados se utilizaron para generar bibliotecas de ADNc para la secuenciación de ARN pequeño. Ambos pasos enumerados son esenciales para determinar la calidad y profundidad de las lecturas de secuenciación que son el resultado final de la ejecución24. Por lo tanto, optimizar estos pasos cruciales es fundamental para una ejecución de secuenciación exitosa.
Un paso importante en el aislamiento del ARN derivado de la FFPE es la digestión con proteinasa K que permite la eliminación de la formalina reticulada del tejido. Este paso se ha optimizado incubando la muestra a 55 oC y 80 oC durante unos 16 x 18 min cada uno. Esto dio lugar a un aumento efectivo en la calidad del ARN aislado por un aumento en la relación 260/280. Las lecturas de secuenciación suelen ser variables para una ejecución que incluye varios ejemplos. Por lo tanto, el control de la cantidad de entradas de ARN al inicio de la preparación de la biblioteca permite la uniformidad de la biblioteca. El uso de ARN normalizado ayuda a nivelar una secuenciación de forma uniforme en diferentes muestras. El paso más crítico en la preparación de la biblioteca es la purificación de los CDA ligados del adaptador amplificado. Es muy importante extirpar cuidadosamente los geles por encima del marcador de 140 bp, porque una ligera desviación hacia la parte inferior del marcador conduce a la contaminación de los dimers del adaptador. Por último, la normalización de la biblioteca de ADN es el paso más importante del protocolo de secuenciación y debe realizarse con precisión en función de la normalidad calculada de la máquina de electroforesis.
En caso de contaminación por dimer adaptador, se puede volver a ejecutar la biblioteca purificada en un gel TBE y repurificar el producto deseado. Sin embargo, el rendimiento de la biblioteca de ADNes en tal extracción se reduce significativamente, lo que puede afectar a la longitud de lectura de la muestra. Para una estimación de la concentración de la biblioteca de ADNc purificado, se pueden diluir las muestras antes de ejecutarlas en la máquina de electroforesis en función de la intensidad del producto en los geles TBE y preparar diferentes diluciones (es decir, 5x, 10x o 25x). Para mejorar aún más la estimación de las bibliotecas de ADNc purificadas, ejecutar un qPCR además de electroforesis ayuda a evaluar los niveles de plantilla y permite una normalización más precisa.
Aunque la ultracentrifugación es el estándar de oro para el aislamiento de los vehículos eléctricos de diferentes fuentes, un menor rendimiento de las partículas de tal extracción a menudo limita el uso de este método en la purificación de los vehículos eléctricos donde el material de partida es limitado y una cantidad significativa arna de entrada es necesario para aplicaciones posteriores. Por lo tanto, el uso del reactivo de aislamiento de exosomas total proporciona un método de rendimiento mucho más rápido y más alto para el aislamiento ev de fuentes limitadas como suero y plasma de muestras clínicas.
En general, este protocolo detalla los métodos para generar bibliotecas de ADNc de una manera más eficaz en el tiempo, teniendo en cuenta el rendimiento y la calidad de las bibliotecas de ADNc para obtener lecturas de secuenciación precisas y completas. Dado el potencial de los exosomas como fuente de biomarcadores del cáncer, este método para la secuenciación de próxima generación (NGS) análisis de contenido de miRNA exosomal será útil para la investigación en el campo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos (USAMRAA) a través del Premio de Desarrollo de Ideas bajo el Premio No. W81XWH-18-1-303 y W81XWH-18-2-0013 y adicionalmente por Premio no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 y W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). También se reconoce el apoyo a los autores del laboratorio de autores por parte del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (Número de Subvención RO1CA177984). Rajvir Dahiya es Científico Senior de Investigación en el Departamento de Asuntos de Veteranos, BX004473 y financiado por NIH-UO1CA199694 (RD). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa o el Ejército de los Estados Unidos. Estamos agradecidos a Judy Shigenaga, directora de instalaciones básicas de San Francisco VAMC, por su ayuda con el secuenciador NextSeq 500.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
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