Summary
Formålet med denne protokol er at smelte to forskellige celletyper for at oprette hybridceller. Fluorescens mikroskopi analyse af smeltet celler bruges til at spore cellen af oprindelsen af cellulære organeller. Denne analyse kan bruges til at undersøge, hvordan cellulær struktur og funktion reagerer på forstyrrelse ved cellefusion.
Abstract
Livet er rumligt partitioneret inden for lipid membraner til at tillade isolerede dannelse af særskilte molekylære tilstande inde celler og organeller. Cellefusion er en fusion af to eller flere celler til dannelse af en enkelt celle. Her giver vi en protokol for cellefusion af to forskellige celletyper. Smeltet hybridceller beriges af strømnings cytometri-baseret sortering, efterfulgt af Fluorescens mikroskopi af hybrid cellens struktur og funktion. Fluorescently mærkede proteiner genereret af genomredigering er afbildet inde i smeltet celler, så cellulære strukturer kan identificeres baseret på fluorescens emission og refereres tilbage til celle typen af oprindelse. Denne robuste og generelle metode kan anvendes til forskellige celletyper eller organeller af interesse, at forstå cellulære struktur og funktion på tværs af en række grundlæggende biologiske spørgsmål.
Introduction
Homeostatisk vedligeholdelse af cellulære struktur er afgørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tal, og intern biokemisk sammensætning. Forståelse af, hvordan disse grundlæggende egenskaber genereres, og hvordan de går skævt under sygdom kræver laboratorie værktøjer til at forstyrrer dem.
Cellefusion er en sammenlægning af to eller flere separate celler. Cellefusion kan have været afgørende for fremkomsten af eukaryote Life1. I den menneskelige krop, cellefusion er relativt sjælden, forekommende under begrænsede udviklingsmæssige omstændigheder og vævstyper, såsom under befrugtning eller dannelsen af muskler, knogler og placenta2. Denne protokol beskriver induktion af celle-cellefusion i vævskultur cellelinjer med differentielt fluorescently mærkede organeller, som et redskab til at forstå mekanismerne kontrollerende cellestruktur og funktion.
In vitro-induceret celle cellefusion er afgørende for produktionen af monoklonale antistoffer3, et vigtigt redskab til biologisk forskning og sygdomsbehandling. Cellefusion er også blevet brugt til at stille mange forskellige grundlæggende celle biologiske spørgsmål om celle cyklus dominans4, aneuploidi5,6, cellulære omprogrammering7,8, reparation af beskadigede neuroner9, viral proliferation10, apoptose11, tumor12, cytoskelet dynamik13, og membran fusion14,15. Laboratoriebaserede metoder til at inducere celle-cellefusion16,17,18,19 fremkalde lipid membran sammensmeltning gennem den fysiske fletning af to dobbeltlag i én. Cellefusion kan induceres af elektricitet18, virale baserede metoder17, termoplast opvarmning20, transgene udtryk19, og kemikalier, herunder polyethylenglycol (peg)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulus organisere centre kontrollerende cellulære form, motilitet, polarisering, og division23. Centrosomale rødder er fibrøse strukturer, der strækker sig fra centrosomer indeholdende proteinet rootletin24 (kodet af genet crocc). Vi har for nylig brugt celle-cellefusion til at forstå, hvordan centrosome position og antal varierer inden for heterokaryons i forhold til forældrenes celler24. Rationalet bag brugen af denne metode er at spore cellen af oprindelsen af rødder inden for en heterokaryon efter fusion af differentielt fluorescently mærkede forældre celler, og dermed til billedet organelle fusion og fission. De fluorescently mærkede proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-I er skabt af genomredigering i separate cellelinjer, som derefter fusioneres af PEG-medierede cellefusion. Vi beskriver brugen af cellefarve stoffer (tabel over materialer) til at identificere smeltet celler ved flowcytometri og efterfølgende Fluorescens mikroskopi identifikation af centrosome celle oprindelse og morfologi (figur 1). Denne fremgangsmåde er en robust og unik metode til at studere, hvordan større ændringer i cellulær tilstand, herunder organelle nummer indvirke på celle homøostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentialfluorescerende celle mærkning
- Gentagging med CRISPR Cas9
- Brug crispr Cas9 genom redigering til at tagge rootletin (eller andre gener af interesse) med de fluorescerende proteiner megfp eller mscarlet-i i humane Cancer cellelinjer.
Bemærk: Detaljerede protokoller for genomredigering er dækket andetsteds24,25,26.
- Brug crispr Cas9 genom redigering til at tagge rootletin (eller andre gener af interesse) med de fluorescerende proteiner megfp eller mscarlet-i i humane Cancer cellelinjer.
- Mærkning af fluorescerende farvestoffer
- Vokse Cal51 humane kræftceller i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), L-glutamin og 100 μg/mL penicillin/streptomycin ved 37 °C og 5% CO2 i en befuret inkubator.
Bemærk: Det er vigtigt at sikre, at cellerne regelmæssigt kontrolleres for fravær af Mycoplasma kontaminering, og for identiteten af celle linjen. Brug ikke celler, der i udstrakt grad er urerne i kultur (> 15 passager). Cellerne skal være sunde og vokse eksponentielt. Undgå under-confluency eller over-confluency. - Frø hver celletype (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I og forældre ukodede Cal51 celler) sådan, at ~ 6 x 106 celler er til stede den næste dag for hver prøve, ved en sammenhæng af 70 − 90%.
Bemærk: Dette er ca. en T75 vævskultur kolbe eller 1 10 cm skål pr. celletype. De ukodede forældre celler kræves som et negativt kontrolelement senere i protokollen. Denne protokol giver mulighed for produktion af ~ 20.000 smeltet celler, men dette tal kan øges ved at opskalere protokollen med et øget antal batches. - Den næste dag, prewarm DMEM, trypsin og 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS) ved at placere dem i et vandbad ved 37 °C.
- Vask rootletin-meGFP og rootletin-mScarlet-I celler 2x i PBS ved at hælde eller aspirere off medium og erstatte med 10 mL PBS.
- Label Cal51 rootletin-meGFP celler ved at tilføje 500 nM violet cellefarve stof (tabel over materialer) i PBS i 1 min ved stuetemperatur (RT).
- Label Cal51 rootletin-mScarlet-I celler ved at tilføje 200 nM langt rødt cellefarve stof (tabel over materialer) i PBS i 1 min ved rt.
Bemærk: Hold prøverne afskærmet mod lys, hvor det er muligt efter fluorescerende farvning, for at undgå foto blegning af fluorescens. - Stop farve mærknings Reaktionerne ved at tilføje 10 mL DMEM i 5 min.
- Fjern ikke-mærkede forældre Cal51 celler fra inkubator (fra trin 1.2.2).
Bemærk: Disse celler vil senere blive brugt som ikke-mærkede negative kontrolelementer (trin 3.3.2). - Vask alle celler én gang ved at hælde vækstmediet af og erstatte med 10 mL PBS.
- PBS og Inkuber i 5 minutter ved dyrkningsforhold med 1 mL forvarmet 1x trypsin.
- Overfør cellerne til et 15 mL plast konisk rør og centrifugeres ved 1000 x g i 5 min.
- Tag forsigtigt og kassér trypsin fra celle pellet med en pipette.
- Resuspendér forsigtigt de violette og langt røde mærkede celle piller i 1 mL PBS.
- Resuspendér forsigtigt den forældre-(ikke-fluorescerende) celle pellet i 1 mL DMEM og vend tilbage til inkubator.
Bemærk: Denne prøve vil ikke undergå celle cellefusion, men vil blive brugt senere under strømnings cytometri.
- Vokse Cal51 humane kræftceller i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), L-glutamin og 100 μg/mL penicillin/streptomycin ved 37 °C og 5% CO2 i en befuret inkubator.
2. celle celle fusion
- Bland 3 x 106 violet mærkede celler med 3 x 106 langt røde mærkede celler i et 15 ml rør ved forsigtigt at pipettere sammen 0,5 ml af hver celletype ved hjælp af en 1 ml pipette.
- De resterende ublandede celler centrifugeres fra trin 2,1 ved 1.000 x g i 5 minutter, derefter hældes PBS, resuspenderes pellet i 1 ml DMEM og vender tilbage til inkubator.
Bemærk: Disse resterende ublandede enkelt mærkede prøver vil senere blive anvendt som negative og kompensations Kontroller i afsnit 3 i protokollen. - Centrifuger de blandede celler fra trin 2,1 ved 1.000 x g i 5 minutter og ASPIRÉR PBS forsigtigt med en 1 ml pipette.
- Tilsæt 0,7 ml 50% 1450 pind opløsning i en dråbevis mode til celle pellet (trin 2,3) ved hjælp af en 1 ml pipette over en periode på 30 s.
- Lad 3,5 min på RT.
Bemærk: Inkubationstiden med PIND kan optimeres afhængigt af celletype, selv om Bemærk, at længere inkubationstid øger celletoksicitet. - 10 ml serumfrit DMEM dråbevis tilsættes til 30 s og efterlades i inkubator i 10 min.
- Drej ned ved 1.000 x g i 5 min., kassér supernatanten, og resuspender forsigtigt i 1 ml komplet medium (DMEM indeholdende FBS).
Bemærk: Gå direkte til afsnit 3. Der er toksicitet forbundet med peg eksponering efterfulgt af flow flowcytometri og Imaging, så hold cellerne i kulturforhold så meget som muligt ved at gå hurtigt mellem trin.
3. fluorescens-aktiveret celle sortering (FACER) for at berige smeltet celler
- Forbered alle celler til flowcytometri ved forsigtigt at pipettere hver prøve separat gennem et 70 μm-filter i et FACS-rør.
Bemærk: Fire prøver er påkrævet: smeltet celler, enkelt mærket langt røde celler, enkelt mærkede violette celler, ikke-mærkede forældre celler. Når cellerne er fjernet fra den sterile vævskultur hætte, har de evnen til at blive smittet, så eksponeringstid for prøver minimeres til et ikke-sterilt miljø fra her og fremefter. Cellerne sorteres i hele DMEM-mediet. - Brug et flowcytometer, der kan sortere enkeltceller.
- Konfigurer celle sorteringen for en aseptisk sortering. Udfør apparatets kvalitetskontrol som pr. fabrikantens anbefaling.
- Tegn et plot af Forward scatter versus side scatter og en Doublet diskrimination plot.
- Opret porte for at identificere smeltet celler.
- Begejstre de fluorescerende farvestoffer ved bølgelængder på 405 nm og 635 nm. Detektere ved 450 Nm og 660 nm (henholdsvis violet og far-røde bølgelængder). Plot langt rødt versus violet bølgelængder.
- Kør ikke-mærkede forældre celler gennem flowcytometer og Optag fluorescens intensitet.
Bemærk: Værdier over denne grundlinje definerer positivitet for farvning af farvning. - Kør enkelt mærkede violette celler gennem cytometer. Bekræft, at der ikke er nogen afsmittende virkninger af violet i den fjerneste røde kanal.
- Kør enkelt mærkede langt røde celler gennem flowcytometer og Bekræft, at der ikke er nogen afsmitning af langt rødt i den violette kanal.
Bemærk: For de repræsentative data, der vises, blev cellerne sorteret ved 20 psi på en sorteringsmaskine udstyret med en 100 μm dyse. - Kør kort fusions prøven for at bekræfte, at de smelte celler er synlige med portene oprettet i trin 3,3.
- Juster sorterings strømmen centralt i en 8-brønd billedbehandlings skål.
- FACS sortere smeltet celler, præsentere som dobbelt positiv violet og langt røde mærkede celler direkte i en 8-brønd billedbehandling skål indeholdende 100 μL af vækstmedium.
Bemærk: Det maksimale anbefalede antal celler er ~ 50.000 pr. 8-brønd skål. Sørg for celle sundhed under sortering. Cell confluency kan påvirke celle sundhed, så hold cellerne mellem 20 − 90% konfluency efter sortering ved at sortere et passende antal celler til billedbehandlings skålen. Hver sorteret dråbe indeholder ca. 3 nL af kappe væske. Sørg for, at kappe væsken ikke fortynder signifikant vækstmediet under sortering. - Umiddelbart efter sortering, tage celler tilbage til inkubator og forlade for > 2 h eller natten.
Bemærk: Klæber celler vil gradvist re-holde sig til dækglas i denne periode, fra sortering og fremefter, og dermed deres morfologi vil ændre sig over tid, hvis taget direkte til mikroskopet.
4. Immunofluorescent farvning og billeddannelse af celle celle fusioner
Bemærk: Smeltet celler kan imældes levende eller efter fiksering og yderligere fluorescerende farvning (eller begge), afhængigt af de nødvendige eksperimenter og målinger.
- Live Cell Imaging
- Udskift vækstmediet med billedmedium uden phenol rød (tabel over materialer) og Fortsæt direkte til billeddannelse.
- Fiksering og farvning
- Tilbered frisk 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
- Fix cellerne ved at inkube dem i 100 μL af 4% PFA i 15 minutter ved RT. Fjern PFA efter 15 min.
Forsigtig: PFA er giftig ved indånding, så dette trin skal udføres i en stinkhætte med passende personlige værnemidler.
Bemærk: Efter fiksering kan eksperimentet sættes på pause og genstartes senere, hvis det er nødvendigt. Prøven opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys, hvis det er nødvendigt. - Vask cellerne 3x i 200 μL PBS ved RT.
- Permeabilize celler i 10 min ved RT i 200 μL 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof (tabel over materialer) og 0,1% nonionisk rengøringsmiddel (tabel over materialer) fortyndet i PBS.
- Blok i 200 μL 3% bovint serumalbumin i PBS i 30 min ved RT.
- Der inkubates med antistoffer i 150 μL PBS, som indeholder 3% bovint serumalbumin og 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof og 0,05% nonionisk rengøringsmiddel i 1 time ved RT.
Bemærk: De primære antistoffer, der anvendes til at generere de repræsentative resultater, er fluorescently konjugeret anti-GFP nanobody (anvendes ved 1:400 fortynding) og fluorescently konjugeret anti-mScarlet-I nanobody (anvendes ved 1:500 fortynding). Disse forbedrer signalet af de allerede fluorescerende proteiner. - Vask 2x i 5 min i 300 μL PBS, og lad derefter i 200 μL PBS.
Bemærk: Prøverne er inddelt i PBS. Prøverne kan opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys.
- Erhvervelse af billeder
- Erhverve billeder med en passende fluorescens mikroskop stand til fire-farve billeddannelse (f. eks konfokale, widefield, struktureret belysning).
- Excite meGFP og mScarlet-I kanaler med 488 nm og 561 nm bølgelængde lasere, hhv. Indstil detektorerne til at detektere ved ~ 505 − 550 nm og ~ 590 − 650 nm. Excite violet og langt røde farvestof kanaler med 405 nm og 633 nm lasere, hhv. Indstil detektorerne til at detektere ved ~ 430 − 500 nm og ~ 660 − 750 nm.
- Empirisk bestemme laser intensitet sådan, at signifikant foto blegning ikke forekommer, og at cellerne forbliver sunde (hvis levende celle billeddannelse).
- Empirisk bestemme Gain sådan, at signalet opnås uden mæthed eller kunstigt klipning pixelværdier.
- Saml Z-stack data, således at billederne er tredimensionale, der dækker et område på 20 − 60 μm med ~ 500 μm trin størrelse.
Bemærk: De billeder, der er vist i repræsentative data, blev anskaffet af enten konfokale (figur 2B), airyscan (figur 2C) eller mikroskopi af struktureret belysning (figur 2D). Hver celle er en bona fide heterokaryon, hvis den indeholder både violet og langt røde farvestoffer overlappende i cytoplasmaet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Passende mærkede celler er synlige under strømnings cytometri ved fluorescens signal højere end ikke-mærkede kontrol celler (figur 2A). Gates er indstillet til sortering af dobbelte positive celler, berigende denne population direkte i Imaging retter til yderligere mikroskopiske analyser. Smeltet celler er detekterbare som særskilte dobbelt fluorescently positive celler og udgør omkring ~ 1% af befolkningen.
Fusion inducerer større omorganisering af cellulær arkitektur gennem blanding af to celler i en (figur 2B). Heterokaryons er identificeret på mikroskopet som celler, der indeholder både fluorescerende farvesignaler blandet inde i en enkelt celle (uden intervenerende plasma membraner). Desuden kan to kerner være synlige i smeltet celler ved brightfield/differentiel interferens kontrast eller fluorescens billeddannelse. Bemærk, at triploide eller andre mere stærkt polyploide stater er muligt ud over diploide fusioner dog, og så farve signal af to farver bør anvendes til at bekræfte identiteten af smeltet celler.
Cellestruktur og funktion er yderligere undersøgt gennem sammenlægning af celler, der indeholder meGFP og mScarlet-jeg mærkede proteiner. Fusion resulterer i en fordobling af centrosome tal inde heterokaryons som følge af fusion af to celler. Hvis celler med fluorescentligt mærkede centrosomer er smeltet sammen, observeres der således mindst fire pericentriolære materiale Foci, når centrosome pericentriolar komponenten NEDD1 er fluorescently mærket (NEDD1-mRuby3; Figur 2C). Fusion af celler med endogent fluorescently Tagged rootletin (rootletin-megfp og rootletin-mscarlet-I) tillader cellen af oprindelsen af hver centrosome skal identificeres i en heterokaryon. Rootletin i centrosomale rødder har begrænset diffusions omsætning24, og er derfor til stede som udpræget farvede fibre i heterokaryons afbildet med Fluorescens mikroskopi (figur 2D).
Figur 1: celle-cellefusion og fluorescens Imaging eksperimentel workflow. Skematisk af de fire-trins eksperimenterende workflow. (1) to cellepopulationer er differentielt mærket med farvestoffer og fluorescerende fusions proteiner. Cyan repræsenterer farvning med violet cellefarve stof og magenta repræsenterer farvning med langt røde cellefarve stof. Grøn repræsenterer meGFP-tagging, og rød repræsenterer mScarlet-I-tagging. (2) celler er smeltet gennem inkubation med polyethylenglycol. (3) de smeltet celler beriges ved flowcytometri og sorterer de dobbelte fluorescentriske positive celler (langt rødt og violet). (4) smeltet celler afbildes ved Fluorescens mikroskopi for at forstå, hvordan cellernes struktur og funktion ændres (billeddannelse af de grønne og røde kanaler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ flow cytometri berigelse og fluorescerende billeddannelse af smeltet celler. A) repræsentativ gating-strategi, der anvendes i flow cytometri-sortering af fbrugte celler. Smeltet celler, der er dobbelt fluorescerende, indikeres af den sorte firkant. B) repræsentativ Konfokal Fluorescens-mikroskopi af smeltet celler, der er dobbelt mærket med violet og langt røde farvestoffer. Vist er eksempler på vellykkede smeltet celler, som enten er tetraploide eller hexaploid (henholdsvis top-og bundpaneler). Scale bar = 10 μm. (C) repræsentativ levende celle Airyscan Konfokal billeddannelse af centrosomer i en enkelt smeltet celle indeholdende endogent mærkede centrosomale rødder (rootletin-megfp) og centrosomalt pericentriolært materiale (NEDD1-mRuby3). Scale bar = 1 μm.D) celler, der udtrykker endogent kodet rootletin-megfp, blev smeltet sammen med celler, som udtrykker endogent Tagged rootletin-mscarlet-I. Celler blev fikseret og plettet og afbildet af struktureret belysning mikroskopi. Vist er en maksimal intensitet z-projektion af centrosomer i en smeltet celle. Scale bar = 1 μm. panel D er blevet modificeret fra mahen24 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en facile og omkostningseffektiv protokol for at bruge celler og visualisere den efterfølgende arkitektur af celle hybrider med mikroskopi, idet det tager ca. to dage fra start til. Kritiske dele af denne protokol er berigelse af smeltet celler ved celle sortering (protokol afsnit 3), og omhyggelig validering af smeltet celler ved mikroskopi (protokol afsnit 4). Disse sektioner sikrer, at smeltet celler er let fremstillet og er bona fide heterokaryons. Koncentrationer og inkubationstider skal overholdes. For eksempel kan cellefarve stoffer, når de anvendes ved højere koncentrationer eller med længere inkubationstider, være for lyse og mægle detektorerne under strømnings cytometri eller Fluorescens mikroskopi eller forårsage kryds emission afhængigt af billedbehandlings forholdene. I mangel af et flow-cytometer er andre teknologier i stand til at berige smeltet celler, herunder dobbelt valg af antibiotika27 og mikrofluidiske diffuse Rings anordninger28. Disse teknologier er enten langsommere eller kræver en mere skræddersyet eksperimentel opsætning, dog.
Andre metoder til cellefusion har fordele og ulemper i forhold til den protokol, der er beskrevet her. Elektro-fusion eller viral-baserede fusionsteknikker kan i nogle tilfælde være afbildet med mikroskopi under fusion8,29, hvilket gør dem gode alternativer, hvis det er at foretrække at observere selve fusionsprocessen. Disse forskellige metoder kan dog kræve specialudstyr (f. eks. Elektro fusions udstyr eller virale transgener). Alle celle-cellefusions metoder har potentiale til at indvirke på celle sundhed. Viral baserede fusions metoder er generelt afhængige af den fortsatte ekspression af virale transgener, i modsætning til den forbigående forstyrrelse fra peg eller elektro fusion. Cellulær fusogenic potentiale og toksicitet efter PEG eksponering er variabel i forskellige celletyper27, og dermed titrering af peg inkubationstiden kan være påkrævet (protokol trin 2,4), samtidig med at det anerkendes, at øget peg eksponering øger celledød30. Maksimering af celle sundhed er afgørende ved at holde tiden ude af kulturforhold til et minimum. Celle sundhed kan kontrolleres under protokollen ved at måle fremad scatter versus side scatter ved flowcytometer og gennem observation af morfologi under mikroskopi.
Omhyggelig overvejelse af eksperimentel design for at tillade differentieret mærkning med fluorescerende Tags er afgørende. Det enkleste design er at bruge to separate fluorescerende etiketter. Endogent udtrykte fluorescerende fusions proteiner er dog ofte af lavt ekspressionsniveau og er derfor svære at påvise entydigt ved flow cytometri eller billeddannelse på enkelt celleniveau. Vi præsenterer et design, der overvinder denne begrænsning ved at medtage fire fluorescerende Tags med CRISPR Cas9-mediated genomredigering og farve baserede farvningsmetoder. Fluorescerende sonder skal have særskilte emissions spektre, der kan skelnes fra hinanden og være lyse nok til at skelne fra celler uden etiket på et enkelt celleniveau. Sonder skal forblive bundet til en celle i stedet for at sprede sig eksternt. Irreversibel binding internt på det subcellulære niveau er ikke afgørende, men kan være ønskelig. Når cellerne fusionerer, kan Steady State udveksling af cellulære komponenter frit forekomme. Da rødderne er diffusions stabile, de tillader sporing af cellulære historie, identificere cellen af oprindelsen af en given centrosome. En mulig ændring af metoden er at mærke andre cellulære strukturer af interesse, men Steady-State forsamlinger har potentiale til at blande efter fusion, afhængigt af satsen for intracellulære dynamik (figur 2C).
Celle-cellefusion inducerer en unik ændring i cellulære arkitektur17,19,24, hvis konsekvenser er stadig ikke fuldt forstået. Dette er både en begrænsning af protokollen og et spændende område for yderligere undersøgelser. Selv om det er klart, at plasma membraner smelter ind i en enkelt struktur i heterokaryons31, hvordan andre cellulære strukturer reagerer er dårligt forstået. Cellefusion kan bruges til yderligere at forstå, hvordan organelle fusion og fission reguleres gennem billeddannelse af differentielt mærkede organeller24,32. Fremtidigt arbejde med cellefusion kunne adressere, hvordan euploidy, organelle-nummer og Cellestørrelse indvirker på celle funktionen. Da unormal cellefusion er blevet observeret i sygdomsprocesser, i tumorer33 og efter viral infektion10,17, denne protokol er også til brug for at behandle en række spørgsmål i grundlæggende og anvendt biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship til R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul French for kritisk rådgivning og vejledning om projektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research flow cytometry facilitet for fremragende støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller og Gianmarco Contino for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70 μm) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1 L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
