Kvantifiering av mikroalg odling och biomassa i en foto bioreaktor i bänk skala med frätande rökgaser

Summary

Bänk skala, axenic odling underlättar mikroalger karakterisering och produktivitets optimering innan efterföljande process skala upp. Fotobioreaktorer ger den nödvändiga kontrollen för tillförlitliga och reproducerbara experiment i mikroalger och kan anpassas för att på ett säkert sätt odla mikroorganismer med frätande gaser (CO₂,_{so 2}, No₂) från kommunala eller industriella förbränningsutsläpp.

Abstract

Fotobioreaktorer är upplysta odlingssystem för experiment på fototrofiska mikroorganismer. Dessa system ger en steril miljö för mikroalger odling med temperatur, pH, och gassammansättning och flödeshastighet kontroll. I bänk skala, är fotobioreaktorer fördelaktigt för forskare som studerar mikroalger egenskaper, produktivitet och tillväxt optimering. Vid industriella skalor kan fotobioreaktorer bibehålla produktens renhet och effektivisera produktionen. Videon beskriver förberedelse och användning av en foto bioreaktor i bänk skala för odling av mikroalger, inklusive säker användning av korrosiva gas ingångar, och specificerar relevanta biomassa mätningar och beräkningar av biomassa produktivitet. Specifikt videon illustrerar mikroalg kultur lagring och förberedelse för inympning, foto bioreaktor montering och sterilisering, biomassa koncentrationsmätningar, och en logistisk modell för mikroalger biomassa produktivitet med hastighet beräkningar, inklusive maximal och övergripande biomassa produktivitet. Dessutom, eftersom det finns ett växande intresse för experiment för att odla mikroalger med simulerade eller verkliga utsläpp av avgaser, videon kommer att täcka photobioreactor utrustning anpassningar som krävs för att arbeta med frätande gaser och diskutera säker provtagning i sådana scenarier.

Introduction

Fotobioreaktorer är användbara för kontrollerade experiment och odling av renare mikroalger produkter än vad som kan uppnås genom öppna dammar. Mikroalger odling i bänk-skala photobioreaktorer stöder utvecklingen av grundläggande kunskap som kan användas för process skala upp. Smärre förändringar av miljöförhållandena kan avsevärt förändra mikrobiologiska experiment och blanda ihop resultaten¹. En steril process med temperatur, pH och gas Sparging kontroll är fördelaktigt för att studera mikroalger egenskaper och prestanda under varierande förhållanden. Dessutom kan kontrollen över ingående gaskoncentrationer, temperatur, skjuvkraft från blandning och medium pH stödja olika arter som annars är utmanande att odla. Photobioreaktorer kan köras som en satsvis process med kontinuerlig gas matning och sparging, eller som en chemostat Flow-Through system med kontinuerlig gas matning och Sparging plus inflöde och avloppsvatten näringsämnen ingångar. Här demonstrerar vi batchprocessen med kontinuerlig gas matning och Sparging.

Användningen av fotobioreaktorer tar upp flera mikroalg odlingar och produktionsutmaningar. Området i allmänhet kämpar med oro för kontaminering av andra mikroorganismer, effektiv substrat utilization (vilket är särskilt viktigt när det gäller CO₂ begränsning eller avloppsrening)², pH-kontroll, belysning variation, och biomassa produktivitet³. Fotobioreaktorer gör det möjligt för forskare att studera ett brett spektrum av phototrophs i noggrant kontrollerade satssystem, där även långsamt växande arter skyddas från rovdjur eller konkurrerande mikroorganismer⁴. Dessa batchsystem är också bättre på att underlätta större CO₂ utnyttjandegrad och biomassa produktivitet eftersom de är slutna system som är mer benägna att vara i jämvikt med levererade gaser. Photobioreactor tekniken erbjuder också pH-kontroll, vars brist har hindrat hög biomassa produktivitet i tidigare studier⁵. I bänk skala, den nivå av kontroll som erbjuds av photobioreaktorer är fördelaktigt för forskare. Vid större industriella skalor, fotobioreaktorer kan användas för att bibehålla kommersiell bio produktrenhet och förbättra produktionseffektiviteten för nutraceutical, kosmetika, livsmedel, eller foder applikationer⁶.

Mikroalger är av stort intresse för biosequestration av CO₂ eftersom de snabbt kan fixa Co₂ som biomassa kol. De flesta antropogena källorna till CO₂ är dock förorenade med andra frätande och giftiga gaser eller föroreningar (No_x, so_x, Co, Hg), beroende på bränsle källan för förbränningsprocessen. Växande intresse för hållbar CO₂ upptagning har föranlett utvecklingen av photobioreactor teknik för att behandla Co₂-rika utsläpp, såsom de från koleldade kraftverk (tabell 1). Tyvärr finns det inneboende risk för mänsklig och miljömässig exponering för frätande och giftiga föroreningar under forskning och skala upp processer. Som sådan, beskriver säker montering och drift av bioreaktorer med frätande gaser är nödvändigt och lärorikt.

Denna metod är för användning av en 2 L bänk skala foto bioreaktor för tillväxt av mikroalger under noggrant kontrollerade experimentella förhållanden. Protokollet beskriver microalgal lagring, inokulum förberedelse, och photobioreactor installation och sterilisering. Utöver grundläggande verksamhet beskriver detta arbete mikroalger biomassa mätningar och biomassa produktivitets beräkningar, och anpassning av utrustning för mikroalger odling med frätande gaser. Protokollet som beskrivs nedan är lämpligt för forskare som vill utöva större experimentell kontroll, optimera mikroalg tillväxtvillkor, eller axenically kultur en rad fototrofiska mikrober. Denna metod beskriver inte lämpliga material för odling av mikrober som producerar eller konsumerar brandfarliga gaser (t. ex. CH₄, H₂, etc.) ⁷.

Protocol

1. säker användning och provtagning av en foto bioreaktor med frätande gaser

Anmärkning: denna metod beskriver inte lämpliga förfaranden för säker provtagning av mikroalger kulturer som producerar eller konsumerar mycket brandfarliga gaser.

1. Att hantera giftig gas som en risk för människors hälsa.
   Anm: per University of Iowa: s kemikalie hygien plan, författarna arbetat med universitetets brandsäkerhets samordnare och University Environmental Health & Safety industrihygien officer att utveckla ett säkerhetsprotokoll för att arbeta med de giftiga gaserna.
2. Inrätta ett giftigt gas övervakningssystem med sensorer för var och en av de giftiga gaser som används. Kalibrera sensorerna enligt tillverkarens anvisningar. Bump test (kontrollera om sensorn och alarmfunktioner med kalibreringsgaser) ofta, enligt tillverkarens anvisningar. Lokalisera gasmonitorn precis utanför draghuven.
3. Innan du påbörjar någon frätande gas experiment, meddela närliggande personal av risk och larmsystem. Meddela också lämpliga lokala räddningspersonal. Post skyltar på laboratorie ingångar som specificerar vilka farliga gaser som används.
   1. Instruera all personal i närheten att evakuera om giftig gas upptäcks. Meddela laboratorie handledare och räddningspersonal.
      Obs: i ett strömavbrott, gas-reglerande tornet kommer att stoppa gasflödet när det förlorar ström. Men om rumsuppvärmning, ventilation, och luftkonditionering (HVAC) system eller draghuv gå ner utan ett strömavbrott, detta kommer att resultera i läckande giftig gas.
4. Modellera den möjliga ackumulerade koncentrationen av giftiga gaser i rummet om rök huven skulle misslyckas med hjälp av American Industrial hygien Association ' s (AIHA) matematisk modellering kalkylblad IH MOD⁸ för varje gas.
   1. Få rums försörjning/frånluftsluft, Q, i m³ min^-1 från att bygga VVS-underhållspersonal eller VVS-tekniker. Beräkna volymen, V, för laboratoriet (L x b x H) i m³. Beräkna föroreningsgraden, G, av varje typ av giftig gas i mg min^-1, med hjälp av ekvation 1 anpassad från ideal gas lag:
      1
      där P är den fraktion av tryck som utövas av den giftiga gasen vid 1 ATM (ppm gas/^{10 6} ppm) , Q_gas är flödet av gasen i L min^-1, R är den universella gasen konstant (0,082057 L · ATM · mol^-1· K^-1), T är temperaturen i k, och MW är gasen molekylvikt i g mol^-1.
   2. Använd värdena för V, Qoch G för varje gas (beräknat i steg 1.4.1) i "väl blandad rum modell med möjlighet att upphöra generering och modell Room PURGE" algoritm i IH mod kalkylblad för att beräkna de ackumulerade rumgaskoncentrationer för varje gas över en 1440 min (24 h) simulerings period. Jämför dessa värden med exponeringsgränserna (tabell 2)⁹.

2. beredning av mikroalger inokulum

1. Förbered Scenedesmus obliquus inoculum, eller andra mikroalger arter som valts ut för photobioreactor, före starten av experimentet genom att överföra den från lagring, om kryopreserved eller odlas på agar media.
   1. Tillsätt 30 − 50 mL sterilt mikroalg tillväxtmedium (Triple-nitrogen Bold ' s basala medium [3N-BBM], tabell 3) till en steril (150 − 250 ml) skakkolv som är utjämnade med en skum propp.
      Anmärkning: om kolven inte är avsparkad bör endast en femtedel av volymen av skakkolven upptas av flytande medier.
   2. Använd ett biosäkerhetsskåp för att bibehålla sterilitet vid överföring av celler till en lutande eller skakkolv. För kulturer på agar, Använd en steril slinga för att överföra mikroalger från dess agarplatta eller lutande till skakkolven. För kryopreserverade kulturer, Tina gradvis det kryopreserverade provet och skölj bort kryoprotectant enligt det valda protokollet¹⁰, tillsätt sedan cellerna till Shake kolv.
   3. Kultur celler i 3N-BBM vid 20 − 25 ° c under 16 h:8 h ljus: mörk och skakning vid 115 − 130 RPM.
   4. Spåra mikroalger tillväxt över tid med hjälp av optisk densitet (OD) mätningar (som i avsnitten 5 och 6). Låt mikroalger att nå sin exponentiella tillväxtfas (2 − 4 dagar) innan du överför celler till photobioreactor.
      Anmärkning: beroende på experimentets mål kan cellerna sköljas av odlingssubstrat (denna studie) och/eller koncentreras med flera centrifugeringssteg före inympningen av bio reaktorn.

3. installation och drift av photobioreactor

1. Använd foto bio reaktorn (figur 1) för att kontrollera temperatur, pH, omrörnings hastighet, gasflöden och flödeshastigheter för ingångs lösning.
   Obs: foto bio reaktorn kan användas för att kontrollera flödet av upp till fyra olika ingångs lösningar, vanligen syra, bas, antifoam, och substrat.
   1. Förbered 100 mL vardera av 1 N NaOH och 1 N HCl och tillsätt varje till en 250 mL inmatnings lösning flaska. Använd sekundär inneslutning för dessa lösningar.
   2. Förvara uppmätta ingångs lösningar i autoklaverbara tak flaskor utrustade med dopprör och ett ventilationsrör med ett sterilt inline luftfilter. Anslut DIP rören till photobioreactor fyra ingångsportar med autoklaverbara slangar och under photobioreactor drift, eller dip rören i input Solutions. Passera 1,6 mm inuti dimeter (ID) Autoklaverbar slang mellan ingångs lösningarna och deras hamnar genom separata Peristaltiska pumpar som kan styras antingen genom manuellt valda flöden eller genom återkoppling från pH-och skum nivå sonder (i fråga om syra, och kisel-lösningar).
2. Kalibrera photobioreactor pH-mätaren före autoklavering.
   1. Anslut pH-sonden till foto bioreaktor kontrolltornet genom att montera sonden till anslutningsledningen och vrida för att låsa. Använd pH 4 och pH 7 buffertar för att kalibrera pH-mätaren. Vänta tills värdena har stabiliserats innan du accepterar pH-mätarens värde.
   2. Koppla bort pH-sonden från pH-mätarens sladd som förbinder sonden med kontrolltornet.
   3. Yta sterilisera med 70% etanol eller autoklav sonden med reaktorn. Till autoklav, locket pH sonden tätt med aluminiumfolie.
      Anmärkning: om sonden är autoklaverad, finns det en risk för korrosion av sonden interiören från ånga skador. Denna tak-metod garanterar inte helt förebyggande av skador.
   4. Tillsätt 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-etanesulfonic Acid (HEPES) buffert till odlingsmediet för att bättre kontrollera pH.
3. Skär och skruva stängt kallt finger och avgas kondensor på photobioreactor huvud plattan.
4. Sätt in inympningsporten och skruva tätt på plats. Tillsätt en längd av autoklaverbara slangar till den del av inympningsporten ovanför photobioreactor huvud plattan. Innan du Autoklavera bio reaktorn, klämma slangen stängd med en Autoklaverbar slangklämma.
5. Fäst slangar utjämnade med sterila filter till alla oanvända photobioreactor portar.
6. Anslut syra-och bas ingångs lösningar till photobioreactor ingångsportar via Autoklaverbar slang. Lägg till 1,5 L kultur medium.
7. Autoklav reaktorn och tillhörande ingångs lösningar för 30 − 45 min vid 121 ° c enligt arbetsvolym.
   Anmärkning: om odlingsmediet påverkas negativt av autoklavering, Lägg till mediet efter autoklavering under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Protokollet kan pausas här.
   Varning: reaktorn kommer att vara varm efter avlägsnande från autoklav.
8. Fäst impellermotorn på impelleraxeln och dra åt tillbehöret.
9. Arrangera LED ljuspaneler symmetriskt utanför bio reaktorn enligt belysningskrav.
   1. Före autoklavering, mät och anteckna ljusintensiteten med en fotometer. Placera belysnings givaren inuti photobioreactor-kärlet och vänd sensorn mot ljuskällan.
10. Anslut upp till två gasflaskor för att leverera de simulerade utsläppen av koleldade kraftverk (tabell 1) till mikroalger i photobioreactor.
    Anmärkning: de gaskoncentrationer som används i denna studie approximerade dem vid University of Iowa Power Plant.
    1. Montera anslutningarna mellan gascylindern, gas reglerande torn, och photobioreactor Sparging ring. Fäst lämpliga regulatorer som kan utloppstrycket på 20 psi till gascylindrarna. Fäst 6 mm ID tryck tålig slang till regulatorn utlopp slang Barb och säkra med en slangklämma. Fäst den andra änden av den tryck resistenta slangen till gas reglerings tornet gas intag med en slang hulling till 6 mm Stem snabb anslutning montering säkras med en slangklämma. Anslut 3,2 mm ID-rör till gas uttaget med en annan 6 mm snabbkoppling och Anslut den andra änden av utloppsslangen till den sparsamma ring porten på photobioreactor huvud plattan.
       Anmärkning: för en andra inmatnings gas, upprepa steg 3.9.1, men Använd en T-formad slang hulling för att konsolidera de två ingångarna gasledningar till en enda sektion av röret ansluten till Sparging Ring port.
    2. Ställ in utloppstrycket till 20 psi på varje gas regulator och använda bioreaktor gränssnittet för att ställa experimentella gasflöden.
       Notera: beräkna och rapportera volymen av luft under standardförhållanden per volym av vätska per minut (VVM); dividera det volymetriska gasflödet med kultur volymen. Rapport i enheter per miniute.
11. Vid Sparging med mer än en gascylinder, bekräfta den medföljande CO₂ -koncentrationen till foto bio reaktorn med en co₂ -sensor.
    1. Anslut en programvara (t. ex. GasLab) kompatibel CO₂ -sensor till USB-porten på en dator. Ladda ner den senaste programvaran som motsvarar CO₂ -sensormodellen. Öppna programvaran och ange sensor modell, mätnings tidsintervall och varaktighet för loggning av mätdata.
    2. Placera CO₂ -sensorn och det kombinerade gas flödesröret (innan röret ansluts med bio reaktorn) i en 100 − 250 ml, försluten, ventilerad behållare (utanför bio reaktorn).
       Anmärkning: under experimentet kan headspace CO₂ -koncentrationerna mätas från en av avluftnings rören på foto bio reaktorns huvud platta.
    3. Starta CO₂ -koncentrationsmätningarna i användargränssnittet och vänta tills mätningarna är jämbrate.
    4. Använd photobioreactor användargränssnitt för att justera gasflödet från varje tank tills önskad total flödeshastighet (0,1 L min^-1) och co₂ koncentration (12%) uppnås.
12. På photobioreactor användargränssnittet använder du funktionen STIRR för att ställa in hjulets rotationshastighet. Se till att blandnings hastigheten är tillräckligt snabb för att odlingsmediet ska assimilera de spargade gasbubblorna.
    Observera: vissa arter av mikroalger har svaga cellstrukturer och kommer att skadas eller spruckna av hög skjuvkraft.

4. anpassning av foto bio reaktorn och experimentell inställning för användning av giftig gas

Varning: de frätande gaserna i verklig eller simulerad rökgas är frätande och giftiga. Dessa gaser utgör en allvarlig risk vid inandning.
Anmärkning: denna metod beskriver inte lämpliga material för säker odling av mikrober som producerar eller konsumerar mycket brandfarliga gaser (t. ex. metan, väte osv.).

1. Byt ut mässing, plast och standardrör komponenter med korrosionsbeständiga material.
   1. Använd rostfrittstål för att tillförlitligt motstå korrosion från de starka syror som bildas av reaktionen mellan NO_x eller så_x och vatten. Byt plast Quick Connect beslag på gas intag och uttag på gas-reglerande tornet med rostfrittstål Quick Connect beslag. Använd regulatorer av rostfrittstål för gasflaskor inklusive utloppsslangen Barb snarare än mässing.
   2. Använd polytetrafluoreten (PTFE) eller Natural etylvinylacetat (EVA) slangar för att motstå korrosion från NO_x och så_x gaser (respektive) på anslutningarna mellan gascylindern till gas-reglerande tornet och gas-reglerande tornet till photobioreactor.
2. Efter autoklavering, montera photobioreactor och gascylindrar inom en walk-in draghuv. Placera photobioreactor på ett bord inuti sekundär inneslutning och placera gasflaskor i fristående cylinder kragar eller en cylinder rack.
3. Efter initiering av gasflödet, Använd en bubbla typ vätska läcka detektor för att kontrollera om gasläckor i alla anslutningar mellan gasflaskor och bioreaktor. Använd en tvättflaska fylld med en 1:100 (v:v) utspädning av diskmedel: vatten för att täcka anslutningen med en liten ström av tvål lösning.
   Anmärkning: läckor kommer att indikeras genom bubblande vid anslutningarna.
4. Vid initiering av mikroalger experiment, börja Sparging sedan justera pH före inympning (som i vanliga photobioreactor experiment).
   Anmärkning: buffring odlingsmediet under frätande gas experiment rekommenderas starkt eftersom de ingående gaserna är starkt sura.
5. Inokulera foto bio reaktorn genom att aspirera den beredda mikroalgal-inokulum i en steril spruta, montera sprutan på slangen fäst vid inympningsporten, öppna inokuleringsslangen och trycka ned sprutan.
6. Kontrollera gasmonitorn, gascylinder trycket och foto bio reaktorn två gånger dagligen (och före provtagning) för förhöjda halter av giftig gas eller indikation på läckage.
7. Begränsa draghuv bågen öppning till en bredd som gör att bioreaktor och gascylinder regulatorer kan nås. För att undvika risken för inandning, se till att öppningen inte utsätter personalen ovanför bålen.
8. Vrid gascylinder regulatorerna till stängt läge för att upphöra med gasflödet till reaktorn. Stäng dragskålbågen och Tillåt 5 min för huven att evakuera korrosiva gaser innan provtagning av photobioreactor kulturen.
9. Prov i rök huven antingen genom att öppna en Headplate-port och använda ett sterilt serologiskt Pipettera eller en rit kultur i en spruta genom inympningen/provtagnings porten. Säkra foto bioreaktor portarna innan du öppnar gascylindrarna och återupptar experimentet.

5. mätning av mikroalger biomassa produktivitet

1. Använd en kalibreringskurva för att relatera mikroalger kultur OD₇₅₀ mätningar till torkade mikroalger biomassa koncentrationer.
   1. Förbered flera (minimum: 4, minsta arbetsvolym: 500 mL) kolvar med steril mikroalger medium och Inokulera med arten av intresse (t. ex., S. obliquus i denna studie).
   2. Mät kulturen OD₇₅₀ tills tillväxten är exponentiell, och genast provet prov flaskans genom filtrering kända volymer (minst 100 ml) av innehållet med ett 0,45 μm filtermembran av känd massa. Använd täckta aluminium väger båtar eller glas fartyg för att stödja biomassa och filter som de torkas.
   3. Samlas biomassan och filtren efter torkning för ca 18 − 24 h i en ugn mellan 80 − 100 ° c. För att kontrollera fullständig torkning, Mät igen efter ytterligare 2 − 3 h för att avgöra om massan har stabiliserats.
   4. Subtrahera filter massan från kombinerad biomassa och filter massa för att beräkna massan av biomassa.
   5. Rita kalibreringskurvan som uppmätt OD₇₅₀ mot biomassa koncentrationen (massan av biomassa dividerat med volymen av den filtrerade kulturen) och passa in data med en linjär regression.

6. modellering och beräkning av biomassa produktivitet

1. Beräkna experiment biomassa koncentrationer från OD₇₅₀ mätningar med hjälp av kalibreringskurvan linjär regression (bestäms i avsnitt 5).
2. Anpassa batch mikroalg tillväxtdata från lag till exponentiell till stationär fas med en Logistisk regression (ekvation 2) i gradig och statistik programvara (tabell över material):
   2
   där L är kurvans högsta koncentration av biomassa, är k den relativa lutning av den exponentiella fasen (tid^-1), x_o är tiden för den sigmoidala kurvan mittpunkten, och x är tid.
   1. Ange den logistiska ekvationen ovan manuellt. Välj Anpassa en kurva med ickelinjär regression på fliken analys i programvaran. Till vänster om rutan Parametrar: icke-linjär regression väljer du Skapa ny ekvation under den nya listrutan. Använd standard explicit ekvation som ekvationstyp, namnge den nya funktionen och definiera den nya funktionen som Y = L/(1 + exp (-k * (x-b))), där b representerar x_o.
3. Beräkna den totala biomassa produktiviteten hos mikroalg partiet genom att dividera skillnaden mellan den slutliga och den initiala koncentrationen av biomassa med skillnaden mellan den slutliga och den initiala tiden.
4. Beräkna den maximala biomassa produktiviteten av microalgal parti från derivatan av ekvation 2 (ekvation 3) vid sigmoideum mittpunkt, när x = x_o.
   3

Representative Results

En kalibreringskurva för de gröna mikroalger, S. obliquus, skördad i den exponentiella fasen, fastställdes med OD₇₅₀ och torkade biomassa koncentrationer (figur 2). Den linjära regressionen hade ett R² -värde på 0,9996.

En S. obliquus -kultur startades i en 250 ml Erlenmeyerkolv från en kultur lagrad på en kyld agarplatta. Den microalga inokulerades i 3N-BBM med 10 mM HEPES buffert och sparkad med 2,2% CO₂ i en 2 L photobioreactor med 1,5 L arbetsvolym (0,07 VVM) (figur 1). Partiet spårades via OD₇₅₀; koncentrationerna av biomassa beräknades från kalibreringskurvan och modellerades sedan med en logistisk kurva (figur 3). Den photobioreactor underhöll kulturen vid pH 6,8, 100 cm³ min^-1 totalt gas flöde, kontinuerlig 280 μmol m^-2 s^-1 belysning, och 27 ° c. Den logistiska kurvan passar biomassa koncentration data från lag till exponentiell till stationär fas. Från logistik modellen var den maximala koncentrationen av biomassa under partiet 2070 ± 20 mg L^-1, maximal biomassa produktivitet inträffade vid 4,6 dag, och andelen specifik biomassa produktivitet var 1,0 d^-1. Den maximala biomassa produktiviteten, beräknad från derivatan av den logistiska kurvan vid tiden för maximal tillväxt, var 532 ± 60 mg L^-1 d^-1.

Den väl blandade rums modellen användes för att beräkna den ackumulerade koncentrationen av NO₂, så₂, och Co i fråga om rök huven misslyckande för 24 h. Dessa värden jämfördes med exponeringsgränserna (tabell 2). Till exempel, i scenariot där 0,05 L min^-1 av 400 ppm nr₂ frigörs under en dragskåp Hood fel period av 24 h, den väl blandad rum modell med ingångar av beräknat G = 0,0377 mg min^-1, Q = 0,0001 m³ min^-1, V = 100 m³, och maximal tid för simulering = 1440 min förutspår ingen₂ ackumulering till 0,54 mg m^-3 (0,29 ppm), som är högre än den acceptabla kroniska exponeringsgränsen (amerikanska konferensen för statliga industriella hygienister tröskelgräns värde [ ACGIH TLV]) och under den kortfristiga exponeringsgränsen (STEL).

En lovande preliminär rättegång med simulerad rökgas uppnådde en högre maximal produktivitet för biomassa av mikroalger (690 ± 70 mg L^-1 d^-1) än den för 12% Co₂ och Ultra-nollluft (510 ± 40 mg l^-1 d^-1) (figur 4). Före experimentet kalibrerades en gasmonitor med CO, NO₂och so₂. Det simulerade rökgas experimentet utfördes utan risk för personal eller skador på utrustning från frätande gaser.

Figur 1: foto bioreaktor med bänkskiva upplyst av röda och blåa LED-lampor. Den photobioreactor fungerar som en 2 L parti reaktor med 1,5 L arbetsvolym. Den photobioreactor matas kontinuerligt med gaser genom Sparging ring och överskott gas ventiler genom hamnar i huvud plattan. Anpassad med tillstånd från Molitor et al.⁵. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: kalibreringskurva avseende OD₇₅₀ till S. obliquus cell torrvikt. S. obliquus cell Culture ljus absorption mättes vid 750 nm, sedan celler filtrerades och torkas för att få cell torrvikt mätningar. Omtryckt med tillstånd från Molitor et al.⁵. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: S. obliquus tillväxtdata på 2,2% Co₂ indata modelleras med en Logistisk regression. Datapunkterna representerar biomassa värden som beräknats utifrån mätningar av optisk densitet. Data har modellerats med en Logistisk regression genom en minsta kvadrat passform; där l = 1955 mg l^-1, k = 1,154 d^-1och x₀ = 3,317 d. R² = 0,995. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: modellerad S. obliquus tillväxt på 12% Co₂, med och utan ytterligare simulerade rökgas komponenter. Biomassa mätningar från varje omgång av mikroalger modellerades med logistiska regressioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Komponent	Procent
H2O	12,6%
CO2	11,6%
O2	5,8%
Co	0,048%
SO2	0,045%
NR2	0,022%
N2	69,9%

Tabell 1: sammansättning av utsläpp av koleldade kraftverk. Dessa kvantiteter var i genomsnitt från University of Iowa kraftverks utsläpp data som samlats in i minuten intervall under loppet av 10 h.

Giftig gas	Twa	Tak	STEL	NIOSH IDLH	NIOSH REL	ACGIH TLV	CDC Beskrivning
Co	35 ppm	200 ppm	-	1 200 ppm	35 ppm	25 ppm	Färglös, luktfri
SO2	2 ppm	100 ppm	5 ppm	100 ppm	2 ppm	2 ppm	Färglös gas med karakteristisk, irriterande, stickande lukt
NR2	3 ppm	5 ppm	1 ppm	13 ppm	1 ppm	0,2 ppm	Gulbrun vätska eller rödbrun gas (över 70 ° f) med en stickande, fräckhet lukt

Tabell 2: exponeringsgränser och beskrivningar för giftiga gaser (Co, so₂, No₂) i rökgas. OSHA TWA: tidsvägt medelvärde (vanligtvis 8 h period), tak: värde aldrig nås, STEL: korttidsexponering gräns (TWA över 15 min), NIOSH IDLH: fara för liv och hälsa, NIOSH REL: 15 min exponeringsgräns, ACGIH TLV: acceptabel kronisk exponeringsgräns, inga skadeverkningar.

Sammansatta	Mm
NaNO3	8,82 x 100
MgSO4· 7h2O	3,04 x 10-1
Nacl	4,28 x 10-1
K2HPO4	4,31 x 10-1
KH2Po4	1,29 x 100
CaCl2· 2H2O	1,70 x 10-1
ZnSO4· 7h2O	3,07 x 10-2
MnCl2· 4h2O	7,28 x 10-3
MoO3	4,93 x 10-3
CuSO4· 5H2O	6,29 x 10-3
Co (nr3)2· 6H2O	1,68 x 10-3
H3bo3	1,85 x 10-1
Edta	1,71 x 10-1
Koh	5,52 x 10-1
FeSO4· 7h2O	1,79 x 10-2
H2so4 (koncentrerad)	1 x 10-3 μl

Tabell 3: sammansättning av Triple-nitrogen Bold ' s basala medium (3N-BBM). Mängden kväve har tredubblats från den ursprungliga Bold ' s basal medium¹¹.

Discussion

Batch, axenic photobioreactor experiment med reglerade pH, temperatur, gas flöde, och gaskoncentrationen främja meningsfulla resultat genom att eliminera kontaminering av icke-mål alg stammar och variationer i odlingsförhållanden. Noggrann renodling tillväxt kinetik kan erhållas även i närvaro av frätande gaser (CO₂, så₂, nr₂), som fungerar som näringsämnen, svarvning avgaser till en värdefull produkt som djurfoder.

Innan du påbörjar någon microalgal experiment, den valda microalga kulturen bör tas från lagring och justeras till flytande kultur. Odling av mikroalger i exponentiell fas förbättrar sannolikheten för att experiment har likvärdiga initial betingelser och att mikroalger inte stagnerar i lag-fasen efter inympning.

Kalibreringskurvor avseende optisk densitet och biomassa koncentrationer är särskilt viktiga under studier av biomassa produktivitet. Hög mikroalger biomassa produktivitet är ett av de viktigaste målen för microalgal industrin och, som sådan, är ofta en indikator på forskning framgång¹². Noggranna beräkningar av biomassa koncentrationen från mätningar av optisk densitet måste därför bero på artspecifika, precisa och exakta kalibreringskurvor. För att undvika eventuella optiska störningar är det viktigt att mätningarna för kalibreringskurvan och under experimentet görs i motsvarande bakgrunds lösningar. Dessutom bör kalibreringskurvan göras med mätningar tagna från mikroalger i den (de) tillväxtfas (er) som är mest representativa för de i experimenten. Vissa mikroalger arter kan ha dramatiska skillnader i Cellstorlek under olika tillväxtfaser som kan förändra den optiska densiteten och upplevda biomassa koncentrationer. Det bör noteras att biomassa produktiviteten är relaterad till, men inte likvärdig, tillväxttakten. Specifik tillväxttakt beror på antalet celler (förändring i celltäthet över tid/celltäthet) närvarande, och specifik biomassa produktivitet beror på Mass massan av celler (förändring i mg/L biomassa över tid per mg/L biomassa)¹³ närvarande.

När koncentrationerna av mikroalger av biomassa modelleras med en logistisk kurva kan experimentella resultat jämföras på ett meningsfullt sätt genom interpolerande biomassa koncentrationer och exakt beräkning av biomassa produktiviteten. Försiktighet bör dock iakttas vid tolkningen av dessa experimentella resultat; Det är olämpligt att jämföra den totala och högsta produktiviteten i satsvis biomassa. Även om de maximala produktivitets värdena för biomassa är användbara för att jämföra batchresultat, är den totala biomassa produktiviteten vilseledande utan ytterligare information om experimentets varaktighet och tillväxtfaser för mikroalger. Dessa priser ändras kontinuerligt under fördröjning, log tillväxt och stationära faser.

Vid experiment med frätande gaser som är karakteristiska för kraftverks-eller industri förbränningsutsläpp bör försiktighet iakttas för både människors hälsa och utrustningens livslängd. Standard delar måste bytas ut mot mer robusta material, och förbrukningsvaror som slangar bör inspekteras och bytas oftare för att motstå korrosion, förhindra läckage och undvika mänsklig exponering. Extra säkerhetsåtgärder och riskmedvetenhet är avgörande för säker och lyckad drift och provtagning. Metoden lämpar sig inte för brandfarliga gaser eftersom det finns potential för ansamling av gas i headspace och utrustningen är varken konstruerad för sådana risker eller lämplig för säker anpassning till sådana förhållanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biostat A bioreactor	Sartorius Stedim		2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control
Bump test NO2 gas	Grainger	GAS34L-112-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test O2, CO, LEL gas	Grainger	GAS44ES-301A	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test SO2 gas	Grainger	GAS34L-175-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Corrosion resistant tubing for NO2 gas	Swagelok	SS-XT4TA4TA4-6	PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement
Corrosion resistant tubing for SO2 gas	QC Supply	120325	Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0121 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 100%
cozIR 20% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0123 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 20%
Durapore Membrane Filter, 0.45 μm	Millipore Sigma	HVLP04700	Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters
Gas cylinder regulators	Praxair	PRS 40221331-660	Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
Gas cylinders	Praxair	Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition	Dependent on study objectives
Gas monitoring and leak detection system	RAE Systems by Honeywell	MAB3000235E020	Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL
GasLab software	GasLab	v2.0.8.14	Software for CO2 meter measurements and data logging
Hose barb	Grainger	Item # 3DTN3	Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
K30 1% CO2 meter	Senseair	CM-0024 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations less than 1%
LED grow panels	Roleadro	HY-MD-D169-S	Red & blue LED light panels
Memosens dissolved oxygen probe	Endress+ Hauser	COS22D-19M6/0	Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor
Memosens pH probe	Endress+ Hauser	CPS71D-7TB41	Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor
Oven, Isotemp 500 Series	Fisher Scientific	13246516GAQ	Small oven for drying
Prism GraphPad software	GraphPad Software	Version 7.03 or 8.0.1	Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs
Stem to hose barb fitting	Swagelok	SS-4-HC-A-6MTA	Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID
Tubing, dilute acid/base transfer	Allied Electronics and Automation	6678441	Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade
Tubing, gas transfer	Allied Electronics and Automation	6678444	Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade