Her presenterer vi en protokoll for fluorescerende antistoffmediert påvisning av proteiner i hele preparater av sebrafiskembryoer og larver.
Immunohistochemistry er en mye brukt teknikk for å utforske proteinuttrykk og lokalisering under både normale utviklings- og sykdomstilstander. Selv om mange immunhistokjemiprotokoller er optimalisert for pattedyrvev og vevsseksjoner, krever disse protokollene ofte modifisering og optimalisering for ikke-pattedyrmodellorganismer. Sebrafisk brukes i økende grad som modellsystem i grunnleggende, biomedisinsk og translasjonell forskning for å undersøke molekylære, genetiske og cellebiologiske mekanismer for utviklingsprosesser. Sebrafisk tilbyr mange fordeler som modellsystem, men krever også modifiserte teknikker for optimal proteindeteksjon. Her gir vi vår protokoll for helmount fluorescens immunohistochemistry i sebrafisk embryoer og larver. Denne protokollen beskriver i tillegg flere ulike monteringsstrategier som kan brukes og en oversikt over fordelene og ulempene hver strategi gir. Vi beskriver også endringer i denne protokollen for å tillate påvisning av kromogene substrater i hele mount vev og fluorescens deteksjon i seksjonert larvevet. Denne protokollen gjelder bredt for studiet av mange utviklingsstadier og embryonale strukturer.
Sebrafisken (Danio rerio) har dukket opp som en kraftig modell for studiet av biologiske prosesser av flere grunner, inkludert kort generasjonstid, rask utvikling og amenabilitet til genetiske teknikker. Som et resultat brukes sebrafisk ofte i høye gjennomstrømning små molekylskjermer for toksikologisk forskning og narkotikaoppdagelse. Sebrafisk er også en attraktiv modell for studiet av utviklingsprosesser gitt at en enkelt kvinne rutinemessig kan produsere 50-300 egg om gangen, og de optisk klare embryoene utvikler seg eksternt slik at det kan foreffektiv visualisering av utviklingsprosesser. Tidlig forskning var imidlertid hovedsakelig avhengig av fremover genetiske skjermer ved hjelp av N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagens på grunn av utfordringer i å etablere omvendt genetiske teknikker. For omtrent to tiår siden ble morfonoer først brukt i sebrafisk til å slå ned målrettede gener1. Morpholinos er små antisense oligonucleotides som hemmer oversettelse av mål mRNA etter mikroinjeksjon i et embryo på et tidlig utviklingsstadium. En stor svakhet i morfonoer er at de fortynnes når cellene deler seg og mister generelt effektiviteten med 72 timer etter befruktning (hpf). Mens morfonoer forblir et kraftig verktøy for sebrafisk genforstyrrelser, transkripsjon aktivator-lignende effektor nucleases (TALENs), sink-finger nucleases (ZFNer), og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPRs) blir nylig brukt til å direkte målrette sebrafisk genom2,3. Disse omvendte genetiske strategiene, i kombinasjon med fremover genetikk og høye gjennomstrømningsskjermer, har etablert sebrafisken som en kraftig modell for å studere genuttrykk og funksjon.
Evnen til å studere genfunksjon krever generelt en evaluering av spatio-temporal fordeling av gen- eller genproduktuttrykk. De to mest brukte teknikkene for å visualisere slike uttrykksmønstre under tidlig utvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunohistochemistry (IHC). In situ hybridisering ble først utviklet i 1969 og er avhengig av bruk av merkede antisense RNA-sonder for å oppdage mRNA-uttrykk i en organisme4. I motsetning brukes merkede antistoffer i immunhistokjemi for å visualisere proteinuttrykk. Ideen om merking proteiner for deteksjon dateres tilbake til 19305 og det første IHC eksperimentet ble publisert i 1941 da FITC-merkede antistoffer ble brukt til å oppdage patogene bakterier i infiserte vev6. ISH og IHC har utviklet seg og forbedret seg betydelig i løpet av de påfølgende tiårene, og brukes nå begge rutinemessig i molekylær- og diagnostisk forskningslaboratorium7,8,9,10,11. Mens begge teknikkene har fordeler og ulemper, tilbyr IHC flere fordeler over ISH. Praktisk talt er IHC mye mindre tidkrevende enn ISH og er generelt billigere avhengig av kostnaden for det primære antistoffet. I tillegg er mRNA-uttrykk ikke alltid en pålitelig beregning av proteinuttrykk som det har blitt demonstrert hos mus og mennesker at bare omtrent en tredjedel av proteinoverflodsvariasjonen kan forklares av mRNA overflod12. Av denne grunn er IHC et viktig supplement for å bekrefte ISH-data, når det er mulig. Til slutt kan IHC gi subcellulære og samlokaliseringsdata som ikke kan bestemmes av ISH13,14,15. Her beskriver vi en trinnvis metode for å på en pålitelig måte oppdage proteiner ved immunhistokjemi i hele mount sebrafiskembryoer og larver. Målet med denne teknikken er å bestemme det romlige og timelige uttrykket av et protein av interesse for hele embryoet. Denne teknologien benytter antigenspesifikke primære antistoffer og fluorescerende merket sekundære antistoffer. Protokollen er lett tilpasningsdyktig til bruk på lysbildemonterte vevseksjoner og for bruk med kromogene substrater i stedet for fluorescens. Ved hjelp av denne protokollen viser vi at utvikling av sebrafisk skjelettmuskulatur uttrykker ionotropiske glutamatreseptorer, i tillegg til acetylkolinreseptorer. NMDA-type glutamat reseptor underenheter er påviselig på langsgående muskelved 23 hpf.
Immunohistochemistry er et allsidig verktøy som kan brukes til å karakterisere spatio-temporal uttrykk for nesten alle proteinav interesse i en organisme. Immunohistochemistry brukes på et bredt utvalg av vev og modellorganismer. Denne protokollen er optimalisert for bruk i sebrafisk. Immunhistokjemi i forskjellige arter kan kreve forskjellige fikserings- og håndteringsteknikker, blokkerende løsninger avhengig av arter og tilstedeværelse av endogene peroksidaer, og inkubasjonstider på grunn av tykkelsen og sammens…
The authors have nothing to disclose.
Støtte fra NIH bevilge 8P20GM103436 14.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
Microwave oven | Toastmaster | ||
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superglue gel | 3M Scotch | ||
TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |