Summary
La résistance de thérapie se développe souvent dans les patients présentant le cancer de la prostate avancé, et dans certains cas, le cancer progresse à un sous-type mortel appelé cancer de la prostate neuroendocrine. L'évaluation des petits changements moléculaires non codants à médiation d'ARN qui facilitent cette transition permettrait une meilleure stratification de la maladie et l'identification des mécanismes causals qui mènent au développement du cancer de la prostate neuroendocrine.
Abstract
L'ablation du récepteur d'androgène (AR) signalant par la privation d'androgène est l'objectif de la première ligne de thérapie pour le cancer de la prostate qui a d'abord comme conséquence la régression de cancer. Cependant, dans un nombre significatif de cas, la maladie progresse au cancer de la prostate avancé et résistant à la castration (CRPC), qui a des options thérapeutiques limitées et est souvent agressif. La métastes lointaine est la plupart du temps observée à ce stade de la maladie agressive. Le CRPC est traité par une deuxième génération d'inhibiteurs de voie d'AR qui améliorent la survie au commencement, suivis par l'émergence de la résistance de thérapie. Le cancer neuroendocrinien de la prostate (NEPC) est une variante rare du cancer de la prostate (PCa) qui se développe souvent en raison de la résistance de thérapie par l'intermédiaire d'un processus de transdifférenciation connu sous le nom de différenciation neuroendocrine (NED), où les cellules de PCa subissent un commutateur de lignée des adénocarcinomes et montrent l'expression accrue des marqueurs de lignée neuroendocrine (NE). En plus des altérations génomiques qui conduisent la progression et la transdifférenciation au NEPC, les facteurs épigénétiques et les indices microenvironnementaux sont considérés comme des acteurs essentiels dans la progression de la maladie. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour identifier les facteurs épigénétiques (c.-à-d. les petits ARN non codants) qui sont associés à la PCa avancée. À l'aide de microARN purifiés provenant de tissus métastatiques paraffinés à base de paraffines (FFPE) et de vésicules extracellulaires (VEV) dérivées du sérum correspondant, le protocole décrit comment préparer les bibliothèques à un contrôle de qualité approprié pour le séquençage microARN provenant de ces sources d'échantillons. L'isolat de l'ARN de la FFPE et des véhicules électriques est souvent difficile parce que la plupart de celui-ci est soit dégradé ou est limité en quantité. Ce protocole élaborera sur différentes méthodes pour optimiser les entrées d'ARN et les bibliothèques d'ADNc pour produire la plupart des lectures spécifiques et des données de haute qualité au niveau du séquençage.
Introduction
Le cancer de la prostate est entraîné par des androgènes agissant par l'intermédiaire de la signalisation AR. Par conséquent, le ciblage de la voie AR est le traitement principal de la maladie1. Cependant, la résistance s'ensuit souvent à la suite de thérapies ciblées et la maladie progresse à un CRPC métastatique avancé2. CRPC est traité par la deuxième génération de thérapie d'AR qui inclut l'enzalutamide et l'abiraterone2,3 qui améliore la survie au commencement. Cependant, des variantes mortelles telles que NEPC émergent souvent dans 25-30% des cas traités de CRPC qui ont des options limitées de traitement, menant à la mortalité accrue3. NEPC se pose par un processus de transdifférenciation réversible connu sous le nom de NED, dans lequel les cellules PCa subissent un commutateur de lignée de l'adénocarcinome et montrent une diminution de l'expression de l'AR et l'expression accrue des marqueurs de lignée NE, y compris l'enolase 2 (ENO2), la chromoscine A (CHGA), et la synaptophyse (SYP)4. Étant donné que ces variantes de résistance résultent d'interventions thérapeutiques, il est essentiel de déchiffrer les voies qui mènent à la génération de cette forme mortelle et difficile à traiter de PCa.
La génomique de NEPC a été récemment déchiffrée dans une étude exhaustive faite par Beltran et autres par laquelle des altérations de nombre de copie, des mutations, des polymorphismes de nucléotide simples (SNPs), et la méthylation d'ADN des tissus métastatiques patient-dérivés ont été analysés5. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension de la génomique de cette forme agressive de PCa, on sait peu de choses sur les facteurs épigénétiques, y compris les petits ARN non codants (microARN) qui sont impliqués dans la transition de CRPC-adénocarcinome à NEPC. Les microARN (miARN) sont 22 bp de long, double brin RNAs qui agissent principalement en supprimant l'expression des gènes post-transcriptionnellepar par des interactions séquence-spécifiques avec les régions 3'-non traduits (UTR) des cibles d'ARNm cognate6. Plusieurs oncomiRs et suppresseurs de tumeur ont maintenant été identifiés, et leur rôle dans la régulation de l'début de la maladie et la métastasie a été bien étudié dans différents cancers6,7. Ces petits ARN non codants servent souvent de cibles très importantes dans le contrôle de la mortalité par maladie6,8,9. Des recherches plus récentes ont porté sur la compréhension des effets paracrines des miARN dans la métastase du cancer par le biais de leur transport dans les véhicules électriques, tels que les exosomes, qui circulent dans la circulation sanguine et permettent aux cellules tumorales d'envoyer ces messagers secondaires à des endroits métastatiques dans un environnement sans nucléane10,11,12. Les véhicules électriques transportent des miARN des cellules tumorales pour transférer les effets transformateurs des cellules hôtes12. L'identification des véhicules électriques en tant que messagers secondaires des cellules tumorales peut donc être utile dans la détection non invasive de la gravité de la maladie.
Le miR-1246 est fortement reréglementé dans les véhicules électriques de PCa agressif, et il indique la gravité de la maladie13. Ces miARN EV-associés servent non seulement de biomarqueurs non invasifs de la maladie, mais jouent également des rôles fonctionnelment importants en conduisant la tumorigenesis. Ainsi, il est essentiel de comprendre la signification du répertoire miRNA qui est associé à des formes résistantes de PCa pour permettre une meilleure identification des biomarqueurs non invasifs ainsi que leur signification fonctionnelle.
L'avènement du séquençage de nouvelle génération a offert la plate-forme la plus complète pour étudier les détails du paysage tumoral impliquant des altérations dans le génome telles que des mutations, des relocalisations chromosomiques, la chromothripsis, et la méthylation, qui contribuent tous de manière significative à la forme et la nature du cancer14,15,16. De même, il est également un outil essentiel pour comprendre les vastes changements épigénomiques qui se produisent dans une cellule tumorale et qui sont souvent des acteurs importants dans la gravité de la maladie17. Dans le but de comprendre le répertoire de miRNA associé à la génération de NEPC, le petit séquençage d'ARN a été exécuté sur les tissus métastatiques de CRPC de FFPE et leurs VÉHICULES sériques correspondants. L'ARN dérivé de l'une ou l'autre de ces deux sources d'échantillon est (1) faible en rendement et (2) de mauvaise qualité en raison de la dégradation qui se produit souvent en raison de la fixation de formaline et de l'isolement de EV. En outre, la génération de bibliothèques d'ADNc est une étape critique, mais lourde, d'une course de séquençage. Ainsi, les méthodes d'isoler ces ARN et de les utiliser pour générer des bibliothèques pour le séquençage de l'ARN de petite taille nécessitent une optimisation pour générer des données précises et fiables.
Il existe plusieurs méthodes pour profiler l'expression miRNA dans différents échantillons, y compris RT-PCR, microarrays, et l'hybridation in situ (ISH). Un protocole utilisant l'ARN tissulaire FFPE pour évaluer l'expression de miRNA par RT-PCR et ISH a été récemment édité18. Les technologies plus récentes offrent des plates-formes plus exhaustives et plus complètes pour le profilage de l'expression des miARN dans un échantillon. NanoString nCounter offre une plate-forme de détection miRNA sensible19, mais la détection est souvent limitée par le nombre de miARN qui sont disponibles dans le tableau (2 000 euros). Dans un tel scénario, une plate-forme plus sensible et exhaustive telle que le séquençage de prochaine génération offre une profondeur beaucoup plus large d'identification miRNA et de profilage simultané dans différents échantillons20. La méthode a été utilisée pour déterminer les signatures miRNA dans l'urine ou le plasma des patients PCa21,22,23. Dans l'article actuel, un protocole est présenté pour utiliser une plate-forme de séquençage de prochaine génération pour étudier les profils de miRNA associés à crPC agressif utilisant des tissus FFPE et des ARN EV dérivés du sérum.
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Protocol
Cette étude a été menée conformément aux lignes directrices éthiques de la règle commune des États-Unis et a été approuvée par le Comité institutionnel de la recherche humaine.
1. Microdissection
REMARQUE: Des tissus métastatiques de CRPC de FFPE avec des dispositifs d'adénocarcinome (CRPC-Adeno) ou la différenciation de NE (CRPC-NE) ont été obtenus du réseau de biorepository de cancer de la prostate (PCBN). Des sections de PCa de dix microns sur des glissières en verre ont été préparées pour la microdissection manuelle comme discuté précédemment18. Pour résumer brièvement :
- Déparaffiniser les sections tissulaires en trempant les lames en xylène (2x, 10 min chacune). Réhydratez ensuite les sections en couvant les lames pendant 5 min chacune en éthanol gradué (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %), suivid d'un lavage à l'eau distillé et d'une coloration à l'hématoxyline (30 s trempette).
- Après la coloration de l'hématoxyline, laver les sections de tissu avec de l'eau. Ensuite, déshydratez les sections de tissus en les plaçant dans de l'éthanol classé (70 %, 80 % 90 %, 95 %, 100 %) (5 min chacun) suivi de xylène (5 min).
- Analyser les diapositives correspondantes d'hématoxylin et d'éosine (H et E) pour identifier les zones tumorales (c.-à-d. adénocarcinomes ou NED) et marquer ces zones tumorales et les zones adjacentes normales avec l'aide d'un pathologiste certifié par le conseil. À l'aide de ces diapositives de H et E comme feuilles de route, marquez les tissus tachés d'hématoxylin obtenus dans l'étape ci-dessus pour distinguer entre la tumeur et les secteurs normaux.
- Disséquer soigneusement la lame de tissu marqué sous le microscope à l'aide d'une lame de scalpel.
- Recueillir le tissu disséqué des zones normales et cancéreuses dans des tubes séparés à l'aide de pointes de pipette de chargement de gel chargées électrostatiquement. La pointe chargée attire le tissu disséqué et permet une récupération maximale des tissus après la dissection. Une fois que le tissu colle à la pointe chargée, couper la pointe dans un tube de collecte vide de 2 ml.
2. Isoler les véhicules électriques dérivés du sérum
REMARQUE: Des échantillons de sérum de patient congelés prélevés sur des patients atteints de CRPC métastatique présentant des caractéristiques d'adénocarcinome (CRPC-adeno) ou de différenciation DU NE (CRPC-NE) ont été obtenus auprès de PCBN à l'aide d'un protocole iRB approuvé et stockés à -80 oC avant leur utilisation. Des échantillons de sérum ont été prélevés du même ensemble de patients que ceux utilisés pour les tissus microdissés pour permettre la comparaison entre les tissus correspondants et les véhicules électriques dérivés du sérum. Un réactif d'isolement EV de sérum disponible dans le commerce a été employé pour rassembler les véhicules électriques.
- Décongeler les échantillons de sérum patient congelés à 4 oC.
- Utilisez 110 l'échantillon de sérum décongelé et tournez à 2 000 x g pendant 30 min.
- Recueillir le supernatant pour l'isolement ultérieur EV / exosome et jeter les débris granulés. Ajouter 30 OL de réagent d'isolement exosome de sérum au supernatant et incuber à 4 oC pendant 30 min.
- Faire tourner à 10 000 x g pendant 10 min. Recueillir soigneusement le sérum appauvri par les veaux sans déranger la pastille dans un tube séparé de 1,5 ml et entreposer à -80 oC pour une analyse future, si nécessaire.
- Resuspendre le granule EV dans 70 'L de phosphate tamponné salin (PBS) préparé dans de l'eau sans nauséail. Gardez un aliquot pour le système d'analyse du suivi des particules afin d'évaluer la qualité et le nombre de particules. Conserver le reste de l'échantillon à -80 oC jusqu'à une analyse plus approfondie.
3. Isolation de l'ARN des tissus et des véhicules électriques microdissés de la prostate
REMARQUE: L'ARN total a été isolé à partir de tissus microdissés et de véhicules électriques purifiés à l'aide d'un kit disponible dans le commerce (Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant avec quelques modifications. Les sections suivantes décrivent brièvement ces procédures en mettant l'accent sur les étapes importantes :
- Isoler l'ARN des tissus microdissés.
- Resuspendre le tissu FFPE microdissé dans 150 l de tampon de protéase K. Mélanger par le vortex et la pipette sur le tissu résiduel de la pointe. Faire tourner à 11 000 x g pendant 1 min.
- Ajouter 10 lde de protéinase K à la pastille. Attendre 2 min jusqu'à ce que la pastille devienne blanche. Pipette de haut en bas à quelques reprises.
- Incuber à 56 oC pendant 16 min. Vortex toutes les 3 min.
- Retirer les échantillons et laisser le bloc de chaleur atteindre 80 oC. Incuber les échantillons sur le bloc pendant 16 min. Vortex toutes les 3 min.
- Incuber sur glace pendant 3 min.
- Tourner à 20 000 x g pendant 15 min. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 2 ml.
- Ajouter 16 l de tampon de rappel DNase suivi de 10 l de DNase I. Mélanger en inversant le tube doucement et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min.
- Ajouter 320 l de tampon de lyse des globules rouges (RBC). Mélanger en inversant le tube, puis ajouter 1 120 l d'éthanol à 100 %. Transfert immédiat sur les colonnes de spin stockées à 4 oC. Tourner à 8 000 x g pour 30 s.
- Laver les colonnes 2x avec tampon de lavage et faire tourner les colonnes à 20.000 x g pendant 5 minutes pour enlever tampon de lavage résiduel.
- Laisser sécher la colonne de spin pendant 2 à 3 min, puis s'élinter avec 19 l'eau sans RNase. Quantitate l'ARN purifié sur un spectrophotomètre et normalisez l'échantillon à 40 ng/L.
- L'isolement d'ARN des véhicules électriques sériques.
- Isoler l'ARN exosomal à l'aide d'un kit. Ajouter 75 l de tampon de lyse A et 9,3 l de tampon de lyse B à 50 l de la suspension EV purifiée.
REMARQUE: Continuez à mélanger l'échantillon en inversant le tube pendant environ 10 minutes pour permettre une lyse complète des véhicules électriques. - Ajouter 130 l'éthanol à 100 % et mélanger immédiatement en inversant l'échantillon. Transférer sur une colonne de spin, puis tourner à 3 300 x g pendant 1 min.
- Laver la colonne 2x avec le tampon de lavage. Faire tourner la colonne à 1 300 x g pendant 3 min pour enlever complètement le tampon de lavage.
- Laisser sécher la colonne à l'air pendant 2 min. Ajouter 18 'L de tampon d'élution à la colonne et laisser reposer pendant 2 min. Tourner à 400 x g pendant 1 min suivie d'une deuxième rotation à 5 800 x g pendant 3 min.
- Répétez l'étape 3.2.4 avec le tampon élucidé inclus dans le kit pour augmenter le rendement de l'ARN de l'échantillon.
- Quantifier l'échantillon sur un spectrophotomètre et le normaliser à 40 ng/L.
- Isoler l'ARN exosomal à l'aide d'un kit. Ajouter 75 l de tampon de lyse A et 9,3 l de tampon de lyse B à 50 l de la suspension EV purifiée.
4. Préparation de la bibliothèque pour le séquençage des petits ARN
REMARQUE: Un petit kit de préparation de bibliothèque d'ARN(tableau des matériaux)a été employé pour produire des bibliothèques de cDNA à partir des échantillons isolés d'ARN. Les étapes pour générer des bibliothèques, les purifier et les vérifier de qualité avant de les exécuter sur un séquenceur sont cruciales pour tout protocole de séquençage car ils déterminent éventuellement la qualité des données de sortie à partir d'une exécution. Par conséquent, procédez soigneusement à chaque étape. Les directives du fabricant suggèrent d'utiliser un minimum de 50 ng d'ARN. Étant donné la mauvaise qualité et les faibles quantités d'ARN total habituellement obtenues à partir de ces deux sources d'échantillons, ce protocole est optimisé pour les concentrations d'ARN aussi bas que 100 ng. Le protocole ci-dessous est pour un échantillon d'une bibliothèque.
- Générer de l'ADNc ligaté par adaptateur.
- Utiliser 5 ll d'un échantillon d'ARN normalisé (40 ng/L). Ajouter 1 'L d'adaptateur de 3'. Préchauffer le cycleur thermique à 70 oC avant d'incuber les échantillons. Incuber pendant 2 min. Transférer immédiatement les échantillons sur la glace avant de passer à l'étape suivante.
- Dans un tube séparé, mélanger 2 l l de tampon de ligature, 1 l d'inhibiteur de la RNase, et 1 L de T4 RNA Ligase 2, un mutant de suppression. Mélanger en pipetting de haut en bas et ajouter 4 'L de ce mélange au tube avec l'adaptateur RNA/3'.
- Transférer au cycleur thermique qui a été préchauffé à 28 oC et couver pendant 1 h.
- Ajouter 1 ll de solution d'arrêt tout en gardant les échantillons sur le bloc thermique. Incuber à 28 oC pendant 15 min.
- Retirez les tubes et gardez sur la glace immédiatement après cette étape.
- Dans un tube séparé, ajouter 1 'L de 5' adaptateur.
- Transférer dans un cycleur thermique qui a été préchauffé à 70 oC et incuber pendant 2 min.
- Placez immédiatement le tube sur la glace pour éviter la ré-annealing des adaptateurs.
- Ajouter 1 l de 10 mM ATP au tube de l'adaptateur dénaturé de 5'. Mélanger par pipetting et ajouter 1 l de ligase d'ARN T4 au mélange. Mélanger par pipetting et ajouter 3 'L de ce mélange au tube contenant l'ARN 3' adaptateur-ligated. Transférer sur le cycleur thermique qui a été préchauffé à 28 oC et couver pendant 1 h.
- Transfert immédiat vers la glace et soit aller plus loin avec les échantillons ou stocker à -20 oC pour une utilisation future.
- Pour effectuer le RT-PCR, utilisez 6 L de chaque ARN adaptateur-ligated et ajoutez 1 L d'amorce RT d'ARN à lui. Transférer sur le cycleur thermique qui a été préchauffé à 70 oC. Incuber pendant 2 min.
- Dans un tube séparé, mélanger 2 'L de tampon de brin de 5x, 0,5 'L de 12,5 mM dNTP, 1 'L de 100 mM DTT, 1 'L d'inhibiteur de RNase, et 1 'L de transcriptase inversée. Ajouter 5,5 L de ce mélange à l'ARN adaptateur et transférer au cycleur thermique qui a été préchauffé à 50 oC. Incuber pendant 1 h.
- Transférer immédiatement l'adin cDNA ligaté par l'adaptateur sur la glace.
- Dans un tube séparé, mélanger 25 l de mélange PCR, 2 L d'amorce PCR à ARN, 2 l d'indice d'amorce PCR d'ARN et 8,5 l d'eau sans RNase. Ajouter 37,5 L de ce mélange à 12,5 l d'ADNc adaptateur-ligated. Transférer sur le cycleur thermique qui a été préchauffé à 98 oC. Programmez le cycleur thermique tel que suggéré dans le protocole du fabricant avec le numéro de cycle modifié à 15 au lieu de 11.
REMARQUE: Les séquences de toutes les amorces utilisées sont énumérées sous tableau des matériaux. - Conserver les échantillons à 4 oC après l'achèvement. Procédez avec eux ou entreposez-les à -80 oC pour une utilisation future.
- Purifie et exécutez le contrôle de qualité pour l'ADNc ligaté.
REMARQUE: L'ADNc amplifié a été purifié en suivant le protocole du fabricant, à l'exception de quelques modifications pour améliorer la qualité et le rendement des échantillons purifiés d'ADNc comme expliqué ci-dessous.- Utilisez 6% de gels polyacrylamide TBE pour purifier l'ADNc amplifié. Diluer l'échelle à haute résolution (HRL) et l'échelle d'ARN personnalisée (CRL) avec des volumes égaux de colorant de chargement d'ADN.
- Ajouter 10 L de colorant de chargement d'ADN à chaque échantillon d'ADNc. Exécuter 30 L de chaque échantillon dans deux voies séparées adjacentes l'une à l'autre avec CRL et HRL dans l'espace intermédiaire entre les deux échantillons différents.
- Exécuter le gel dans 1x tampon TBE à 145 V pendant environ 30 à 40 min.
REMARQUE: Gardez une trace de l'avant bleu inférieur du colorant de chargement. Arrêtez l'électrophoresis quand il s'approche du fond du gel. - Transférer le gel dans un tampon 1x TBE avec Ethidium Bromide (EtBr) à 0,5 g EtBr/1 mL 1x TBE.
MISE EN GARDE: EtBr est un cancérogène connu et chaque étape à partir d'ici jusqu'à ce que l'excision du gel doit être effectuée avec une extrême prudence. - Visualisez le gel dans un transilluminator et coupez le gel précisément entre le marqueur de 145 bp et 160 bp.
REMARQUE: Les dieux adaptateurs courent très près du marqueur de 145 bp. Par conséquent, couper le gel légèrement au-dessus du marqueur de 145 bp pour éviter la contamination avec le dimère adaptateur. - Transférer le gel dans des tubes de rupture d'ADN conservés dans des tubes de collecte de 2 ml. Faites tourner à 20 000 x g pendant 2 min. Ajouter 300 oL d'eau sans RNase et lui permettre de tourner doucement sur un rocker pendant la nuit à RT.
- Pour effectuer les précipitations d'ADN, le jour suivant transférer le contenu du tube à des tubes filtrants de 5 m. Tourner à 600 x g pour 10 s.
REMARQUE: Ne laissez pas les tubes tourner plus de 10 s lorsque le gel passe à travers le filtre. - Ajouter 2 l de glycogène, 30 oL de 3 M NaOAc, 2 l de peinture à granulés de 0,1x et 975 l d'éthanol à 100 % dans l'ADN éluté. Faire tourner à 17 000 x g à 4 oC pendant 20 min.
- Jeter le supernatant et ajouter 75% d'éthanol pour laver la pastille. Faire tourner à 17 000 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et couver les tubes à 37 oC pour évaporer complètement l'éthanol.
- Resuspendre la pastille avec 12 l de 10 mM Tris-HCl pH 8,5.
- Effectuez un contrôle de qualité de la bibliothèque en diluant l'ADNc purifié par 10x (1:10) et en utilisant 1 l d'ADNc dilué pour fonctionner sur un bio-analyseur.
- Assurez-vous que la taille du produit de l'ADNc correspond à la gamme de petits ARN (136 à 160 pb) dans l'électrophétoygramme. Calculez la molarité totale pour chaque échantillon. Normaliser chaque échantillon à 2 nM en utilisant Tris-HCl pH 8.5.
- Dénaturer et séquencer l'ADNc purifié.
- Regroupez les bibliothèques en mélangeant des volumes égaux de chaque échantillon de 2 nM dans un seul tube PCR de 200 l. Ajouter 10 ll de 0,2 N NaOH fraîchement préparé à 10 l de bibliothèque mise en commun.
- Mélanger immédiatement par vortexing, et tourner à 280 x g pendant 1 min. Incubate à RT pendant 5 min.
- Ajouter 10 l de 200 mM Tris-HCl pH 7 à 20 oL de la bibliothèque dénaturée. Mélanger par vortex et faire tourner à 280 x g pendant 1 min.
- Ajouter 970 l de tampon d'hybridation préréfrigérée à la bibliothèque et bien mélanger par vortexing. La bibliothèque est à une concentration de 20 pM. Conserver sur la glace jusqu'à ce qu'elle soit enfin diluée.
REMARQUE: La dilution finale se fait juste avant de s'exécuter sur le séquenceur. - Ajouter 117 l de la bibliothèque dénaturée à 1 183 l de tampon d'hybridation préréfrigérée. Mélanger en inversant le tube et la centrifugeuse à impulsions. La concentration finale de la bibliothèque est maintenant de 1,8 pM.
- Ajouter 1,3 L de PhiX à la bibliothèque finale de 1,3 ml. Pour lancer une exécution sur un séquenceur, suivez les étapes à l'écran de l'interface logicielle, passez en revue les paramètres d'exécution, y compris le type de lecture (lecture unique), lisez la longueur (nombre de cycles pour chaque lecture), l'ID de bibliothèque et sélectionnez Démarrer.
5. Analyse des données
- À la fin de l'exécution du séquenceur, obtenez les données de séquençage résultantes sous forme de fichiers fastQ. Utilisez le logiciel approprié pour analyser les données de séquençage qui en résultent.
- Ouvrez l'application fastQ toolkit et appuyez sur le bouton Lancement.
- Sélectionnez les fichiers de la liste des échantillons dans le logiciel et sélectionnez où les données seront enregistrées.
- Ajoutez un nom de chaîne qui s'applique à chaque séquence taillée. Gardez la rigueur à 0,9. Entrez la séquence adaptateur pour la découper comme "TGGAATTCCGGGTGCCAAGG" à partir de l'extrémité 3' de chaque échantillon séquencé. Élargissez l'onglet Filtrage lire et sélectionnez une longueur de lecture minimale de "5". Sélectionnez la boîte Reconnaître et appuyez sur le bouton Continuer pour commencer à couper. Les fichiers coupés seront enregistrés dans le dossier de projet à la fin de l'analyse.
- Ouvrez la petite application RNA v.1.0 sur le logiciel et appuyez sur le bouton Lancement.
- Sélectionnez le projet où les fichiers seront enregistrés et envoyés après l'analyse.
- Sélectionnez la fonction Novel miRs et Differential miRs dans l'application. Séparez les groupes comme «Contrôle» et «Test» pour l'analyse différentielle et ajoutez les fichiers taillés à analyser dans leurs groupes respectifs.
- Sélectionnez le bouton De lancement pour lancer l'analyse. Après les analyses, téléchargez les fichiers qui en résultent.
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Representative Results
La bibliothèque a été préparée après l'isolement de l'ARN et un contrôle de qualité a été effectué. La purification des gels pour la bibliothèque d'ADNc amplifiée préparée à partir d'ARN isolé à partir de tissus microdissés et de véhicules électriques dérivés du sérum est présentée dans la figure 1 et la figure 2. La taille du produit pour les miARN adaptateurs correspondaient à environ 136 à 160 pb pour chaque échantillon. Figure 1A-B sont marqués pour montrer la gamme du gel qui doit être précisément excisée pour la préparation de la petite bibliothèque d'ARN. Figure 2A-B montre l'électrophorèse de gel et les électrophérogrammes pour le tissu microdissé et les VÉHICULES électriques dérivés du sérum. La figure 1 supplémentaire montre un résultat représentatif de la machine à électrophorèse et de la méthode de calcul de la molarité.
Des étapes pour obtenir les mesures de la bibliothèque avant de s'exécuter sur un séquenceur ont été effectuées. La figure 3 montre les mesures représentatives d'une petite course de séquençage de l'ARN démontrant la densité de cluster prévue, le score QC, le pourcentage de filtre soumettant le cluster et les taux estimés de rendement et d'erreur. La figure 3A et la figure 3C montrent les tableaux avec tous les paramètres d'exécution et le graphique pour le score QC sur différents cycles. Figure 3B,D sont des représentations graphiques des taux d'erreur pour l'alignement PhiX sur différents cycles. Les données fournies proviennent du logiciel d'analyse sur place.
Une application logicielle disponible dans le commerce (Table of Materials) a été utilisée pour analyser les échantillons séquencés à partir de tissus microdissés et de véhicules électriques dérivés du sérum. Les échantillons séquencés ont été coupés des séquences d'adaptateur à l'aide de la boîte à outils FASTq suivie d'une analyse sur l'application «Small RNA v.1.0». La figure 3 montre les données résultantes après analyse. Le tableau 1 et le tableau 2 montrent le total des lectures provenant de tissus microdissés et de séquençage des véhicules électriques dérivés du sérum. La figure 3A et la figure 3B montrent la faible répartition de la longueur de l'ARN pour les deux sources d'échantillonnage.
Figure 1 : Préparation de la bibliothèque pour le séquençage d'un petit ARN non codant. Gel d'ADNc de polyacrylamide pour les bibliothèques amplifiées de (A) microdissé l'ARN de tissu de FFPE et (B) l'ARN des VÉHICULES sériques purifiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Vérification de la qualité du séquençage d'un petit ARN non codant. Image représentative pour l'électrophorèse de gel et l'électrophérogramme pour la bibliothèque purifiée de cDNA pour (A) tissu microdisséisqué ffPE et (B) EVs sérique-dérivés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exécuter des mesures pour le petit séquençage de l'ARN. Représentation tabulaire et graphique des paramètres d'exécution % Q -30, densité de cluster, filtre de passage de cluster %, rendement estimé, et score Q pour le séquençage exécuté à partir (A) tissu ffPE microdissé et (C) sérirum dérivé des véhicules électriques. Représentation graphique des taux d'erreur pour l'alignement PhiX sur différents cycles pour le séquençage courir à partir de (B) tissu microdisséisqué FFPE et (D) sérum dérivé des VÉHICULES. Les barres d'erreurs représentent l'écart standard pour les taux d'erreur pour chaque cycle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats attendus d'une petite course de séquençage de l'ARN non codant. Petits ARN lisent des longueurs pour la bibliothèque de (A) Tissu ffPE microdisséqué et (B) sérique dérivé des VÉHICULES électriques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Échantillon | Lectures totales de séquençage |
| 1 | 92,68,658 |
| 2 | 70,00,551 |
| 3 | 1,56,41,204 |
| 4 | 1,50,46,681 |
| 5 | 1,42,82,756 |
| 6 | 1,27,38,970 |
| 7 | 1,57,21,318 |
| 8 | 88,51,578 |
| 9 | 1,32,16,879 |
| 10 | 1,14,66,162 |
| 11 | 1,91,14,932 |
Tableau 1 : Le séquençage total indique un petit séquençage de l'ARN provenant de tissus FFPE microdissés. Pourcentage d'lectures correspondant à de petits ARN pour les échantillons de FFPE séquencés qui ont été obtenus après analyse.
| Échantillon | Lectures totales de séquençage |
| 1 | 2,30,88,960 |
| 2 | 1,77,69,806 |
| 3 | 90,37,884 |
| 4 | 87,26,243 |
| 5 | 73,23,571 |
| 6 | 2,89,37,388 |
| 7 | 76,52,149 |
| 8 | 1,30,07,122 |
| 9 | 54,34,386 |
| 10 | 93,05,941 |
| 11 | 94,53,760 |
| 12 | 82,79,773 |
Tableau 2 : Le séquençage total se lit pour un petit séquençage de l'ARN à partir de véhicules électriques purifiés dérivés du sérum. Pourcentage de lectures correspondant à de petits ARN pour les échantillons de véhicules électriques séquencés obtenus après analyse.
Figure supplémentaire 1 : Vérification de la qualité du séquençage d'un petit ARN non codant. Résultats représentatifs d'une exécution de machine d'électrophoresis montrant la molarité totale de l'échantillon indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler l'ARN des tissus ffPE et des véhicules électriques dérivés du sérum utilisant des kits qui ont été optimisés pour augmenter le rendement et la qualité des ARN isolés. En outre, les ARN purifiés ont été utilisés pour générer des bibliothèques d'ADNc pour le séquençage de l'ARN. Les deux étapes énumérées sont essentielles pour déterminer la qualité et la profondeur des lectures de séquençage qui sont le résultat final de la course24. Par conséquent, l'optimisation de ces étapes cruciales est essentielle à une course de séquençage réussie.
Une étape importante dans l'isolement de l'ARN FFPE-dérivé est la digestion avec la protéase K qui permet l'enlèvement de la formaline croisée du tissu. Cette étape a été optimisée en couvant l'échantillon à 55 oC et 80 oC pendant environ 16 à 18 min chacun. Ceci a eu comme conséquence une augmentation efficace de la qualité de l'ARN isolé par une augmentation du rapport 260/280. Les lectures de séquençage sont souvent variables pour une exécution qui comprend plusieurs échantillons. Par conséquent, le contrôle de la quantité d'entrées d'ARN au début de la préparation de la bibliothèque permet l'uniformité de la bibliothèque. L'utilisation d'ARN normalisé aide à niveler un séquençage uniformément sur différents échantillons. L'étape la plus critique dans la préparation de la bibliothèque est la purification des cDNA ligarés par adaptateur amplifié. Il est très important d'exciser soigneusement les gels au-dessus du marqueur de 140 pb, car une légère déviation vers le bas du marqueur conduit à la contamination des dieux adaptateurs. Enfin, la normalisation de la bibliothèque d'ADNc est l'étape la plus importante du protocole de séquençage et doit être effectuée avec précision en fonction de la normalité calculée de la machine à électrophorèse.
En cas de contamination par un adaptateur, on peut réexécuter la bibliothèque purifiée sur un gel TBE et réapurifier le produit désiré. Cependant, le rendement de la bibliothèque d'ADNc dans une telle extraction est considérablement diminué, ce qui peut affecter la longueur de lecture de l'échantillon. Pour une estimation de la concentration de la bibliothèque d'ADNc purifiée, on peut diluer les échantillons avant de fonctionner sur la machine d'électrophorèse en fonction de l'intensité du produit dans les gels TBE et préparer différentes dilutions (c.-à-d. 5x, 10x ou 25x). Pour améliorer encore l'estimation des bibliothèques d'ADNc purifiées, l'exécution d'un qPCR en plus de l'électrophorèse permet d'évaluer les niveaux de modèles et permet une normalisation plus précise.
Bien que l'ultracentrifugation soit l'étalon-or de l'isolement des véhicules électriques de différentes sources, un rendement plus faible des particules d'une telle extraction limite souvent l'utilisation de cette méthode dans la purification des véhicules électriques lorsque le matériau de départ est limité et une quantité importante de l'ARN d'entrée est nécessaire pour les applications en aval. Ainsi, l'utilisation du réactif total d'isolement d'exosome fournit une méthode beaucoup plus rapide et plus élevée de rendement pour l'isolement de EV des sources limitées comme le sérum et le plasma des échantillons cliniques.
Dans l'ensemble, ce protocole détaille les méthodes de génération des bibliothèques d'ADNc d'une manière plus efficace dans le temps tout en tenant compte du rendement et de la qualité des bibliothèques d'ADNc pour obtenir des lectures précises et complètes de séquençage. Étant donné le potentiel des exosomes comme source de biomarqueurs du cancer, cette méthode pour les analyses de séquençage de prochaine génération (NGS) de la teneur en miARN exosomal sera utile pour la recherche dans le domaine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par l'US Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA) par le biais de l'Idea Development Award underAward No. W81XWH-18-1-303 et W81XWH-18-2-0013 et en outre par Award no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, et W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Le soutien financier au laboratoire d'auteurs par l'Institut national du cancer des National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984) est également reconnu. Rajvir Dahiya est chercheur scientifique principal au ministère des Anciens Combattants, BX004473 et financé par NIH-UO1CA199694 (RD). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense ou l'armée américaine. Nous sommes reconnaissants à Judy Shigenaga, directrice de l'installation de base à San Francisco VAMC, pour son aide avec le séquenceur NextSeq 500.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M NaOAc pH 5.5 | USB Corp. | 75897 100 mL | |
| 5 µm filter tubes | IST Engineering Inc. | 5388-50 | |
| 6% TBE polyacrylamide gels | Novex | EC6265BOX | |
| BaseSpace | Illumina | Analysis software | |
| Bio-analyzer | Agilent | ||
| DNA loading dye | Novex | LC6678 | |
| Eppendorf Thermostat plus | Eppendorf 1.5 mL | ||
| EtBr | Pierce | 17898 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco | 111000200 | |
| Exosomal RNA isolation kit | Norgen | 58000 | |
| Gel breaking tubes | IST Engineering Inc. | 3388-100 | |
| Glycogen molecular biology grade | Thermo Scientifc | R0561 | |
| Hematoxylin Select | Stat lab | SL401 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 | accuSpin Micro 17R |
| miRNeasy FFPE kit | Qiagen | 217504 | |
| Nanodrop | Thermo Scientifc | Nano Drop 1000 | |
| Nanosight NTA | Malvern | LM14 | |
| NextSeq 500 Sequencer | Illumina | ||
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| Pellet paint | Millipore | 70748-3 | |
| Superscript II Reverse Transcriptase | Invitogen | 18064014 | |
| T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant | Lucigen | LR2D11310K | |
| TBE Running buffer (5x) | Novex | LC6675 | |
| Thermal cycler | MJ Research | PTC100 | |
| Total exosome isolation reagent (from serum) | Invitrogen | 4478360 | |
| TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P- 1GAL | |
| RNA 3' Primer | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC | ||
| RNA 5' Primer | TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG | ||
| Stop Oligo | GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG | ||
| RNA RT Primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| RNA PCR Primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | ||
| RNA PCR Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | ||
| - | - | - | 6 bases in adapter |
| RNA PCR Index Primer 1 | CGTGAT | ||
| RNA PCR Index Primer 2 | ACATCG | ||
| RNA PCR Index Primer 3 | GCCTAA | ||
| RNA PCR Index Primer 4 | TGGTCA | ||
| RNA PCR Index Primer 5 | CACTGT | ||
| RNA PCR Index Primer 6 | ATTGGC | ||
| RNA PCR Index Primer 7 | GATCTG | ||
| RNA PCR Index Primer 8 | TCAAGT | ||
| RNA PCR Index Primer 9 | CTGATC | ||
| RNA PCR Index Primer 10 | AAGCTA | ||
| RNA PCR Index Primer 11 | GTAGCC | ||
| RNA PCR Index Primer 12 | TACAAG |
References
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