Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

doi: 10.3791/60575 Published: January 29, 2020

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

Abstract

المناعة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لاستكشاف التعبير عن البروتين وتوطينه خلال كل من حالات النمو والأمراض الطبيعية. على الرغم من أن العديد من بروتوكولات الكيمياء المناعية قد تم تحسينها لأنسجة الثدييات وأقسام الأنسجة ، فإن هذه البروتوكولات غالبًا ما تتطلب التعديل والتحسين للكائنات النموذجية غير الثديية. تستخدم سمكة الحمار الوحشي بشكل متزايد كنظام نموذجي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية والانتقالية للتحقيق في الآليات الجزيئية والوراثية والبيولوجية للخلايا في عمليات التطوير. حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنظام نموذجي ولكن أيضا تتطلب تقنيات معدلة للكشف عن البروتين الأمثل. هنا ، نقدم بروتوكولنا لكامل جبل الفلورالكيمياء المناعية في أجنة حمار وحشي واليرقات. ويصف هذا البروتوكول بالإضافة إلى ذلك عدة استراتيجيات مختلفة للتركيب يمكن استخدامها ونظرة عامة على المزايا والعيوب التي توفرها كل استراتيجية. كما نصف أيضًا التعديلات المدخلة على هذا البروتوكول للسماح بالكشف عن ركائز الكروموجين في أنسجة اليتصاعد الكاملة والكشف عن الفلورسينس في أنسجة اليرقات المقطعة. ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على دراسة العديد من مراحل النمو والهياكل الجنينية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ظهر سمك الحمار الوحشي(Danio rerio)كنموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية لعدة أسباب بما في ذلك وقت الجيل القصير ، والتطور السريع ، وسهولة التقنيات الوراثية. ونتيجة لذلك، تستخدم عادة حمار وحشي في المستويات العالية من الإنتاجية الصغيرة الجزيئات شاشات للبحوث السمية واكتشاف المخدرات. كما أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج جذاب لدراسة عمليات النمو بالنظر إلى أن أنثى واحدة يمكنها إنتاج 50-300 بيضة بشكل روتيني في كل مرة، وأن الأجنة الواضحة بصريًا تتطور خارجيًا مما يسمح بالتصور الفعال لعمليات النمو. ومع ذلك، اعتمدت الأبحاث المبكرة في الغالب على الشاشات الوراثية الأمامية باستخدام N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) أو غيرها من المغيرات بسبب التحديات في إنشاء تقنيات وراثية عكسية. منذ ما يقرب من عقدين من الزمان ، تم استخدام موربولينو لأول مرة في حمار وحشي لضرب الجينات المستهدفة1. مورفولينوس هي قلة القلة المضادة للشعور الصغيرة التي تمنع ترجمة مرنا المستهدفة بعد الحقن المجهري في الجنين في مرحلة مبكرة من النمو. نقطة ضعف رئيسية من موربولينوس هو أنها مخففة كما تنقسم الخلايا وتفقد فعاليتها عموما من قبل 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf). في حين أن morpholinos لا تزال أداة قوية لتعطيل الجينات حمار وحشي، النسخ المنشط مثل تأثير nucleases (TALENs)، nucleases الزنك الإصبع (ZFNs)، ومتجمعة بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPRs) يتم استخدامها في الآونة الأخيرة لاستهداف الجينوم حمار وحشي مباشرة2،3. وقد أنشأت هذه الاستراتيجيات الجينية العكسية، إلى جانب علم الوراثة إلى الأمام وشاشات الإنتاجية العالية، سمك الحمار الوحشي كنموذج قوي لدراسة التعبير الجيني والوظيفة.

تتطلب القدرة على دراسة وظيفة الجينات بشكل عام تقييمًا للتوزيع المكاني والزمني للتعبير عن الجينات أو المنتجات الجينية. الأسلوبان الأكثر استخداماً لتصور أنماط التعبير هذه أثناء التطوير المبكر هما التهجين في الموقع (ISH) وكيمياء الهيستوكيميائية الكاملة (IHC). في الموقع تم تطوير التهجين لأول مرة في عام 1969 ويعتمد على استخدام مسابير الحمض النووي الريبي المضادة للتحسس للكشف عن تعبير مرنا في كائن حي4. في المقابل، يتم استخدام الأجسام المضادة المسماة في الكيمياء المناعية لتصور التعبير البروتيني. تعود فكرة وضع العلامات على البروتينات للكشف عنها إلىعام 1930 و5 وتم نشر أول تجربة للسنة الدولية للخدمات الإنسانية في عام 1941 عندما تم استخدام الأجسام المضادة المسماة FITC للكشف عن البكتيريا المسببة للأمراض في الأنسجة المصابة6. وقد تطورت ISH وIHC بشكل ملحوظ على مدى العقود اللاحقة ، وتستخدم الآن على حد سواء بشكل روتيني في مختبر البحوث الجزيئية والتشخيصية7،8،9،10،11. في حين أن كلا التقنيتين لها مزايا وعيوب ، تقدم المدينة العالمية للخدمات الإنسانية العديد من الفوائد على ISH. عمليا ، هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة من ISH وعموما أقل تكلفة اعتمادا على تكلفة الأجسام المضادة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، التعبير مرنا ليست دائما مقياس موثوق به من التعبير البروتين كما ثبت في الفئران والبشر أن حوالي ثلث فقط من البروتين وفرة الاختلاف يمكن تفسيره من قبل وفرة مرنا12. لهذا السبب، تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مكملاً هاماً لتأكيد بيانات ISH، عندما يكون ذلك ممكناً. وأخيراً، يمكن أن توفر المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بيانات دون خلوية وبيانات توطين مشترك لا يمكن تحديدها بواسطة ISH13و14و15. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة للكشف الموثوق عن البروتينات عن طريق الكيمياء المناعية في أجنة ويرقات حمار وحشي جبل كامل. الهدف من هذه التقنية هو تحديد التعبير المكاني والزماني لبروتين مهم في الجنين بأكمله. تستخدم هذه التقنية الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضدات والأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلور. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام على أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح وللاستخدام مع ركائز كروموجينية بدلاً من الفلورسينس. باستخدام هذا البروتوكول, ونحن نثبت أن تطوير حمار وحشي العضلات الهيكل العظمي يعبر عن مستقبلات الغلوتامات ionotropic, بالإضافة إلى مستقبلات أستيل. NMDA من نوع الغلوتامات مستقبلات الوحدات الفرعية يمكن الكشف عنها على العضلات الطولية في 23 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على إجراءات العمل مع البالغين والمستثرين من تربية سمك الحمار الوحشي الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعة ولاية موراي.

1. جمع الأجنة والتثبيت

  1. إعداد خزانات التفريخ عن طريق وضع أزواج الجنس المختلط حمار وحشي الكبار أو مجموعات في خزانات مع بطانة شبكة أو مشقوق مليئة بمياه النظام بين عشية وضحاها.
  2. عند تشغيل الأضواء، قم بتغيير مياه خزان التفريخ للحصول على مياه النظام العذبة لإزالة البراز. استخدم دورة داكنة فاتحة 14 ساعة/ساعة مع أضواء قادمة في الساعة 9 صباحًا.
  3. بمجرد وضع البيض، أعد البالغين إلى الخزانات المنزلية.
  4. جمع البيض عن طريق رسم لهم حتى باستخدام أنبوب نقل أو صب لهم في مصفاة شبكة.
  5. نقل البيض إلى أطباق بيتري مليئة في منتصف الطريق مع وسط الجنين (مثل 30٪ دانيو أو E2 وسط الجنين مع 0.5 ملغ / لتر الميثيلين الأزرق)، والحد من عدد الأجنة لكل طبق إلى 50.
  6. إزالة أي البيض التي هي ميتة أو تفشل في الانقسام.
    ملاحظة: يمكن التعرف بسهولة على الأجنة الميتة لأنها تصبح معتمة وغالباً ما تظهر "غائمة". إذا تمت إضافة الأزرق الميثيلين إلى وسط الجنين، فإن الأجنة الميتة تأخذ مظهرًا أزرق داكنًا.
  7. احتضان أطباق البيض عند 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة. لهذه التجربة، ارفع الأجنة حتى 23 ح. بف.
  8. اختياري) نقل الأجنة في 24 hpf إلى 200 ميكرومتر 1-الفينيل 2-thiourea (PTU) في وسط الجنين لمنع تكوين الميلانينوسيس16،17. بدلاً من ذلك، الأجنة المبيضة بعد التثبيت (انظر القسم الاختياري 5).
  9. تغيير متوسط الجنين أو PTU المتوسط يوميا.
  10. Dechorionate الأجنة غير المفقسة باستخدام ملقط فائقة الدقيقة تلميح تحت المجهر. بدلا من ذلك، الأجنة dechorionate كيميائيا عن طريق احتضان في 1 ملغ / مل بروناس في وسط الجنين لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجنة من بروناس وغسل ثلاث مرات مع وسط الجنين.
  11. الأجنة الديشورية سوف تلتصق بالبلاستيك الاحتفاظ بها في الزجاج أو البلاستيك بيتري أطباق مغلفة 1-2٪ agarose المذابفية في وسط الجنين. نقل الأجنة dechorionated باستخدام الأنابيب باستور المصقول النار للحد من الضرر.
  12. نقل الأجنة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام البلاستيك أو أنبوب مصقول النار.
  13. إزالة وسط الجنين مع ميكروبيبيت. اترك سائلًا كافيًا فقط لتغطية الأجنة بعد كل تغيير في السوائل.
  14. إعداد 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) في غطاء الدخان الكيميائية.
    تنبيه: PFA هو مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة في المناطق المحددة.
  15. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA لمدة 1-2 ساعة مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، إصلاح الأجنة 4 ساعات إلى بين عشية وضحاها في 4 °C.
  16. غسل ثلاث مرات في 1x PBS + 1٪ تريتون-X (PBTriton) لمدة 5 دقيقة.
  17. استخدم الأجنة على الفور أو تخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  18. للتخزين على المدى الطويل، وتجفيف الأجنة في الميثانول 100٪ (MeOH) 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية. تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية في MeOH لعدة أشهر.
    تنبيه: MeOH هي مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة في المناطق المحددة.

2. إعداد الجنين

  1. إعادة ترطيب الأجنة من خلال الاحتضان التسلسلي في درجة حرارة الغرفة.
    1. احتضان في 75 ٪ MeOH / 25 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    2. احتضان في 50 ٪ MeOH / 50 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    3. احتضان في 25 ٪ MeOH / 75 ٪ 1x PBS لمدة 5 دقيقة ، هزاز.
    4. احتضان في 100٪ PBTriton لمدة 5 دقيقة، هزاز.
  2. (اختياري) إعداد محلول عمل بروتينات K طازج (10 ميكروغرام/مل في PBTriton) على الثلج عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من مخزون البروتينات K المذاب ة حديثًا (10 ملغم/مل).
    1. Permeabilize الأجنة عن طريق هضم ما يصل إلى 30 دقيقة في بروتينات K.
      ملاحظة: التوقيت المقترح هو < 24 hpf: لا الهضم; 24 hpf: 15 دقيقة الهضم; و 7 أيام من العمر: 30 دقيقة الهضم.
    2. شطف الأجنة permeabilized في PBTriton وإعادة إصلاح في 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. غسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.

3. حضانة الأجسام المضادة الأولية

  1. حدد محلول حظر تجاري أو مصل يطابق الأنواع المضيفة الثانوية للأجسام المضادة (على سبيل الـ 10٪ مصل الماعز في PBTriton) مع أو بدون 2 ملغ /مل بومبلس البقري الألبومين (BSA).
  2. منع الأجنة في حل حجب لمدة 1-3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية أثناء هزاز.
  3. احتضان في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب أو 1٪ مصل في PBTriton بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز. في هذه التجربة، كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة المضادة NMDAR1، ومستقبلات مكافحة عموم AMPA، ومكافحة فوسفو-هيستون H3، كل المخفف إلى تركيز نهائي من 1:500 في 1٪ مصل الماعز في PBTriton.
  4. يغسل خمس مرات في PBTriton لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء الهزاز.

4. حضانة الأجسام المضادة الثانوية

  1. حدد جسمًا مضادًا ثانويًا استنادًا إلى الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي والطول الموجي المطلوب.
  2. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية المخفف في محلول الحجب أو 1٪ مصل لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية) أثناء هزاز.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية الفلورية حساسة للضوء. استخدمنا 1:500 الماعز المضادة للفأرة Alexa488 المخفف في 1٪ مصل الماعز في PBTriton.
  3. تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم أو تغطية مع مربع حجب الضوء لهذا وجميع الخطوات اللاحقة.
  4. يغسل ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الهزاز.
  5. نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني على سرير من 2٪ أغاروز في وسط الجنين والمضي قدما في التوثيق أو المضي قدما في مزيد من خطوات المعالجة أدناه.

خطوات اختيارية

5- التبييض

  1. إعداد محلول التبييض في أنبوب 1.5 مل عن طريق إضافة 810.7 ميكرولتر من ddH2O، 89.3 ميكرولتر من 2 م كوه، و 100 ميكرولتر من 30٪ H2O2.
  2. عكس الأنبوب ثلاث مرات لخلط.
  3. ماسيت 1 مل من اتجاه محلول التبييض إلى الأجنة.
  4. افتح غطاء أنبوب الجنين للسماح للغاز بالهروب. اضغط بلطف على الأنبوب على مقاعد البدلاء لطرد الفقاعات.
  5. مراقبة عملية التبييض (استخدام المجهر إذا لزم الأمر) ووقف رد الفعل عندما تتم إزالة الصباغ بما فيه الكفاية (حوالي 5 دقيقة ل24 hpf أو 10 دقيقة ل72 hpf).
  6. قم بإزالة محلول التبييض بعناية باستخدام ميكروبيبت وشطف الأجنة ثلاث مرات في 1 مل من PBTriton.
    ملاحظة: الأجنة لزجة في هذه الخطوة.
  7. انتقل إلى الوثائق أو المزيد من خطوات المعالجة أدناه.

6. تشريح الجنين وإزالة الصفار

  1. لإزالة صفار، نقل كمية صغيرة (~ 200 ميكرولتر أو ما يكفي لتغطية الجنين تماما ولكن تقييدية بما يكفي للحد من حيث يمكن أن تطفو) من 1x PBS إلى شريحة الاكتئاب أو شريحة الزجاج العادي.
  2. استخدام أنبوب نقل البلاستيك لنقل 1 أو أكثر من الأجنة إلى قطرات PBS.
  3. استخدام ملقط فائقة الدقة و00 دبابيس الحشرات لكسر صفار وبلطف جدا كشط حبيبات صفار من السطح البطني للجنين (انظر أيضا تشنغ وآخرون، 2014)18.
  4. إزالة حبيبات صفار وتجديد برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.
  5. كرر حتى الجنين خالية بما فيه الكفاية من صفار.

7. تركيب شقة على الشرائح

  1. نقل الأجنة المنقطع عنها إلى شريحة زجاجية مشحونة مع ماصة بلاستيكية أو ميكروبيبات 1 مل مع طرف مشذب (للحد من إجهاد القص). الشرق على النحو المطلوب مع 200 ميكروبيبات تلميح ميكروبيبأو دبوس الحشرات.
  2. الفتيل بعيدا برنامج تلفزيوني الزائدة مع مسح كيم أو منشفة ورقية.
  3. أضف 2-3 قطرات من الوسائط المتصاعدة إلى الشريحة وقسيمة الغطاء.
  4. الهواء الجاف لمدة 5 إلى 10 دقيقة تقريبا.
  5. ختم الزجاج غطاء على الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة.
    ملاحظة: يجب تغطية حواف زجاج الغلاف بالكامل بطبقة رقيقة ومستمرة من طلاء الأظافر.
  6. السماح لتجف ما يقرب من 10 دقيقة قبل التصوير.

8. تصاعد في أغاروز

  1. إعداد 1٪ أغاروز في وسط الجنين عن طريق إضافة 0.5 غرام من أغاروز إلى 50 مل من وسط الجنين في قارورة آمنة من الميكروويف أو كوب من حجم 3x على الأقل أكبر من المطلوب.
  2. الحرارة في الميكروويف، يحوم كل 30 s، حتى يذوب أغاروز تماما.
  3. جعل 1 مل aliquots في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. تخزين aliquots في درجة حرارة الغرفة.
  4. تغطية قبعات أنبوب مع أقفال غطاء قبل التدفئة.
  5. ضع أنابيب أغاروز في حامل أنبوب عائم في كوب نصف مملوء بالماء.
  6. الميكروويف الكأس مع أنابيب عائمة لمدة 2-3 دقيقة، أو حتى يذوب أغاروز تماما.
  7. نقل جنين إلى الشريحة المجسرة باماصة بلاستيكية أو ميكروبيبة 200 ميكروبيت مع طرف مشذب (للحد من إجهاد القص).
  8. ضع الجنين على غطاء مستطيل باستخدام دبابيس الحشرات وأضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من الأغروس اصهر مباشرة إلى الجنين.
  9. توجيه بسرعة المنطقة ذات الاهتمام الأقرب إلى قسيمة الغلاف باستخدام 00 دبابيس الحشرات.
    ملاحظة: هذا هو جبل رأسا على عقب.
  10. إعادة أنبوب agarose إلى أنبوب الماء الساخن تطفو بين كل استخدام والميكروويف حسب الحاجة.
  11. الصورة باستخدام المجهر عندما يتصلب الأغروس. حافظ على الجنين المركب رأسًا على عقب لاستخدامه على المجهر المقلوب. الوجه أكثر من قسيمة الغطاء (حتى agarose تحت غطاء) للاستخدام على المجاهر تستقيم.

9. تصاعد على الشرائح جسر

  1. لجعل الشرائح جسر، الغراء القسائم المربعة إلى الشريحة الزجاجية باستخدام نقطة صغيرة من superglue.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك حوض صغير على الأقل 5 مم واسعة بين القسائم. اثنين #1 coverslips عالية عادة ما تكون مناسبة ل24-48 hPF الأجنة في حين أن ثلاثة coverslips عالية قد تكون ضرورية ل72 hpf.
  2. نقل 1-2 الأجنة deyolked إلى الشريحة جسر مع ماصة بلاستيكية أو ميكروبيب200 ميكروبيب مع طرف قلصت (للحد من الإجهاد القص).
  3. الفتيل بعيدا السوائل الزائدة مع مسح كيم أو منشفة ورقية.
  4. إضافة قطرة من الجلسرين ≥ 80٪ مباشرة إلى الجنين.
  5. تغطية مع الزجاج غطاء مستطيلة. وينبغي أن قطرة من الجلسرين لمس الزجاج الغطاء.
  6. إضافة المزيد من الجلسرين إلى المسافة بين الزجاج الغطاء والشريحة حسب الحاجة لتغطية الجنين تماما مع هامش من الجلسرين على جانبي الجنين.
  7. حرك زجاج الغطاء المستطيل بلطف للفة الجنين في موضعه للتصوير.

10. DAB تلطيخ

ملاحظة: يبدأ هذا القسم بعد الخطوة 4.2 أعلاه ويحل محل بقية الخطوة 4.

  1. احتضان الأجنة في محلول مانع مع جسم مضاد ثانوي مترافق مع البيروكسيديز لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أثناء الهزاز.
  2. يغسل ثلاث مرات في PBTriton لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل الأجنة إلى لوحة الثقافة أو شريحة الاكتئاب مع ماصة نقل.
  4. مزيج 50 ميكرولتر من 1٪ DAB (3,3'-diaminobenzidine) المذابة في ddH2O و 50 μL من بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ وتقديمهم إلى 1 مل مع PBS.
    تنبيه: DAB هو مادة خطرة. ارتداء القفازات والتخلص من السوائل والمواد الصلبة الملوثة DAB في المناطق المحددة.
  5. قم بتغطية الأجنة الملطخة بـ HRP باستخدام محلول DAB المعد أعلاه ومراقبة تطور الألوان (عادة ً 1-5 دقيقة) تحت المجهر.
  6. بعد الوصول إلى المستوى المطلوب من تطور اللون ، شطف الأجنة لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني.
  7. نقل الأجنة مرة أخرى إلى أنبوب 1.5 مل قبل التثبيت.
  8. إعادة إصلاح الأجنة لمدة 15-20 دقيقة في 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة.
  9. غسل الأجنة ثلاث مرات في PBTriton لمدة 5 دقيقة.
  10. انتقل إلى الوثائق.

11. بروتوكول تعديل لتلطيخ الأنسجة المقطعة التي يتم تركيبها على الشرائح

  1. تطويق الأنسجة لتكون ملطخة مع قلم باب.
  2. نقل الشرائح إلى غرفة رطبة.
  3. إضافة 1 مل من PBS مباشرة إلى الشريحة.
  4. احتضان 7 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة تضمين المتوسطة.
  5. صب قبالة برنامج تلفزيوني عن طريق عكس الشريحة.
  6. Rehydrate 1 دقيقة في ما يصل إلى 1 مل من العازلة TNT (100 mM تريس درجة الحموضة 8.0، 150 mM NaCl، 0.1٪ Tween20).
  7. كتلة في ما يصل إلى 1 مل من حل الحجب (التجاري أو 10٪ مصل + 2٪ BSA) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضان بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ مصل أو منع الحل في 4 درجة مئوية.
  9. غسل خمس مرات في ما يصل إلى 1 مل من العازلة TNT في درجة حرارة الغرفة.
  10. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C. تغطية الغرفة مع احباط أو استخدام غطاء داكن.
  11. يغسل خمس مرات في TNT في درجة حرارة الغرفة. صب قبالة غسل الماضي.
  12. جبل مع 2-3 قطرات من المتوسطة المتصاعدة وغطاء. اسمحوا الجلوس 5-10 دقيقة.
  13. ختم الزجاج غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. السماح لتجف تماما قبل التصوير.

12 - الوثائق

  1. تسجيل الإجراء الكامل وأية انحرافات في دفتر ملاحظات المختبر.
  2. تسجيل التركيز والاسم ورقم الكتالوج والشركة المصنعة ورقم اللوط للجسم المضاد الأساسي.
  3. ضع عينة محمولة بشكل مناسب على مسرح المجهر. تحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام.
  4. حدد مثالًا ساطعًا نسبيًا. تعيين التعرض للكاميرا وكسب بحيث إشارة مشرقة بما فيه الكفاية دون تشبع.
  5. قارن شدة تلطيخ نفس المنطقة ذات الاهتمام باستخدام إعدادات التعرض نفسها عند المقارنة بين الأجنة التجريبية المسماة بالأجسام المضادة وخلايا الأجسام المضادة للتحكم (مثل IgG).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كامل جبل المناعةhistochemistry يستخدم الأجسام المضادة للكشف عن النمط المكاني للتعبير البروتين في الحيوان سليمة. سير العمل الأساسي للكيمياء المناعية (الموضحة في الشكل 1)ينطوي على تربية سمك الحمار الوحشي ، ورفع وإعداد الأجنة ، ومنع المستضدات غير محددة ، وذلك باستخدام الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضد ينتقب لاستهداف البروتين من الفائدة ، والكشف عن أن الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى ، وتركيب العينة ، وتوثيق التعبير.

كامل جبل المناعة histochemistry هو أداة قيمة لدراسة التعبير البروتين المكاني والزماني أثناء تطوير حمار وحشي. حمار وحشي يحمل تقلصات عفوية بوساطة تقاطعات الفجوة بدءا من قبل 19 hpf - قبل الاتصال العصبيالحركي19. تقاطع حمار وحشي العصبية والعضلية, مثل الفقاريات الأخرى, ويتوسطها أستيل يتصرف في مستقبلات أستيل النيكوتين. يتم الكشف عن هذه المستقبلات المجمعة لأول مرة في ما يقرب من 16 hpf والتعبير يتوسع وإعادة تشكيل الخلايا العصبية تشكل الاتصالات20. الدراسات في الضفادع21 والفئران22 تشير إلى أن العضلات الهيكلية من الفقاريات يمكن أن تعبر أيضا مستقبلات الغلوتامات ionotropic. كامل جبل immunohistochemistry للوحدة الفرعية GluN1 من مستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA يكشف عن التعبير عن الوحدات الفرعية مستقبلات الغلوتامات في جميع أنحاء تطوير عضلة حمار وحشي في 23 hpf(الشكل 2). هذا يماثل تقريبا مع التوقيت من عصبيّة حركيّة يتضمّن. تمت مقارنة التعبير بأجنة المكافحة الأولية لتحديد الفلورة الخلفية للأسماك والأجسام المضادة الثانوية وإلى فأر 2 ميكروغرام/مل IgG لتحديد المساهمات النسبية لربط المستضد غير المحدد. لم يتم الكشف عن مستقبلات الغلوتامات نوع AMPA في العضلات في هذه المرحلة من التطور. يتم سرد تركيزات الأجسام المضادة في الجدول 1. لتوليد هذه الصور، تمت معالجة هذه الأجنة كما هو موضح في هذا البروتوكول مع أي من الخطوات الاختيارية باستثناء deyolking. كانت الأجنة مسطحة محمولة ومغطاة(الشكل 3B).

تعبر الخلايا المقسمة عن تعديلات مختلفة من الخلايا الهادئة التي يمكن اكتشافها بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة التي تتعرف على تعديلات محددة، مثل الفوسفور البروتيني. الفوسفور من histone 3 في سيرين 10 يرتبط انقسام الخلية23. تم استخدام التعديلات المقدمة لهذا البروتوكول لتكييف الكيمياء المناعية للأنسجة المقطعة التي يتم تركيبها على الشرائح للكشف عن الخلايا المنتشرة في دماغ حمار وحشي اليرقات. تم تركيب أجزاء مجمدة من 72 أجنة hPF على الشرائح والمناعة الملطخة لP-H3(الشكل 4). العديد من الخلايا التعبير عن ف H3، والتعبير هو أبرز في المناطق البطينية. تمت مقارنة التعبير بأجنة المكافحة الأولية وبفأر ة 2 ميكروغرام/مل من الـ IgG لتحديد المساهمات النسبية لملزم المستضد غير المحدد.

جسم الهدف تركيز
الماوس IgG Isotype التحكم مستضدات غير محددة 2 ميكروغرام/مل
الماوس المضادة NMDAR1 الوحدة الفرعية GluN1 1:1,000
الماعز المضادة للفأرة Alexa488 الماوس IgG 1:500
الماوس مكافحة الفوسفو-H3 الفوسفور هيستون H3 1:500
الفأر المضادة لعموم أمبير مستقبلات غلور1-4 1:500

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة والتركيزات المستخدمة.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي لإجراء كيمياء الهيستوكيمياء الهيستوكيميائية كامل جبل. ويتمثل سير العمل الأساسي للإجراء في تربية الأسماك؛ جمع وإعداد الأجنة؛ حظر مستضدات غير محددة؛ احتضان في الأجسام المضادة الأولية والثانوية في سلسلة; جبل الأنسجة؛ والوثيقة. تتم الإشارة إلى الخطوات الاختيارية بأسهم صغيرة عند النقطة المناسبة في سير العمل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: اليرقات التخطيطية ومستقبلات NMDA النتائج التمثيلية للسنة الدولية للخدمات الإنسانية. استخدام كامل جبل المناعةhistochemistry اختبار التعبير مستقبلات الغلوتامات في تطوير العضلات. ويشار إلى التوجه والمنطقة التي تهم 23 hpf. لم يكن من المنتَقِر أي إشارة عندما لم يتم تضمين الأجسام المضادة الأولية. الماوس IgG التحكم الأجسام المضادة يظهر مستوى منخفض من التعبير غير محددة. يتم التعبير عن GluN1 الوحدة الفرعية لمستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA (NMDAR) عبر العضلات النامية ، مع تركيزات أعلى عند حدود السوميت (رؤوس الأسهم). لا يتم التعبير عن مستقبلات الغلوتامات من نوع AMPA (AMPAR) في هذه المرحلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تخطيطمخططات التركيب. (أ)يمكن إعادة وضع الجنين الغارق في 50٪ من الجلسرين بسهولة. (ب)يمكن الحفاظ على جنين مسطح على شريحة في وسط متصاعد وصورته في وقت لاحق. (ج)يمكن تثبيت جنين محمول في قطرة من 1٪ أغاروز في وضع يسمح له برؤية منطقة صعبة. (د)يمكن لف جنين محمول في الجلسرين على شريحة جسرية وإعادة وضعه. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية في الأنسجة المقطعة. باستخدام تعديلات البروتوكول في الخطوات الاختيارية ، تم اختبار الكيمياء المناعية للخلايا المنتشرة في دماغ اليرقات في الحمار الوحشي عند 72 hpf. الماوس IgG السيطرة على الأجسام المضادة واستبعاد الأجسام المضادة الأولية تكشف عن مستوى منخفض من التعبير غير محددة. كعلامة على تكاثر الخلايا، يتم التعبير عن P-H3 في مواقع منفصلة، بما في ذلك المناطق البطينية (رأس السهم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المناعة هي أداة متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها لتوصيف التعبير المكاني والزماني من أي بروتين تقريبا من الفائدة في كائن حي. يستخدم الكيمياء المناعية على مجموعة واسعة من الأنسجة والكائنات الحية النموذجية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام في حمار وحشي. قد تتطلب الكيمياء المناعية في الأنواع المختلفة تقنيات مختلفة للتثبيت والمناولة ، وحجب الحلول اعتمادًا على الأنواع ووجود البيروكسيديز الذاتية ، وأوقات الحضانة بسبب سمك الأنسجة وتكوينها. وقد تم الدولي للخدمات الإنسانية في حمار وحشي لا يتجزأ في تعزيز فهمنا للسرطان24، مرض التمثيل الغذائي25، الاضطرابات العصبية26، والعديد من المجالات الأخرى ذات الصلة الكبيرة لصحة الإنسان. ميزة رئيسية واحدة للسنة الدولية للخدمات الإنسانية هو أن الإجراء قصير نسبيا بالمقارنة مع تقنيات أخرى مثل ISH وليس صعبا من الناحية الفنية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات التي تتطلب التحسين على أساس عمر العينات ، والمستضد المستهدف ، والأجسام المضادة المستخدمة.

مدة عدة خطوات في هذا البروتوكول مرنة. وتمثل المدد المعطاة للخطوات المرنة على النحو المشار إليه الحد الأدنى من الأوقات المطلوبة عموما. بشكل عام، كلما تم غسل الأجنة ثلاث مرات أو أكثر في PBTriton، يمكن الاحتفاظ بها بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية في الغسيل الأخير إذا لزم الأمر. تكون أوقات الضبط والتثبيت أقل مرونة ويجب تعديلها فقط بنية متعمدة كجزء من استراتيجية استكشاف الأخطاء وإصلاحها. لاحظنا عدة نقاط في البروتوكول اختيارية لإظهار كيفية دمج هذه الخطوات في سير العمل كما هو ذي صلة تجريبية. على سبيل المثال، إذا كان التصبغ يتداخل مع الكشف عن الإشارة، ومنع الميلانوجينعن طريق العلاج PTU أو تبييض الأجنة الثابتة. يمكن أن يؤدي التبييض إلى تلف الأنسجة ، لذلك يجب توخي الحذر لتقليل الوقت الذي تقضيه الأجنة في التبييض. ومع ذلك ، قد يكون التبييض أفضل من علاج PTU ، والذي يمكن أن يؤثر على جوانب معينة من التنمية27،28،29،30. كما نقدم خيارات للكشف عن الفلورسنت والكروموجيني. إذا لم يكن الفلورس غير مرغوب فيه أو إذا كان المستضد ينتج إشارة ضعيفة للغاية بحيث لا يمكن اكتشافها بشكل كاف ٍ عن طريق المجهر الفلوري ، فيمكن تحقيق الكشف عن الكروموجين باستخدام البيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد المترافق وDAB.

التحدي الأكبر للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية في سمك الحمار الوحشي هو العثور على أجسام مضادة مناسبة. في الواقع ، غالباً ما يستخدم ISH كوكيل للتعبير عن البروتين عندما لا تتوفر الأجسام المضادة التجارية للبروتين المطلوب من الفائدة. تم تصميم العديد من الأجسام المضادة التجارية لاستهداف أهداف الثدييات ولا يتم الحفاظ على القمم دائمًا في سمك الحمار الوحشي. عند توفرها، حدد الأجسام المضادة المتاحة تجاريًا التي تم اختبارها في سمك الحمار الوحشي. لقد وجدنا أن الأجسام المضادة التي تعترف المستضدات التي يتم الحفاظ عليها بين سمك الحمار الوحشي والأنواع المستهدفة تعمل بشكل عام في سمك الحمار الوحشي. لقد وجدنا أيضا أن الأجسام المضادة التي ثبت للعمل في الطيور و / أو البرمائيات بالإضافة إلى الثدييات عموما تعمل أيضا أيضا في حمار وحشي، حتى عندما لم يتم اختبار فعالية في حمار وحشي. عادة، الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تم تطويرها ضد مستضد الثدييات هي أكثر عرضة للكشف عن الحمض المتماثل للسمك الوحشي من الأجسام المضادة أحادية النسيلة بسبب انخفاض خصوصيتها. كلما اختبار جسم مضاد جديد، فمن المفيد لتشغيل تجربة التحكم إيجابية باستخدام الببتيد الهدف عبر مرتبطة، أنسجة الثدييات أو الخلايا التي هي معروفة للتعبير عن البروتين، أو الخلايا التي تعبر عن بناء مراسل. كما يمكن اختبار الأجسام المضادة بواسطة اللطخة الغربية للتحقق من حجم المستضد المستهدف.

في حين أن معظم الأجسام المضادة التجارية توفر نطاق تخفيف مقترح للسنة الدولية للخدمات الإنسانية ، فمن المهم تحديد تجريبيا التخفيف الذي يعمل بشكل أفضل. تركيزات الأجسام المضادة التي هي عالية جدا غالبا ما تؤدي إلى تلطيخ غير محددة وزيادة الخلفية، في حين أن القليل جدا من الأجسام المضادة فشل في توفير إشارة ملحوظة. اعتمادا على الأجسام المضادة والمستضد، قد يكون من المفيد أولا permeabilize الأجنة على النحو المبين في الخطوة 3.2 أعلاه، ومع ذلك، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية وفي بعض الحالات يمكن أن يؤدي إلى انخفاض إشارة. يستخدم هذا البروتوكول تريتون-X-100 كمنظف يُظهر الخلايا، والتي قد تكون كافية للأنسجة الرقيقة أو التعبير السطحي. قد تتطلب الأنسجة العميقة أو السميكة، مثل مناطق الدماغ العميقة أو اليرقات القديمة، نفاذ البروتينات. وعلى العكس من ذلك، ينبغي استبعاد تريتون-X-100 من جميع الخطوات عندما يكون من شوطن المناعة فقط البروتينات على سطح الخلية هو المطلوب على وضع العلامات البروتينات داخل الخلايا. يمكن أيضًا تعديل مدة خطوة الحجب بالإضافة إلى اختيار محلول حظر تجاري مقابل استخدام المصل وBSA لتصحيح حساسية الأجسام المضادة وتلطيخ الخلفية. تركيزات عالية من المصل المستخدمة في حجب (10٪ في هذا البروتوكول) يمكن أن تقلل من تلطيخ الخلفية، على الرغم من أنه ينبغي تخفيفها عندما يكون الجسم المضاد موجودًا لتقليل إخفاء مواقع ربط الأجسام المضادة. قد تكون حلول الحجب النباتية مفيدة إذا كانت إشارة الخلفية عالية باستمرار، حتى في تخفيف الأجسام المضادة المنخفضة (<1:1,000). وأخيرا، يمكن ضبط حساسية من قبل صرامة من السهو. قد يكون من الضروري زيادة أو تقليل مدة خطوات غسل الأجسام المضادة بعد وكذلك ضبط كمية تريتون-X-100 في PBTriton. نطاقات العمل النموذجية من PBTriton تمتد 0.2٪ إلى 1.0٪ تريتون-X-100. ومن الممارسات الجيدة عند استخدام جسم مضاد جديد لبقعة الأجنة السلبية السيطرة مع IgG الأولية والأجسام المضادة الثانوية المسمى لتحديد خصوصية الأجسام المضادة وتحديد الإشارات الإيجابية الكاذبة المحتملة.

إذا فشل تحسين الأجسام المضادة في إنتاج إشارة إيجابية ، فقد يكون ذلك بسبب إخفاء المثبت للمستضد. عموما، التثبيت في 4٪ PFA لا يخفي مواقع مستضد لمنع ربط الأجسام المضادة، على الرغم من أن إخفاء المستضد لا يحدث في بعض الأحيان مع بعض الأجسام المضادة. يمكن أن يؤدي استرجاع المستضد في تلف الجنين ولكن تم وصف بروتوكول العمل من قبل إينو وويتبرود31. بدلا من ذلك، إذا كان الجسم المضاد المحدد غير متوافق مع 4٪ PFA أو إذا كان ينتج PFA في التغيرات المورفولوجيا الخلوية، يمكن استخدام الميثانول، 2٪ حمض ثلاثي الكلور، أو الغليواكسال لإصلاح العينات27. يجب تحديد توافق الجسم المضاد مع تثبيت الفورمالديهايد تجريبيا. إذا تعذر الحصول على إشارة تحكم إيجابية بعد تثبيت PFA ، فقد يكون من المفيد تجربة مثبت بديل مثل الميثانول. وقد تكون بروتوكولات التثبيت البديلة ضرورية أيضاً للأجسام المضادة الأولية التي أثيرت ضد المستضدات المترافقة (مثل GABA-BSA).

هناك العديد من الخيارات الفعالة لتركيب أجنة حمار وحشي الملطخة بالمناعة للتصوير. يمكن نقل الأجنة إلى طبق بيتري من الجلسرين ، ووضعها مع دبابيس أو ملقط ، وتصويرها إما مع عرض واسع من فوق أو من أسفل التصوير من خلال الطبق مع المجهر المقلوب(الشكل 3A). هذه الطريقة بسيطة وسريعة ومؤقتة. وتشمل العيوب ميل الأجنة لطرح من التركيز في الجلسرين السائل، والانعكاسات المحتملة قبالة سطح الجلسرين في الطبق، وصعوبة التصوير من خلال طبق سميك. يمكن تركيب الأجنة مسطحة على الجانبين الزجاج(الشكل 3B)مع تصاعد المتوسطة، coverslips، وطلاء الأظافر. ويمكن النظر إلى هذه يتصاعد على المجهر تستقيم أو مقلوب. يمكن إعداد الأجنة المعدة بهذه الطريقة في وقت قريب ويتم تخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى التصوير أو يمكن تخزينها وإعادة تصويرها لاحقًا. يمكن أن يكون هذا مفيدًا بشكل خاص عندما يكون وقت التصوير محدودًا. مساوئ هذا الجبل تشمل الخيارات المحدودة لوضع الجنين وسمك الأنسجة، وعدم القدرة على إعادة وضع أو استعادة الأجنة. الأجنة التي شنت بهذه الطريقة غالبا ما تحتاج deyolking، كما حبيبات صفار هي autofluorescent في القنوات الفلورية الأكثر شيوعا ولا يمكن نقلها أو إزالتها بعد تصاعد. عندما تتطلب المنطقة ذات الاهتمام تحديد موضع صعب للجنين ، يمكن أن يكون من المفيد للغاية تركيب الأجنة في 1٪ أغاروز على كوب غطاء(الشكل 3C). يمكن أن يعقد الجنين في وضع مع دبابيس الحشرات مع المنطقة الأكثر أهمية الأقرب إلى زجاج الغطاء حتى يبرد الأغروس. وآغروس عقد الجنين في موقف دون الجنين المتداول لعدة دقائق على الأقل. أغروس تصاعد هو أفضل للمجاهر مقلوب، على الرغم من أن الزجاج الغطاء يمكن أن تكون مقلوبة بعناية للاستخدام على المجهر تستقيم. يمكن أن يستغرق هذا الجبل وقتًا طويلاً ولا يمكن عادةً إعادة وضع الأجنة أو استردادها. تصاعد الأجنة على الشرائح جسر(الشكل 3D)يقدم إلى حد ما من حل وسط بين هذه الأساليب. جبل جسر سريع، ويمكن إعادة وضع الأجنة واستردادها. يمكن أن يسمح ارتفاع الجسر بمرونة أكبر في سماكة الأنسجة ووضع الجنين من اليتصاعد المسطح ، مع الحفاظ على القدرة على الصورة من أعلى أو أسفل. يتطلب هذا الأسلوب إعداد الشرائح جسر في وقت مسبق. سمك الأنسجة التي سيتم تركيبها يملي كم coverslips عالية الجسر يجب أن يكون. يمكن إعادة استخدام الشرائح الجسرعدة مرات ليوم واحد ولكن ينبغي التخلص منها بعد جلسة التصوير لأن الجلسرين من الصعب تنظيف الشرائح وسوف يطرد الغراء ببطء عقد الجسر.

تعتبر الهيئة العالمية للخدمات الإنسانية طريقة فعالة لتحديد توقيت ونمط التعبير البروتيني في الكائن الحي أو النسيج. تتمتع المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بالعديد من المزايا على ISH في هذه التكلفة المنخفضة نسبيًا ويمكن إكمالها في جزء صغير من الوقت الضروري عادةً لـ ISH (2-3 أيام مقابل 5-8 أيام). بالإضافة إلى ذلك ، فإن IHC هو مؤشر أفضل للتعبير عن المنتج الجيني حيث لا يتنبأ الكشف عن مستويات مرنا العمليات المابعد ية وما بعد الترجمة التي يمكن أن تؤثر على التعبير البروتيني. كما أن ّ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية قادرة على توفير بيانات تعريب دون خلوي (على الرغم من أن هذا غير صحيح عند استخدام تلطيخ DAB)، وهو ما لا يوفره إي إتش. فمن الممكن لأداء ISH المزدوج / IHC في حمار وحشي.

كما أن للخدمات العالمية للخدمات الإنسانية بعض العيوب، وفي مقدمتها توافر الأجسام المضادة. في حين أن هناك العديد من الأجسام المضادة المتاحة التي هي ذات جودة مناسبة للمدينة الدولية للخدمات الإنسانية ، وإيجاد الأجسام المضادة التي تعمل على وجه التحديد في حمار وحشي هو أكثر تحديا وغالبا ما يتطلب اختبار واستكشاف الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها ضد المستضدات الثدييات. ومع ذلك ، هناك أعداد متزايدة من الأجسام المضادة المثبتة على حمار وحشي في السوق وظهور تكنولوجيا CRISPR /Cas9 جعل من الممكن أن تبالى العلامة البروتينات الذاتية من خلال هندسة الجينوم. هذه العمليات تستغرق وقتا طويلا وصعبة، ومع ذلك، وتتطلب التحقق من صحة وظيفة البروتين.

يمكن استخدام البروتوكول الوارد وصفه في هذا التقرير على نطاق واسع على أجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي في أي مرحلة ويمكن تطبيقه على الأنسجة من الحيوانات البالغة أيضًا. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول أيضا لتلطيخ العينات المجمدة أو البارافين مقطعة مع تعديل قليلا. تم استخدام كامل جبل المناعةhistochemistry لفحص مجموعات مستقبلات الناقل العصبي في العضلات, الكشف عن التعبير عن مستقبلات الغلوتامات NMDA ionotropic الوحدة الفرعية الإلزامية 1 في تطوير العضلات حمار وحشي. هذا تلطيخ على نطاق واسع ومنتشر إلى حد ما عبر العضلات النامية يتسق مع التعبير التنموي لنفس الوحدة الفرعية للمستقبلات في تطوير يرقات Xenopus21. وهذا يشير إلى أن التعبير عن مستقبلات الغلوتامات في تطوير العضلات يتم الحفاظ عليها تطوريا. وإجمالاً، فإن هذا البروتوكول ذو قيمة للحصول على فهم أفضل للتعبير الجيني من خلال استخدام المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ويوفر أداة قوية لتحديد التوزيع المكاني والزمني للتعبير عن البروتين في سمك الحمار الوحشي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي معلومات للكشف عنها.

Acknowledgments

التمويل من المعاهد القومية للصحة منحة 8P20GM103436 14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mm Corning 284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mm Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26, (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31, (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141, (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44, (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133, (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47, (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4, (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26, (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9, (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13, (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6, (4), e982376 (2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29, (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147, (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118, (22), 5181 (2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12, (5), 1859 (1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20, (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6, (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37, (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212, (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68, (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6, (8), e22991 (2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6, (5), e19713 (2011).
كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).More

Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter