Summary
Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.
Abstract
Ablation von Androgen-Rezeptor (AR) Signalisierung durch Androgen-Entzug ist das Ziel der ersten Linie der Therapie für Prostatakrebs, die zunächst in Krebs Regression führt. In einer signifikanten Anzahl von Fällen entwickelt sich die Krankheit jedoch zu fortgeschrittenem, kastrationsresistentem Prostatakrebs (CRPC), der nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten hat und oft aggressiv ist. Entfernte Metastasen werden meist in diesem Stadium der aggressiven Krankheit beobachtet. CRPC wird von einer zweiten Generation von AR-Signalweg-Inhibitoren behandelt, die das Überleben zunächst verbessern, gefolgt von der Entstehung von Therapieresistenz. Neuroendokrine Prostatakrebs (NEPC) ist eine seltene Variante von Prostatakrebs (PCa), die sich oft als Folge der Therapieresistenz über einen Transdifferenzierungsprozess entwickelt, der als neuroendokrine Differenzierung (NED) bekannt ist, wobei PCa-Zellen einem Abstammungsschalter unterzogen werden. von Adenokarzinomen und zeigen eine erhöhte Expression von neuroendokrinen (NE) Linienmarkern. Neben den genomischen Veränderungen, die das Fortschreiten und die Transdifferenzierung zu NEPC vorantreiben, werden epigenetische Faktoren und mikroökologische Hinweise als wesentliche Akteure bei der Förderung der Krankheitsprogression angesehen. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung der epigenetischen Treiber (d. h. kleine nicht-kodierende RNAs), die mit fortgeschrittenen PCa in Verbindung stehen. Mit gereinigten microRNAs aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) metastasierenden Geweben und entsprechenden serumabgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) beschreibt das Protokoll, wie Bibliotheken mit entsprechender Qualitätskontrolle für die Sequenzierung vorbereitet werden. microRNAs aus diesen Probenquellen. Die Isolierung von RNA sowohl aus FFPE als auch von EVs ist oft eine Herausforderung, da der größte Teil davon entweder abgebaut oder quantitativ begrenzt ist. Dieses Protokoll wird verschiedene Methoden zur Optimierung der RNA-Eingänge und cDNA-Bibliotheken erarbeiten, um bei der Sequenzierung die meisten spezifischen Lesevorgänge und qualitativ hochwertigen Daten zu liefern.
Introduction
Prostatakrebs wird durch Androgene angetrieben, die über AR-Signale wirken. Daher ist die Ausrichtung auf den AR-Signalweg die Hauptstütze der Krankheit1. Jedoch, Resistenz enresultiert oft als Folge von gezielten Therapien und die Krankheit fortschreitet zu einem fortgeschrittenen metastasierenden CRPC2. CRPC wird von der zweiten Generation der AR-Therapie behandelt, die Enzalutamid und Abirateron2umfasst,3, die das Überleben zunächst verbessert. Allerdings treten tödliche Varianten wie NEPC häufig in 25 bis 30 % der behandelten CRPC-Fälle auf, die nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten haben, was zu einer erhöhten Sterblichkeitführt 3. NEPC entsteht über einen reversiblen Transdifferenzierungsprozess namens NED, bei dem PCa-Zellen einen Abstammungswechsel von Adenokarzinomen durchlaufen und eine verminderte Expression von AR und eine erhöhte Expression von NE-Linienmarkern wie Enolase 2 (ENO2), Chromogranin A (CHGA) und Synaptophysin (SYP)4zeigen. Angesichts der Tatsache, dass diese Resistenzvarianten als Ergebnis therapeutischer Interventionen entstehen, ist es wichtig, Wege zu entschlüsseln, die zur Erzeugung dieser tödlichen, schwer zu behandelnden Form von PCa führen.
Die Genomik von NEPC wurde kürzlich in einer umfassenden Studie von Beltran et al. entschlüsselt, in der Kopiernummernänderungen, Mutationen, einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) und DNA-Methylierung aus patientenabgeleiteten metastasierenden Geweben analysiert wurden5. Trotz signifikanter Fortschritte im Verständnis der Genomik dieser aggressiven Form von PCa ist wenig über die epigenetischen Faktoren bekannt, einschließlich der kleinen nicht-kodierenden RNAs (microRNAs), die am Übergang von CRPC-Adenokarzinom zu NEPC beteiligt sind. MicroRNAs (miRNAs) sind 22 bp lange, doppelsträngige RNAs, die in erster Linie durch die Unterdrückung der Genexpression posttranskriptionär durch sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3'-unübersetzten Regionen (UTRs) von cognate mRNA-Targets6wirken. Mehrere OncomiRs und Tumorsuppressoren wurden jetzt identifiziert, und ihre Rolle bei der Regulierung von Krankheitsbeginn und Metastasen wurde bei verschiedenen Krebsarten gut untersucht6,7. Diese kleinen nicht-kodierenden RNAs dienen oft als sehr wichtige Ziele bei der Kontrolle der Krankheitssterblichkeit6,8,9. Neuere Forschungen konzentrierten sich auf das Verständnis der parakrinen Wirkungen von miRNAs in Krebsmetastas über ihren Transport in EVs, wie Exosomen, die in den Blutkreislauf fließen und es Tumorzellen ermöglichen, diese sekundären Botenstoffe an metastasierende Stellen in einer nukleasefreien Umgebung zu senden10,11,12. EVs tragen miRNAs aus den Tumorzellen, um die transformierenden Effekte von den Wirtszellen12zu übertragen. Die Identifizierung von Elektrofahrzeugen als sekundäre Botenstoffe von Tumorzellen kann daher bei der nichtinvasiven Erkennung des Schweregrads von Krankheiten nützlich sein.
Der miR-1246 ist stark hochreguliert in EVs von aggressiven PCa, und es zeigt die Krankheit Schwere13. Diese EV-assoziierten miRNAs dienen nicht nur als nichtinvasive Biomarker der Krankheit, sondern spielen auch eine funktionell wichtige Rolle bei der Förderung der Tumorgenese. Daher ist es wichtig, die Bedeutung des miRNA-Repertoires zu verstehen, das mit resistenten Formen von PCa verbunden ist, um eine bessere Identifizierung nichtinvasiver Biomarker sowie deren funktionelle Bedeutung zu ermöglichen.
Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation bietet die umfassendste Plattform, um die Details der Tumorlandschaft mit Veränderungen im Genom wie Mutationen, chromosomale Verlagerungen, Chromothripse und Methylierung zu untersuchen, die alle wesentlich zur Form und Natur von Krebs beitragen14,15,16. Ebenso ist es auch ein wesentliches Werkzeug, um die enormen epigenomischen Veränderungen zu verstehen, die in einer Tumorzelle auftreten und die oft wichtige Akteure in der Krankheitsschwere17sind. Mit dem Ziel, das miRNA-Repertoire zu verstehen, das mit der Generierung von NEPC verbunden ist, wurde eine kleine RNA-Sequenzierung an FFPE-metastasierenden CRPC-Geweben und den entsprechenden Serum-abgeleiteten EVs durchgeführt. RNA, die aus einer dieser beiden Probenquellen gewonnen wird, ist (1) ertragsarm und (2) von schlechter Qualität aufgrund des Abbaus, der häufig durch Formalinfixierung und EV-Isolation auftritt. Darüber hinaus ist das Generieren von cDNA-Bibliotheken ein kritischer, aber umständlicher Schritt eines Sequenzierungslaufs. Daher erfordern Methoden zur Isolierung dieser RNAs und deren Verwendung zum Generieren von Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung eine Optimierung, um genaue und zuverlässige Daten zu generieren.
Es gibt mehrere Methoden, um die miRNA-Expression in verschiedenen Proben zu profilieren, einschließlich RT-PCR, Mikroarrays und In-situ-Hybridisierung (ISH). Ein Protokoll, das FFPE-Gewebe-abgeleitete RNA zur Bewertung der miRNA-Expression durch RT-PCR und ISH verwendet, wurde kürzlich veröffentlicht18. Neuere Technologien bieten umfassendere und umfassendere Plattformen für die Profilierung der miRNA-Expression in einer Stichprobe. NanoString nCounter bietet eine empfindliche miRNA-Erkennungsplattform19, aber die Erkennung wird oft durch die Anzahl der miRNAs begrenzt, die im Array verfügbar sind (2.000). In einem solchen Szenario bietet eine sensiblere und erschöpfendere Plattform wie die Sequenzierung der nächsten Generation eine viel breitere Tiefe der miRNA-Identifikation und gleichzeitigen Profilerstellung in verschiedenen Proben20. Die Methode wurde verwendet, um die miRNA-Signaturen im Urin oder Plasma von PCa-Patienten21,22,23zu bestimmen. Im aktuellen Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, um eine Sequenzierungsplattform der nächsten Generation zu verwenden, um miRNA-Profile im Zusammenhang mit aggressivem CRPC mit FFPE-Geweben und serumabgeleiteten EV RNAs zu untersuchen.
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Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der US Common Rule durchgeführt und vom Institutional Committee on Human Research genehmigt.
1. Mikrodissektion
HINWEIS: FFPE-metastasiertes CRPC-Gewebe mit Adenokarzinom-Merkmalen (CRPC-Adeno) oder NE-Differenzierung (CRPC-NE) wurden aus dem Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN) gewonnen. ZehnMikron PCa Abschnitte auf Glasrutschen wurden für die manuelle Mikrodissektion vorbereitet, wie zuvor18diskutiert. Um kurz zusammenzufassen:
- Entparaffinisieren Sie die Gewebeabschnitte, indem Sie die Dias in Xylol einweichen (2x, je 10 min). Dann rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Dias für jeweils 5 min in abgestuftem Ethanol (100%, 95%, 90%, 80% und 70%) rehydrieren, gefolgt von einer destillierten Wasserwäsche und Färbung mit Hämatoxylin (30 s einweichen).
- Nach der Hämatoxylinfärbung die Gewebeabschnitte mit Wasser waschen. Dehydrieren Sie dann die Gewebeabschnitte, indem Sie sie in abgestuftes Ethanol (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (je 5 min) gefolgt von Xylol (5 min).
- Analysieren Sie die entsprechenden Hämatoxylin- und Eosin-Dias (H&E), um die Tumorbereiche (d. h. Adenokarzinome oder NED) zu identifizieren und diese Tumorbereiche und normalen angrenzenden Bereiche mit Hilfe eines Board-zertifizierten Pathologen zu markieren. Markieren Sie anhand dieser H&E-Folien als Roadmaps die hämatoxylinbefleckten Gewebe, die im obigen Schritt erhalten wurden, um zwischen tumor- und normalen Bereichen zu unterscheiden.
- Sezieren Sie das markierte Gewebe dia vorsichtig unter dem Mikroskop mit einem Skalpellklinge.
- Sammeln Sie das sezierte Gewebe aus normalen und krebsartigen Bereichen in separaten Röhrchen mit elektrostatisch geladenen Gel-Ladepipettenspitzen. Die geladene Spitze zieht das sezierte Gewebe an und ermöglicht eine maximale Gewebeerholung nach der Zerlegung. Sobald das Gewebe an der geladenen Spitze klebt, schneiden Sie die Spitze in ein leeres 2 ml Sammelrohr.
2. Isolierung von Serum-abgeleiteten Elektrofahrzeugen
HINWEIS: Gefrorene Patientenserumproben, die von Patienten mit metastasierendem CRPC mit Adenokarzinom-Eigenschaften (CRPC-adeno) oder NE-Differenzierung (CRPC-NE) entnommen wurden, wurden von PCBN mit einem zugelassenen IRB-Protokoll beschafft und vor ihrer Verwendung bei -80 °C gespeichert. Serumproben wurden von der gleichen Gruppe von Patienten wie für mikrosezierte Gewebe entnommen, um einen Vergleich zwischen den entsprechenden Geweben und den serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen zu ermöglichen. Zur Erfassung der Elektrofahrzeuge wurde ein handelsübliches Serum-EV-Isolationsreagenz verwendet.
- Gefrorene Patientenserumproben bei 4 °C auftauen.
- Verwenden Sie 110 l aufgetaute Serumprobe und drehen Sie bei 2.000 x g für 30 min.
- Sammeln Sie den Überstand für die nachfolgende EV/Exosome-Isolierung und entsorgen Sie das Schmutzpellet. 30 min des Serumexosomen-Isolationsreagenz hinzufügen und bei 4 °C inkubieren.
- Drehen Sie bei 10.000 x g für 10 min. Sammeln Sie das EV-erschöpfte Serum sorgfältig, ohne das Pellet in einem separaten 1,5 ml Rohr zu stören und lagern Sie bei -80 °C für zukünftige Analysen, falls erforderlich.
- Setzen Sie das EV-Pellet in 70 l Phosphatgepufferter Salzsäure (PBS) in nukleasefreiem Wasser aus. Halten Sie ein Aliquot für das Partikelverfolgungsanalysesystem, um die Qualität und Anzahl der Partikel zu bewerten. Bewahren Sie den Rest der Probe bei -80 °C bis zur weiteren Analyse auf.
3. RNA-Isolierung aus mikrosezierten Prostatageweben und Elektrofahrzeugen
HINWEIS: Total RNA wurde aus mikrosezierten Geweben und gereinigten Elektrofahrzeugen mit einem handelsüblichen Kit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen isoliert. In den folgenden Abschnitten werden diese Verfahren kurz beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf den wichtigen Schritten liegt:
- Isolieren Sie die RNA aus dem mikrosezierten Gewebe.
- Setzen Sie das mikrosezierte FFPE-Gewebe in 150 l Proteinase-K-Puffer aus. Mischen Sie durch Wirbeln und Pipette aus dem Restgewebe aus der Spitze. Drehen Sie bei 11.000 x g für 1 min.
- Fügen Sie dem Pellet 10 l Proteinase K hinzu. Warten Sie 2 min, bis das Pellet weiß wird. Pipette ein paar Mal rauf und runter.
- Bei 56 °C für 16 min. Vortex alle 3 min inkubieren.
- Proben entfernen und den Wärmeblock 80 °C erreichen lassen. Inkubieren Sie die Proben auf dem Block für 16 min. Vortex alle 3 min.
- 3 min auf Eis bebrüten.
- Drehen Sie bei 20.000 x g für 15 min. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 2 ml Rohr.
- Fügen Sie 16 l DNase-Boosterpuffer hinzu, gefolgt von 10 l DNase I. Mischen Sie das Rohr sanft und inkubieren Bei Raumtemperatur (RT) für 15 min.
- Fügen Sie 320 L rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr invertieren und dann 1.120 l 100% Ethanol hinzufügen. Sofort auf Bei 4 °C gelagerte Spinsäulen übertragen. Drehen Sie bei 8.000 x g für 30 s.
- Waschen Sie die Säulen 2x mit Waschpuffer und drehen Sie die Säulen bei 20.000 x g für 5 min, um den Restwaschpuffer zu entfernen.
- Lassen Sie die Spin-Säule für 2 x 3 min trocknen, dann mit 19 l RNase-freiem Wasser elute. Quantitieren Sie die gereinigte RNA auf einem Spektralphotometer und normalisieren Sie die Probe auf 40 ng/L.
- RNA-Isolierung von Serum-abgeleiteten Elektrofahrzeugen.
- Isolieren Sie die exosomale RNA mit einem Kit. Fügen Sie 75 l Lysepuffer A und 9,3 l Lysepuffer B bis 50 l der gereinigten EV-Suspension hinzu.
HINWEIS: Mischen Sie die Probe weiter, indem Sie das Rohr ca. 10 min inumkehren, um eine vollständige Lyse der Elektrofahrzeuge zu ermöglichen. - Fügen Sie 130 l 100% Ethanol hinzu und mischen Sie sofort, indem Sie die Probe invertieren. Übertragen Sie auf eine Spin-Säule und drehen Sie dann bei 3.300 x g für 1 min.
- Waschen Sie die Säule 2x mit dem Waschpuffer. Drehen Sie die Säule bei 1.300 x g für 3 min, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen.
- Lassen Sie die Säule für 2 min lufttrocknen. Fügen Sie der Säule 18 l Elutionspuffer hinzu und lassen Sie sie 2 min. Drehen Sie bei 400 x g für 1 min, gefolgt von einer zweiten Drehung bei 5.800 x g für 3 min.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2.4 mit dem im Kit enthaltenen eluierten Puffer, um die Ausbeute der RNA aus der Probe zu erhöhen.
- Quantifizieren Sie die Probe auf einem Spektralphotometer und normalisieren Sie sie auf 40 ng/L.
- Isolieren Sie die exosomale RNA mit einem Kit. Fügen Sie 75 l Lysepuffer A und 9,3 l Lysepuffer B bis 50 l der gereinigten EV-Suspension hinzu.
4. Bibliotheksvorbereitung für die kleine RNA-Sequenzierung
HINWEIS: Ein kleines RNA-Bibliotheks-Vorbereitungskit (Table of Materials) wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken aus den isolierten RNA-Proben zu generieren. Die Schritte zum Generieren von Bibliotheken, Zum Reinigen und Zur Qualitätsprüfung vor der Ausführung auf einem Sequenzer sind für jedes Sequenzierungsprotokoll von entscheidender Bedeutung, da sie schließlich die Qualität der Ausgabedaten aus einer Ausführung bestimmen. Gehen Sie daher mit jedem Schritt vorsichtig vor. Die Richtlinien des Herstellers schlagen vor, mindestens 50 ng RNA zu verwenden. Angesichts der schlechten Qualität und der geringen Mengen an Gesamt-RNA, die normalerweise aus diesen beiden Probenquellen gewonnen werden, ist dieses Protokoll für RNA-Konzentrationen von nur 100 ng optimiert. Das folgende Protokoll ist für ein Beispiel einer Bibliothek.
- Generieren Sie adapterligted cDNA.
- Verwenden Sie 5 l einer normalisierten RNA-Probe (40 ng/l). Fügen Sie 1 L von 3' Adapter hinzu. Vorderhitzen Sie den Thermischen Cycler auf 70 °C, bevor sie die Proben inkubieren. 2 min inkubieren. Übertragen Sie die Proben sofort auf Eis, bevor Sie auf den nächsten Schritt übergehen.
- Mischen Sie in einem separaten Röhrchen 2 l Ligationspuffer, 1 L RNase-Inhibitor und 1 L T4-RNA-Ligase 2, eine Deletionsmutante. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und fügen Sie 4 l dieser Mischung in die Röhre mit dem RNA/3' Adapter.
- Auf den auf 28 °C vorgewärmten Thermocycler übertragen und 1 h inkubieren.
- Fügen Sie 1 L Stop-Lösung hinzu, während Sie die Proben auf dem thermischen Block halten. Bei 28 °C für weitere 15 min inkubieren.
- Entfernen Sie die Rohre und halten Sie sofort nach diesem Schritt auf Eis.
- In einem separaten Rohr 1 l 5' Adapter hinzufügen.
- Auf einen auf 70 °C vorgewärmten Thermocycler übertragen und 2 min inkubieren.
- Legen Sie die Röhre sofort auf Eis, um ein erneutes Glühen der Adapter zu verhindern.
- Fügen Sie dem Rohr des denaturierten 5'-Adapters 1 l von 10 mM ATP hinzu. Durch Pipettieren mischen und 1 L T4-RNA-Ligase in die Mischung geben. Mischen Sie durch Pipettieren und fügen Sie 3 l dieser Mischung in die Röhre, die die 3' Adapter-gebundene RNA enthält. Transfer auf den auf 28 °C vorgewärmten Thermocycler und 1 h inkubieren.
- Sofort auf Eis übertragen und entweder mit den Proben weitergehen oder bei -20 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
- Um RT-PCR durchzuführen, verwenden Sie 6 l jeder adaptor-ligierten RNA und fügen Sie 1 L RNA RT Primer hinzu. Transfer zum auf 70 °C vorgewärmten Thermocycler. Inkubieren Sie für 2 min.
- Mischen Sie in einem separaten Rohr 2 l 5x Strangpuffer, 0,5 l mit 12,5 mM dNTPs, 1 l 100 mM DTT, 1 l RNase-Inhibitor und 1 l Reverse-Transkriptase. Fügen Sie der adaptor-gebundenen RNA 5,5 l dieser Mischung hinzu und übertragen Sie sie auf den thermischen Cycler, der auf 50 °C vorgewärmt wurde. Inkubieren für 1 h.
- Übertragen Sie die adaptor-ligted cDNA sofort auf Eis.
- Mischen Sie in einer separaten Röhre 25 l PCR-Mix, 2 l RNA-PCR-Primer, 2 l RNA-PCR-Primerindex und 8,5 l RNase-freies Wasser. Fügen Sie 37,5 l dieser Mischung zu 12,5 l Adapter-ligted cDNA hinzu. Transfer zum auf 98 °C vorgewärmten Thermocycler. Programmieren Sie den thermischen Cycler, wie im Herstellerprotokoll vorgeschlagen, mit der Zyklusnummer, die auf 15 anstelle von 11 geändert wird.
HINWEIS: Sequenzen aller verwendeten Primer sind unter Tabelle der Materialienaufgeführt. - Bewahren Sie die Proben nach Abschluss bei 4 °C auf. Fahren Sie mit ihnen fort oder lagern Sie bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.
- Reinigen und durchführen Sie die Qualitätskontrolle für die ligated cDNA.
HINWEIS: Amplified cDNA wurde gel-gereinigt, indem das Herstellerprotokoll befolgt wurde, mit Ausnahme einiger Änderungen zur Verbesserung der Qualität und Ausbeute von gereinigten cDNA-Proben, wie unten erläutert.- Verwenden Sie 6% TBE Polyacrylamid-Gele, um die verstärkte cDNA zu reinigen. Verdünnen Sie die hochauflösende Leiter (HRL) und die kundenspezifische RNA-Leiter (CRL) mit gleichen Mengen an DNA-Ladefarbstoffen.
- Fügen Sie jeder cDNA-Probe 10 l DNA-Ladefarbstoff hinzu. Führen Sie 30 l jeder Probe in zwei getrennten, nebeneinander angrenzenden Bahnen mit CRL und HRL im Zwischenraum zwischen den beiden verschiedenen Proben aus.
- Führen Sie das Gel im 1x TBE Puffer bei 145 V für ca. 30 bis 40 min.
HINWEIS: Behalten Sie den Überblick über die untere blaue Vorderseite des Ladefarbstoffs. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn sie sich dem Boden des Gels nähert. - Übertragen Sie das Gel in 1x TBE Puffer mit Ethidium Bromid (EtBr) bei 0,5 g EtBr/1 mL 1x TBE.
ACHTUNG: EtBr ist ein bekanntes Karzinogen und jeder Schritt von hier bis zur Exzision aus dem Gel sollte mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden. - Visualisieren Sie das Gel in einem Transilluminator und schneiden Sie das Gel genau zwischen dem 145 bp und 160 bp Marker.
HINWEIS: Die Adapterdimere laufen sehr nahe an der 145 bp-Markierung. Schneiden Sie daher das Gel leicht über den 145 bp Marker, um eine Kontamination mit Adapter-Dimer zu vermeiden. - Übertragen Sie das Gel auf DNA-Bruchrohre, die in 2 ml Sammelröhrchen aufbewahrt werden. Drehen Sie bei 20.000 x g für 2 min. Fügen Sie 300 l RNase-freies Wasser hinzu und lassen Sie es sanft auf einer Wippe über Nacht bei RT drehen.
- Um die DNA-Fällung durchzuführen, übertragen Sie am folgenden Tag den Inhalt des Rohres auf 5 m Filterrohre. Drehen Bei 600 x g für 10 s.
HINWEIS: Lassen Sie Die röhrchen länger als 10 s nicht drehen, wenn das Gel durch den Filter geht. - Fügen Sie der eluierten DNA 2 l Glykogen, 30 l 3 M NaOAc, 2 l 0,1x Pelletfarbe und 975 l 100 % Ethanol hinzu. Drehen Sie bei 17.000 x g bei 4°C für 20 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 75% Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen. Drehen Sie bei 17.000 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C, um das Ethanol vollständig zu verdampfen.
- Setzen Sie das Pellet mit 12 l von 10 mM Tris-HCl pH 8.5 wieder auf.
- Führen Sie eine Bibliotheksqualitätsprüfung durch, indem Sie die gereinigte cDNA um 10x (1:10) verdünnen und 1 l verdünnte cDNA verwenden, um auf einem Bioanalysator zu laufen.
- Stellen Sie sicher, dass die cDNA-Produktgröße dem Bereich der kleinen RNA (136-160 bp) im Elektropherogramm entspricht. Berechnen Sie die Gesamtmolarität für jede Probe. Normalisieren Sie jede Probe auf 2 nM mit Tris-HCl pH 8.5.
- Denaturieren und Sequenzen der gereinigten cDNA.
- Bündeln Sie die Bibliotheken, indem Sie die gleichen Volumina jeder 2 nM-Probe in einem einzigen 200-L-PCR-Rohr mischen. Fügen Sie 10 l frisch zubereitete 0,2 N NaOH bis 10 L gepoolte Bibliothek hinzu.
- Mischen Sie sofort durch Wirbel, und drehen Sie bei 280 x g für 1 min. Inkubieren bei RT für 5 min.
- Fügen Sie der denaturierten Bibliothek 10 l von 200 mM Tris-HCl pH-pH-Wert 7 bis 20 l hinzu. Durch Wirbelmischen und bei 280 x g für 1 min drehen.
- Fügen Sie der Bibliothek 970 L vorgefertigten Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch Wirbeln. Die Bibliothek ist mit einer Konzentration von 20 pM. Auf Eis bleiben, bis es schließlich verdünnt wird.
HINWEIS: Die endgültige Verdünnung erfolgt direkt vor dem Ausführen auf Demor. - Fügen Sie 117 L der denaturierten Bibliothek zu 1.183 L des vorgechillten Hybridisierungspuffers hinzu. Mischen Sie durch Invertieren der Röhre und Pulszentrifuge. Die endgültige Konzentration der Bibliothek beträgt nun 1,8 pM.
- Fügen Sie der endgültigen Bibliothek 1,3 l Von PhiX hinzu. Um einen Run auf einen Sequenzer zu initiieren, befolgen Sie die Schritte auf dem Bildschirm auf der Softwareschnittstelle, überprüfen Sie die Ausführungsparameter, einschließlich Lesetyp (einzelner Lesemodus), Leselänge (Anzahl der Zyklen für jeden Lesepunkt), Bibliotheks-ID, und wählen Sie Startaus.
5. Datenanalyse
- Rufen Sie am Ende der Sequenzerausführung die resultierenden Sequenzierungsdaten als fastQ-Dateien ab. Verwenden Sie die entsprechende Software, um die resultierenden Sequenzierungsdaten zu analysieren.
- Öffnen Sie die fastQ-Toolkit-Anwendung und drücken Sie die Launch-Taste.
- Wählen Sie die Dateien aus der Liste der Beispiele in der Software aus und wählen Sie aus, wo die Daten gespeichert werden sollen.
- Fügen Sie einen Zeichenfolgennamen hinzu, der auf jede zugeschnittene Sequenz angewendet wird. Halten Sie die Stringenz auf 0,9. Geben Sie die Adaptersequenz als "TGGAATTCTCGGGCGCCAAGG" vom 3' Ende jeder sequenzierten Probe ein. Erweitern Sie die Registerkarte Lesefilterung, und wählen Sie eine mindeste Leselänge von "5". Wählen Sie das Feld Quittierung aus, und drücken Sie die Taste Weiter, um mit dem Trimmen zu beginnen. Die getrimmten Dateien werden am Ende der Analyse im Projektordner gespeichert.
- Öffnen Sie die kleine ANWENDUNG RNA v.1.0 auf der Software und drücken Sie die Launch-Taste.
- Wählen Sie das Projekt aus, in dem die Dateien gespeichert und nach der Analyse gesendet werden sollen.
- Wählen Sie die Funktion Novel miRs und Differential miRs in der Anwendung aus. Trennen Sie die Gruppen als "Control" und "Test" für die Differentialanalyse und fügen Sie die zugeschnittenen Dateien hinzu, die in ihren jeweiligen Gruppen analysiert werden sollen.
- Wählen Sie die Schaltfläche Starten aus, um die Analyse zu starten. Laden Sie im Anschluss an die Analysen die resultierenden Dateien herunter.
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Representative Results
Die Bibliothek wurde nach der RNA-Isolierung vorbereitet und eine Qualitätsprüfung durchgeführt. Die Gelreinigung für die verstärkte cDNA-Bibliothek, die aus RNA hergestellt wird, die aus mikrosezierten Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen isoliert ist, ist in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellt. Die Produktgröße für adaptor-ligted miRNAs entsprach etwa 136-160 bp für jede Probe. Abbildung 1A-B sind markiert, um den Bereich des Gels zu zeigen, das für die Herstellung kleiner RNA-Bibliotheken genau ausgeschnitten werden sollte. Abbildung 2A-B zeigt die Gelelektrophorese und Elektropherogramme für das mikrosezierte Gewebe und die von Serum abgeleiteten Elektrofahrzeuge. Ergänzende Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Elektrophoresemaschine und das Verfahren zur Berechnung der Molarität.
Es wurden Schritte zum Abrufen der Bibliotheksmetriken vor der Ausführung auf einem Sequenzer ausgeführt. Abbildung 3 zeigt die repräsentativen Metriken aus einem kleinen RNA-Sequenzierungslauf, der die erwartete Clusterdichte, die QC-Punktzahl, den Cluster-Passing-Filter-Prozentsatz sowie die geschätzte Ausbeute und Fehlerquoten demonstriert. Abbildung 3A und Abbildung 3C zeigen die Tabellen mit allen Ausführungsparametern und Diagrammen für die QC-Bewertung über verschiedene Zyklen hinweg. Abbildung 3B,D sind grafische Darstellungen der Fehlerraten für die PhiX-Ausrichtung über verschiedene Zyklen. Die zur Verfügung gestellten Daten stammen aus der Analysesoftware vor Ort.
Eine kommerziell erhältliche Softwareanwendung (Tabelle der Materialien) wurde verwendet, um die sequenzierten Proben aus mikrodissektiertem Gewebe und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen zu analysieren. Die sequenzierten Proben wurden mit dem FASTq-Toolkit von den Adaptersequenzen abgeschnitten, gefolgt von einer Analyse der Anwendung "Small RNA v.1.0". Abbildung 3 zeigt die resultierenden Daten bei der Analyse. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen die Gesamtlesevorgänge aus mikrodissektiertem Gewebe und serumabgeleiteten EVs- Sequenzierungslauf. Abbildung 3Und Abbildung 3B zeigen die kleine RNA-Längenverteilung für die beiden Probenquellen.
Abbildung 1: Bibliotheksvorbereitung zur Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA. Polyacrylamid cDNA Gel für die verstärkten Bibliotheken aus (A) mikrosezierter FFPE-Gewebe-RNA und (B) RNA aus gereinigten Serum-abgeleiteten EVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Qualitätsprüfung für die Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA. Repräsentatives Bild für Gelelektrophorese und Elektropherogramm für gereinigte cDNA-Bibliothek für (A) mikrodissektiertes FFPE-Gewebe und (B) Serum-abgeleitete EVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Führen Sie Metriken für kleine RNA-Sequenzierungsläufe aus. Tabellarische und grafische Darstellung der Ausführungsparameter % Q 30, Clusterdichte, Cluster-Passing-Filter %, geschätzte Ausbeute und Q-Score für Sequenzierungsausführung aus (A) mikrodissektiertem FFPE-Gewebe und (C) Serum-abgeleiteten EVs. Grafische Darstellung der Fehlerraten für die PhiX-Ausrichtung über verschiedene Zyklen für sequenzierende Folgeläufe aus (B) mikrodissektiertem FFPE-Gewebe und (D) Serum-abgeleiteten EVs. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung für die Fehlerraten für jeden Zyklus dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erwartete Ergebnisse eines kleinen nicht-kodierenden RNA-Sequenzierungslaufs. Kleine RNA-Leselängen für Bibliotheken aus (A) Mikrodissektiertem FFPE-Gewebe und (B) Serum-abgeleiteten EVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Beispiel | Sequenzierungslesevorgänge insgesamt |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
Tabelle 1: Gesamtsequenzierungslesungen für einen kleinen RNA-Sequenzierungslauf aus mikrodissektiertem FFPE-Gewebe. Prozentsatz der Lesevorgänge, die kleinen RNAs für sequenzierte FFPE-Proben entsprechen, die nach der Analyse erhalten wurden.
| Beispiel | Sequenzierungslesevorgänge insgesamt |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
Tabelle 2: Die Gesamtsequenzierung liest für einen kleinen RNA-Sequenzierungslauf von gereinigten Serum-abgeleiteten EVs. Prozentsatz der Lesevorgänge, die kleinen RNAs für sequenzierte EV-Proben entsprechen, die nach der Analyse erhalten wurden.
Ergänzende Abbildung 1: Qualitätsprüfung für die Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA. Repräsentative Ergebnisse einer Elektrophorese-Maschine, die die Gesamtmoleizität der angegebenen Probe zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Isolieren von RNA aus FFPE-Geweben und serumabgeleiteten Elektrofahrzeugen mithilfe von Kits, die optimiert wurden, um die Ausbeute und Qualität isolierter RNAs zu erhöhen. Darüber hinaus wurden die gereinigten RNAs verwendet, um cDNA-Bibliotheken für die kleine RNA-Sequenzierung zu generieren. Beide aufgeführten Schritte sind für die Bestimmung der Qualität und Tiefe der Sequenzierungslesevorgänge, die das Endergebnis der Ausführung24sind, von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Optimierung dieser entscheidenden Schritte für einen erfolgreichen Sequenzierungslauf von entscheidender Bedeutung.
Ein wichtiger Schritt in der Isolierung der FFPE-abgeleiteten RNA ist die Verdauung mit Proteinase K, die die Entfernung von vernetztem Formalin aus dem Gewebe ermöglicht. Dieser Schritt wurde durch inkubieren der Probe bei 55 °C und 80 °C für jeweils ca. 16-18 min optimiert. Dies führte zu einer effektiven Erhöhung der Qualität isolierter RNA durch eine Erhöhung des Verhältnisses von 260/280. Sequenzierungslesevorgänge sind häufig für eine Ausführung variabel, die mehrere Beispiele enthält. Daher ermöglicht die Kontrolle der Menge der RNA-Eingänge zu Beginn der Bibliotheksvorbereitung die Gleichmäßigkeit der Bibliothek. Die Verwendung normalisierter RNA hilft bei der Nivellierung eines Sequenzierungslaufs gleichmäßig über verschiedene Proben hinweg. Der wichtigste Schritt bei der Bibliotheksvorbereitung ist die Reinigung von verstärkten Adapter-ligted cDNAs. Es ist sehr wichtig, die Gele sorgfältig über dem 140 bp Marker zu verbrauchen, da eine leichte Abweichung zur Unterseite des Markers zu einer Kontamination der Adapterdmere führt. Schließlich ist die Normalisierung der cDNA-Bibliothek der wichtigste Schritt des Sequenzierungsprotokolls und sollte auf der Grundlage der berechneten Normalität der Elektrophoresemaschine genau erfolgen.
Im Falle einer Adapterdimerkontamination kann man die gereinigte Bibliothek auf einem TBE-Gel erneut ausführen und das gewünschte Produkt repurifizieren. Die Ausbeute der cDNA-Bibliothek bei einer solchen Extraktion ist jedoch signifikant verringert, was sich auf die Leselänge der Probe auswirken kann. Für eine Schätzung der Konzentration der gereinigten cDNA-Bibliothek kann man die Proben verdünnen, bevor sie auf der Elektrophoresemaschine laufen, basierend auf der Produktintensität in den TBE-Gelen und verschiedene Verdünnungen (d. h. 5x, 10x oder 25x) zubereiten. Um die Schätzung der gereinigten cDNA-Bibliotheken weiter zu verbessern, hilft die Ausführung einer qPCR zusätzlich zur Elektrophorese, Vorlagenebenen zu bewerten und ermöglicht eine genauere Normalisierung.
Obwohl die Ultrazentrifugation der Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Quellen ist, schränkt eine geringere Ausbeute der Partikel aus einer solchen Extraktion häufig den Einsatz dieser Methode bei Reinigungs-EVs ein, bei denen das Ausgangsmaterial begrenzt ist und eine erhebliche Menge von Input-RNA für nachgeschaltete Anwendungen benötigt wird. So bietet die Verwendung des gesamten exosomen Isolationsreagenz eine viel schnellere und höhere Ausbeute methode für die EV-Isolierung aus begrenzten Quellen wie Serum und Plasma aus klinischen Proben.
Insgesamt beschreibt dieses Protokoll die Methoden zur zeiteffektiveren Generierung von cDNA-Bibliotheken unter Berücksichtigung der Ausbeute und Qualität der cDNA-Bibliotheken, um genaue und umfassende Sequenzierungslesevorgänge zu erhalten. Angesichts des Potenzials von Exosomen als Quelle von Krebsbiomarkern wird diese Methode für die Next Generation-Sequenzierung (NGS) Analysen des exosomalen miRNA-Gehalts für die Forschung auf diesem Gebiet hilfreich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der US Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA) durch den Idea Development Award unter dem Award Nr. W81XWH-18-1-303 und W81XWH-18-2-0013 und zusätzlich durch Award-Nr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 und W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Die Förderung des Autorenlabors durch das National Cancer Institute der National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984) wird ebenfalls anerkannt. Rajvir Dahiya ist Senior Research Career Scientist am Department of Veterans Affairs, BX004473 und finanziert von NIH-UO1CA199694 (RD). Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium oder der US-Armee unterstützt. Wir danken Judy Shigenaga, Direktorin der Kernanlage bei San Francisco VAMC, für ihre Unterstützung mit dem NextSeq 500 Sequenzer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
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