Summary
治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。
Abstract
アンドロゲン剥奪によるアンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達のアブレーションは、最初に癌の退行をもたらす前立腺癌の治療の最初のラインの目標です。しかし、かなりの数の症例において、疾患は進行した去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)に進行し、治療の選択肢が限られており、しばしば攻撃的である。遠い転移は、主に攻撃的な疾患のこの段階で観察される。CRPCは、最初は生存を改善する第2世代のAR経路阻害剤によって治療され、その後、治療抵抗性の出現が続く。神経内分泌前立腺癌(NEPC)は、しばしば神経内分泌分化(NED)として知られているトランス分化プロセスを介して治療抵抗性の結果として発症する前立腺癌(PCa)の稀な変異体であり、PCa細胞は系統スイッチを受ける腺癌から、神経内分泌(NE)系統マーカーの発現の増加を示す。NEPCへの進行とトランス分化を促進するゲノム変化に加えて、エピジェネティックな要因と微小環境の手掛かりは、疾患の進行を促進する上で不可欠なプレーヤーと考えられています。この原稿は、高度なPCaに関連するエピジェネティックドライバ(すなわち、小さな非コーディングRNA)を識別するための詳細なプロトコルを提供します。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)転移組織および対応する血清由来細胞外小胞(EV)からの精製マイクロRNAを使用して、プロトコルはシーケンシングのための適切な品質管理を備えたライブラリを準備する方法を記述するこれらのサンプルソースからのマイクロRNA。FFPE と EV の両方から RNA を分離することは、ほとんどの RNA が劣化しているか、または量が制限されているため、多くの場合困難です。このプロトコルでは、RNA入力とcDNAライブラリを最適化して、シーケンス時に最も具体的な読み取りと高品質のデータを得るためのさまざまな方法について詳しく説明します。
Introduction
前立腺癌は、ARシグナル伝達を介して作用するアンドロゲンによって駆動される。従って、AR経路を標的とすることは、疾患1の主力治療法である。しかし、耐性は、標的療法の結果としてしばしば起こり、疾患は進行性転移性CRPC2に進行する。CRPCは、エンザルタミドとアビラテロン2、3を含む第2世代のAR療法によって治療され、最初は生存を改善する。しかし、NEPCのような致死的な変異体は、治療オプションが限られている治療CRPC症例の25~30%に出現することが多く、死亡率3の増加につながる。NEPCは、NEDとして知られる可逆的トランス分化プロセスを介して生じ、ここでPCa細胞は腺癌からの系統スイッチを受け、ARの発現の減少およびエノラーゼ2(ENO2)、クロクロニンA(CHGA)、およびシナプトフィシン(SYP)4を含むNE系統マーカーの発現の増加を示す。これらの耐性変異体が治療介入の結果として生じることを考えると、PCaの治療が困難なこの致命的な、治療が困難な生成につながる経路を解読することが不可欠である。
NEPCのゲノムは最近、Beltranらによって行われた徹底的な研究で解読され、それによってコピー数の変化、突然変異、単一ヌクレオチド多型(SN)、および患者由来転移組織からのDNAメチル化が分析された5。この積極的な形態のPCaのゲノムの理解が著しく進歩しているにもかかわらず、CRPC-腺癌からNEPCへの移行に関与する小さな非コードRNA(microRNA)を含むエピジェネティックな要因についてはほとんど知られていない。マイクロRNA(miRNA)は、コグネイトmRNA標的6の3'-非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用によって主に転写後の遺伝子発現を抑制することによって作用する22bp長い、二本鎖RNAである。いくつかの腫瘍および腫瘍抑制剤が同定され、疾患発症および転移を調節するその役割は、異なる癌6、7においてよく研究されている。これらの小さな非コーディングRNAは、多くの場合、疾患死亡率6、8、9を制御する上で非常に重要なターゲットとして機能します。最近の研究は、エキソソームのようなEVにおける輸送を介した癌転移におけるmiRNAのパラクリン効果を理解することに焦点を当てており、その血流中を流れ、腫瘍細胞がこれらの二次メッセンジャーをヌクレアーゼフリー環境10、11、12の転移位置に送ることを可能にする。EVは、宿主細胞12から形容作用を伝達するために腫瘍細胞からmiRNAを運ぶ。したがって、腫瘍細胞の二次メッセンジャーとしてのEVの同定は、疾患重症度の非侵襲的検出に有用である可能性がある。
miR-1246は、積極的なPCaからEVで高度にアップレギュレーションされ、疾患重症度13を示す。これらのEV関連miRNAは、疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能するだけでなく、腫瘍形成を駆動する上で機能的に重要な役割を果たす。したがって、非侵襲的バイオマーカーとその機能的意義をより良く同定できるように、PCaの耐性形態に関連するmiRNAレパートリーの意義を理解することが不可欠です。
次世代シーケンシングの出現は、突然変異、染色体転位、染色体上昇、メチル化などのゲノムの変化を含む腫瘍景観の詳細を研究するための最も包括的なプラットフォームを提供し、そのすべてが癌14、15、16の形態および性質に大きく寄与する。同様に、腫瘍細胞で起こり、疾患重症度17の重要なプレーヤーであることが多い膨大なエピゲノム変化を理解することも不可欠なツールです。NEPCの生成に関連するmiRNAレパートリーを理解することを目的として、FFPE転移CRPC組織およびそれに対応する血清由来EVに対して小さなRNAシーケンシングを行った。これら2つのサンプル源のいずれかに由来するRNAは、(1)収率が低く、(2)ホルマリン固定およびEV分離のためにしばしば起こる劣化による悪品質である。さらに、cDNAライブラリの生成は、シーケンス実行の重要ですが、面倒なステップです。したがって、これらのRNAを分離し、それらを使用して小さなRNAシーケンシング用のライブラリを生成する方法は、正確で信頼性の高いデータを生成するための最適化が必要です。
RT-PCR、マイクロアレイ、インシトゥハイブリダイゼーション(ISH)など、さまざまなサンプルでmiRNA発現をプロファイリングする方法がいくつかあります。FFPE組織由来RNAを用いてRT-PCRおよびISHによるmiRNA発現を評価するプロトコルが最近公開された18.最近の技術は、サンプルでmiRNA発現をプロファイリングするためのより包括的で包括的なプラットフォームを提供します。NanoString nCounterは、感度の高いmiRNA検出プラットフォーム19を提供していますが、検出は、多くの場合、アレイで利用可能なmiRNAの数(〜2,000)によって制限されます。このようなシナリオでは、次世代シーケンシングのようなより敏感で網羅的なプラットフォームは、異なるサンプル20におけるmiRNA同定および同時プロファイリングのはるかに広い深さを提供する。この方法は、PCa患者21、22、23からの尿または血漿中のmiRNAシグネチャを決定するために使用されている。現在の記事では、FFPE組織と血清由来EVRNAを使用して積極的なCRPCに関連するmiRNAプロファイルを研究するために、次世代シーケンシングプラットフォームを使用するプロトコルが提示されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は、米国共通規則の倫理指針に従って行われ、人間研究に関する機関委員会によって承認された。
1. マイクロダイセクション
注:腺癌特徴(CRPC-アデノ)またはNE分化(CRPC-NE)を有するFFPE転移性CRPC組織は、前立腺癌バイオレポジトリネットワーク(PCBN)から得られた。ガラススライド上の10ミクロンPCaセクションは、前に説明したように手動マイクロダイセクションのために調製された18.簡単に要約するには:
- シレン(それぞれ2x、10分)にスライドを浸すことによって組織切片を脱パラフィン化する。次いで、等級エタノール(100%、95%、90%、80%、70%)でスライドを5分間インキュベートし、続いて蒸留水洗浄とヘマトキシリン(30s浸漬)で染色して切除を行った。
- ヘマトキシリン染色後、組織切片を水で洗浄する。次いで、等級エタノール(70%、80%90%、95%、100%)に入れて組織切片を脱水する(各5分)の後にキシレン(5分)が続く。
- 対応するヘマトキシリンとエオシン(H&E)スライドを分析し、腫瘍領域(すなわち、腺癌またはNED)を特定し、ボード認定病理学者の助けを借りてこれらの腫瘍領域および正常隣接領域をマークします。これらのH&Eスライドをロードマップとして使用し、腫瘍と正常領域を区別するために、上記のステップで得られたヘマトキシリン染色組織をマークします。
- メスの刃を使用して顕微鏡の下でマークされたティッシュスライドを慎重に解剖する。
- 静電電荷ゲルローディングピペットチップを使用して、別々のチューブ内の正常および癌領域から解剖された組織を収集します。荷電した先端は解剖されたティッシュを引き付け、解剖後の最大の組織回復を可能にする。ティッシュが荷電した先端に付い込んだら、先端を空の2 mLの採取管に切り取ります。
2. 血清由来EVの分離
注:腺癌特性(CRPC-アデノ)またはNE分化(CRPC-NE)を有する転移性CRPC患者から採取された凍結患者血清サンプルを、承認されたIRBプロトコルを用いてPCBNから調達し、使用前に-80°Cで保存した。血清サンプルは、対応する組織と血清由来のEVとの比較を可能にするために、マイクロ解剖組織に使用されるものと同じ患者のセットから収集された。市販の血清EV単離試薬を用い、EVを回収した。
- 4°Cで凍結患者血清サンプルを解凍する。
- 解凍した血清サンプルを110μL使用し、2,000 x gで30分間スピンします。
- その後のEV/エキソソーム分離のために上清を収集し、破片ペレットを廃棄します。上清に30μLの血清エキソソーム単離試薬を加え、4°Cで30分間インキュベートします。
- 10,000 x gで 10 分間スピンします。
- EVペレットをヌクレアーゼフリーウォーターで調製したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の70°Lで再サスペンドします。パーティクルトラッキング解析システムのアリコートを保持して、パーティクルの品質と数を評価します。さらに分析するまで、残りのサンプルを-80°Cに保管します。
3. マイクロ分剖された前立腺組織およびEVからのRNA分離
注:総RNAは、いくつかの変更を加えたメーカーの指示に従って市販のキット(材料の表)を使用して、マイクロセク剖された組織および精製EVから分離された。次のセクションでは、重要な手順に特に重点を置いて、これらの手順について簡単に説明します。
- RNAをマイクロセク剖組織から分離します。
- マイクロセク剖されたFFPE組織を150μLのプロテイナーゼK緩衝液に再差し込む。渦を混ぜて、先端から残留組織をピペットします。11,000 x gで 1 分間スピンします。
- ペレットに10μLのプロテイナーゼKを加えます。ペレットが白くなるまで2分間待ちます。ピペットは数回上下します。
- 56 °Cで16分間渦を3分ごとにインキュベートします。
- サンプルを取り出し、ヒートブロックが80°Cに達します。ブロック上のサンプルを3分ごとに16分間インキュベートします。
- 氷の上で3分間インキュベートする。
- 20,000 x gで 15 分間スピンし、上清を新しい 2 mL チューブに移します。
- DNaseブースターバッファ16μLを加え、その後10°LのDNase I.ミックスを加え、チューブを穏やかに反転させ、室温(RT)で15分間インキュベートします。
- 320 μL の赤血球 (RBC) リシス バッファーを追加します。チューブを反転して混合し、100%エタノールの1,120°Lを加えます。4 °Cで保存されたスピンカラムで直ちに転送します。30 s の場合は 8,000 x gでスピンします。
- カラム2xを洗浄バッファで洗浄し、カラムを20,000 x gで5分間回転させ、残留洗浄バッファを除去します。
- スピンカラムを2~3分間空気乾燥させ、19°LのRNaseフリー水で溶出します。分光光度計で精製されたRNAを定量し、サンプルを40ng/μLに正規化します。
- 血清由来EVからのRNA分離。
- キットを使用してエキソソームRNAを分離します。精製EV懸濁液の75μLの溶解バッファーAと9.3μLの溶解バッファーBを50μLに加えます。
注:約10分間チューブを反転させてサンプルを混合し続け、EVの完全なリシスを可能にします。 - 100%エタノールの130°Lを加え、サンプルを反転してすぐに混合します。スピンカラムで転送し、3,300 x gで1分間回転させます。
- カラム2xを洗浄バッファで洗浄します。カラムを1,300 x gで3分間回転させ、洗浄バッファを完全に取り除きます。
- カラムを2分間空気乾燥させます。
- キットに含まれている溶出バッファーを使用してステップ 3.2.4 を繰り返し、サンプルからの RNA の収率を高します。
- 分光光度計でサンプルを定量し、40 ng/μLに正規化します。
- キットを使用してエキソソームRNAを分離します。精製EV懸濁液の75μLの溶解バッファーAと9.3μLの溶解バッファーBを50μLに加えます。
4. 小さなRNAシーケンシングのためのライブラリの準備
注:小さなRNAライブラリ準備キット(材料表)を使用して、単離されたRNAサンプルからcDNAライブラリを生成しました。シーケンサーで実行する前にライブラリを生成、浄化、および品質チェックする手順は、最終的に実行からの出力データの品質を決定するシーケンス プロトコルにとって重要です。したがって、各ステップを慎重に進める。メーカーからのガイドラインは、RNAの最低50 ngを使用することをお勧めします。通常、これら2つのサンプルソースから得られる総RNAの品質が低く、少量の低い場合、このプロトコルは100ngの低いRNA濃度に最適化されます。以下のプロトコルは、ライブラリの 1 つのサンプル用です。
- アダプター・リゲード cDNA を生成します。
- 正規化された(40 ng/μL)RNAサンプルの5μLを使用します。3'アダプタの1 μLを追加します。サンプルをインキュベートする前に、サーマルサイクラーを70°Cに予熱します。2分間インキュベートします。次のステップに進む前に、すぐに氷上でサンプルを移します。
- 別のチューブに、2μLのライゲーション緩衝液、1μLのRNase阻害剤、およびT4 RNAリガーゼ2の1μLを混合し、欠失変異体である。上下にピペットで混合し、RNA/3'アダプタを使用してこのミックスの4°Lをチューブに追加します。
- 28°Cに予熱したサーマルサイクラーに移し、1時間インキュベートする。
- サーマルブロックにサンプルを保持したまま、1μLのストップ溶液を追加します。さらに15分間28°Cでインキュベートする。
- チューブを取り外し、このステップの直後に氷の上に保ちます。
- 別のチューブに5'アダプタの1 μLを追加します。
- 70°Cに予熱したサーマルサイクラーに移し、2分間インキュベートする。
- すぐにチューブを氷の上に置き、アダプターの再焼鈍を防ぎます。
- 変性5'アダプタのチューブに10 mM ATPの1 μLを追加します。ピペットで混合し、T4 RNAリガーゼを1μL加えます。ピペットで混合し、この混合物の3μLを3'アダプタライゲーションRNAを含むチューブに追加します。28°Cに予熱したサーマルサイクラーで転写し、1時間インキュベートします。
- 直ちに氷に移し、サンプルをさらに進めるか、後で使用するために-20°Cで保管してください。
- RT-PCR を実行するには、各アダプター・リゲード RNA の 6 μL を使用し、それに 1 μL の RNA RT プライマーを追加します。70°Cに予熱したサーマルサイクラーに移す。2分間インキュベートします。
- 別のチューブに、5xストランドバッファーの2μL、12.5 mM dNTPの0.5 μL、100 mM DTTの1μL、RNase阻害剤の1μL、および逆転写酵素の1μLを混合します。このミックスの5.5°Lをアダプター・ライゲーテッドRNAに加え、50°Cに予熱したサーマルサイクラーに移します。1時間インキュベートする。
- アダプター・ライゲード cDNA を直ちに氷に移します。
- 別のチューブに、PCRミックスの25μL、RNA PCRプライマーの2°L、RNA PCRプライマー指数の2°L、およびRNaseフリー水の8.5 μLを混合します。このミックスの37.5 μLを12.5 μLのアダプター・ライゲードcDNAに加えます。98°Cに予熱したサーマルサイクラーに移す。製造元のプロトコルで提案されているように、サーマル サイクラーをプログラムし、サイクル番号を 11 ではなく 15 に変更します。
注:使用されるすべてのプライマーのシーケンスは、材料の表 の下にリストされています。 - 完了後、サンプルを4°Cに保ちます。将来の使用のために-80 °Cでそれらを進めるか、保存します。
- リゲードされたcDNAの品質管理を浄化し、実行します。
注:増幅されたcDNAは、以下に説明するように精製されたcDNAサンプルの品質および収量を改善するためにいくつかの変更を除いて、製造業者のプロトコルに従ってゲル精製した。- 6%TBEポリアクリルアミドゲルを使用して、増幅されたcDNAを精製します。高解像度ラダー(HRL)とカスタムRNAラダー(CRL)を同じ量のDNAローディング染料で希釈します。
- 各cDNAサンプルに10μLのDNAローディング色素を追加します。各サンプルの 30 μL を、2 つの異なるサンプル間の中間空間で CRL と HRL を使用して、互いに隣接する 2 つの別々のレーンで実行します。
- 145 V で 1x TBE バッファーで約 30~40 分間ゲルを実行します。
注:ローディング染料の下青の前面を追跡します。ゲルの底部に近づくと電気泳動を停止します。 - ゲルを臭化エチジウム(EtBr)を0.5μg EtBr/1 mL 1x TBEで1x TBE緩衝液で転写します。
注意:EtBrは既知の発癌物質であり、ここからゲルからの切除までの各ステップは細心の注意を払って行われるべきである。 - トランスイルミネーターでゲルを可視化し、145 bpと160 bpマーカーの間でゲルを正確に切断します。
注:アダプターダイマーは145 bpマーカーに非常に近い走ります。したがって、アダプターダイマーによる汚染を避けるために、145 bpマーカーの少し上のゲルをカットします。 - ゲルを2mLの採取管に保持されたDNA破断管に移す。20,000 x gで2分間スピンし、RNaseフリー水を300°L加え、RTでロッカーで一晩軽く回転させます。
- DNA沈殿を行うために、翌日にチューブの内容物を5μmフィルターチューブに移す。600 x gで 10 s 回転します。
注:ゲルがフィルターを通過する場合、チューブを10sより長く回転させないでください。 - 溶出したDNAに2μLのグリコーゲン、3M NaOAcの30°L、0.1xペレット塗料の2°L、100%エタノールの975°Lを加えます。4°Cで17,000 x gで20分間スピン。
- 上清を捨て、75%のエタノールを加え、ペレットを洗浄します。17,000 x gで5分間4°Cでスピンし、上清を廃棄し、37°Cでチューブをインキュベートしてエタノールを完全に蒸発させます。
- 10 mM Tris-HCl pH 8.5の12°Lでペレットを再サスペンドします。
- 精製したcDNAを10倍(1:10)希釈し、1μLの希釈cDNAを使用してバイオアナライザ上で実行することにより、ライブラリ品質チェックを実行します。
- cDNA製品のサイズがエレクトロフェログラムの小さいRNA(136−160 bp)の範囲に対応していることを確認してください。各サンプルの合計モル率を計算します。Tris-HCl pH 8.5を使用して、各サンプルを2nMに正規化します。
- 精製されたcDNAの変性および配列。
- 各2 nMサンプルの等量を単一の200°L PCRチューブに混合して、ライブラリをプールします。作りたての0.2 N NaOHを10°Lのプールライブラリに加えます。
- ボルテックスですぐに混ぜ、280 x gで1分間回転させ、RTで5分間インキュベートします。
- 変性ライブラリーの200 mM Tris-HCl pH 7~20°Lの10μLを加えます。ボルテックスで混ぜ、280 x gで1分間回転させます。
- 970°Lのプレチルドハイブリダイゼーションバッファをライブラリに追加し、ボルテックスでよく混ぜます。図書館は20pMの濃度にある。最終的に希釈されるまで氷の上に置いておきなさい。
注:最終的な希釈は、シーケンサーで実行する直前に行われます。 - 変性ライブラリーの117 μLを、プレチルドハイブリダイゼーションバッファーの1,183°Lに加えます。チューブとパルス遠心分離機を反転して混ぜます。図書館の最終的な濃度は現在1.8 pMです。
- 最終ライブラリの1.3 mLにPhiXの1.3 μLを追加します。シーケンサーでの実行を開始するには、ソフトウェア インターフェイスの画面の手順に従って、読み取りタイプ (単一読み取り)、読み取り長 (読み取りごとにサイクル数)、ライブラリ ID、および [開始]を含む実行パラメータを確認します。
5. データ分析
- シーケンサーの実行の最後に、結果のシーケンス データを fastQ ファイルとして取得します。適切なソフトウェアを使用して、結果として得られるシーケンスデータを分析します。
- fastQ ツールキット アプリケーションを開き、[起動]ボタンを押します。
- ソフトウェアのサンプルのリストからファイルを選択し、データを保存する場所を選択します。
- トリミングされた各シーケンスに適用される文字列名を追加します。ストリンジェンシーを 0.9 に保ちます。アダプター・シーケンスを、各シーケンス・サンプルの 3' 末端から「TGGAATTCTCGGGTGTCAAGG」としてトリムするように入力します。[読み取りフィルタ]タブを展開し、最小読み取り長 "5" を選択します。[確認]ボックスを選択し、[続行]ボタンを押してトリミングを開始します。トリミングされたファイルは、解析の終了時にプロジェクト フォルダに保存されます。
- ソフトウェアで小さなRNA v.1.0アプリケーションを開き、起動ボタンを押します。
- 解析後にファイルを保存して送信するプロジェクトを選択します。
- アプリケーションで新規ミルおよび差動ミル機能を選択します。差分分析のためにグループを "制御"および"Test"として分離し、分析するトリミングされたファイルをそれぞれのグループに追加します。
- 分析を開始するための[起動]ボタンを選択します。解析に従って、結果のファイルをダウンロードします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ライブラリは、RNA分離後に調製し、品質チェックを行った。マイクロセク剖組織および血清由来のEVから単離されたRNAから調製した増幅cDNAライブラリーのゲル精製を図1および図2に示す。アダプター・リゲード miRNA の製品サイズは、サンプルごとに約 136−160 bp に対応しました。図1A-Bは、小さなRNAライブラリー調製のために正確に取除化されるべきゲルの範囲を示すためにマークされている。図2A-Bは、マイクロセク剖組織および血清由来EVに対するゲル電気泳動およびエレクトロフェログラムを示す。補足図1は、電気泳動機からの代表的な結果とモルラリティを算出する方法を示す。
シーケンサーで実行する前にライブラリ メトリックを取得する手順を実行しました。図 3は、予想されるクラスター密度、QC スコア、クラスター パッシング フィルターの割合、および推定歩留まりとエラー率を示す小さな RNA シーケンス実行からの代表的なメトリックを示しています。図3Aおよび図3Cは、異なるサイクルにわたるQCスコアのすべての実行パラメータとグラフを含む表を示しています。図3B,Dは、異なるサイクルにわたるPhiXアライメントの誤差率をグラフィカルに表したものです。提供されるデータは、オンサイト分析ソフトウェアから提供されます。
市販のソフトウェアアプリケーション(材料表)を用いて、マイクロセク剖組織および血清由来EVから配列サンプルを分析した。配列サンプルは、FASTqツールキットを使用してアダプタシーケンスからトリミングし、続いて「小型RNA v.1.0」アプリケーションで分析しました。図 3は、分析時の結果データを示しています。表1及び表2は、マイクロセク剖組織及び血清由来EVシーケンシング実行からの総読み取りを示す。図3Aおよび図3Bは、2つのサンプルソースの小さなRNA長分布を示す。
図1:小さな非コーディングRNAをシーケンシングするためのライブラリ準備。(A)マイクロセク剖されたFFPE組織RNAおよび(B)RNAからの増幅ライブラリーのためのポリアクリルアミドcDNAゲルは、精製された血清由来のEVから得られる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小さな非コーディングRNAをシーケンスするための品質チェック(A)マイクロセクサダイドFFPE組織および(B)血清由来EVに対する精製cDNAライブラリーのゲル電気泳動およびエレクトロフェログラムの代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 小さい RNA シーケンス実行のメトリックを実行します。実行パラメータ % Q ≥30、クラスター密度、クラスター パッシング フィルタ %、推定歩留まり、および(A)マイクロセク剖 FFPE 組織および (C) 血清由来 EV からのシーケンス実行の Q スコアの表形式およびグラフィカル表現。(B) マイクロセク剖 FFPE 組織および (D) 血清由来 EV からのシーケンス実行のための異なるサイクルにわたる PhiX アライメントの誤差率をグラフィカルに表現します。誤差バーは、各サイクルの誤差率の標準偏差を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 小さな非コーディング RNA シーケンシング実行から予想される結果。(A) マイクロセク剖された FFPE 組織および (B) 血清由来の EV からのライブラリの小さな RNA 読み取り長さ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | シーケンス読み取りの合計 |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
表1:マイクロセク剖FFPE組織からの小さなRNAシーケンシング実行の総シーケンシング読み取り。分析後に取得されたシーケンス化された FFPE サンプルの小さい RNA に対応する読み取りのパーセンテージ。
| サンプル | シーケンス読み取りの合計 |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
表 2: 精製された血清由来の EV からの小さな RNA シーケンシング実行の合計シーケンス読み取り。分析後に得られた配列EVサンプルの小さなRNAに対応する読み取りのパーセンテージ。
補足図1:小さな非コーディングRNAをシーケンシングするための品質チェック。示されたサンプルの全モルラティを示す電気泳動機械の実行からの代表的な結果。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この記事では、単離されたRNAの収率と品質を高めるために最適化されたキットを使用して、FFPE組織および血清由来EVからRNAを分離するプロトコルについて説明します。さらに、精製されたRNAを用いて、小型RNAシーケンシング用のcDNAライブラリーを生成した。リストされている両方のステップは、実行24からの最終結果であるシーケンス読み取りの品質と深さを決定する際に不可欠です。したがって、これらの重要な手順を最適化することは、シーケンス実行を成功させるために不可欠です。
FFPE由来RNAの単離における重要なステップは、組織からの架橋ホルマリンの除去を可能にするプロテイナーゼKによる消化である。このステップは、サンプルを55°Cおよび80°Cで約16−18分間インキュベートすることによって最適化された。これは、260/280比の増加によって単離されたRNAの品質の効果的な増加をもたらした。読み取りの順序付けは、多くの場合、複数のサンプルを含む実行の変数です。したがって、ライブラリー調製の開始時に RNA 入力の量を制御すると、ライブラリーの均一性が可能になります。正規化された RNA を使用すると、シーケンス実行を異なるサンプル間で均一に平準化するのに役立ちます。ライブラリ調製の最も重要なステップは、増幅されたアダプターの合体化されたcDNAの精製である。マーカーの底部に向かってわずかなずれがアダプターダイマーの汚染につながるので、140 bpマーカーの上のゲルを慎重に取除きることは非常に重要です。最後に、cDNAライブラリの正規化は、シーケンシングプロトコルの最も重要なステップであり、電気泳動マシンから計算された正規性に基づいて正確に行われるべきです。
アダプターダイマー汚染の場合、TBEゲル上で精製されたライブラリーを再実行し、目的の製品を再精製することができます。しかしながら、このような抽出におけるcDNAライブラリーの収率は著しく低下し、試料からの読み取り長さに影響を及ぼす可能性がある。精製されたcDNAライブラリの濃度に関する見積もりでは、TBEゲル中の製品強度に基づいて電気泳動機械で実行する前にサンプルを希釈し、異なる希釈(すなわち、5x、10x、または25x)を調製することができます。精製されたcDNAライブラリの推定をさらに改善するために、電気泳動に加えてqPCRを実行すると、テンプレートレベルを評価し、より正確な正規化が可能になります。
超遠心分離は異なるソースからのEVの絶縁のための金本位であるが、このような抽出からの粒子の低収率は、多くの場合、出発物質が限られており、かなりの量であるEVを精製する上で、この方法の使用を制限するダウンストリーム アプリケーションには入力 RNA が必要です。したがって、全エキソソーム単離試薬の使用は、臨床サンプルからの血清および血漿のような限られた供給源からのEV分離のためのはるかに速く、より高い収率方法を提供する。
全体として、このプロトコルは、正確で包括的なシーケンシング読み取りを得るために、cDNAライブラリの歩留まりと品質を考慮しながら、より効果的な方法でcDNAライブラリを生成する方法を詳しく説明します。がんバイオマーカーの供給源としてのエキソソームの可能性を考えると、次世代のシーケンシング(NGS)分析のためのエキソソームmiRNA含有量の分析は、この分野での研究に役立ちます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、米国陸軍医学研究買収活動(USAMRAA)が、受賞番号のアイデア開発賞を通じて支援しています。W81XWH-18-1-303およびW81XWH-18-2-0013およびさらに賞番号によって。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0019前立腺癌バイオリポジトリネットワーク(PCBN)。国立衛生研究所の国立がん研究所(助成金番号RO1CA177984)による著者研究室への資金援助も認めされています。Rajvir Dahiyaは、BX004473退役軍人省のシニアリサーチキャリアサイエンティストであり、NIH-UO1CA199694(RD)の資金提供を受けています。意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省または米国陸軍によって承認されるものではありません。サンフランシスコVAMCの中核施設ディレクターであるジュディ・シゲナガ氏が、NextSeq 500シーケンサーの支援をいただいたことに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
- Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
- Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
- Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).
- Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
- Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
- Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
- Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
- Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
- Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
- Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
- Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).
- Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).
- Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).
- Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).
