Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo’s en larven.
Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om eiwitexpressie en lokalisatie te verkennen tijdens zowel normale ontwikkelings- als ziektetoestanden. Hoewel veel immunohistochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor weefsel- en weefselsecties van zoogdieren, vereisen deze protocollen vaak modificatie en optimalisatie voor niet-zoogdiermodelorganismen. Zebravissen worden steeds vaker gebruikt als een modelsysteem in fundamenteel, biomedisch en translationeel onderzoek om de moleculaire, genetische en celbiologische mechanismen van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Zebravissen bieden veel voordelen als modelsysteem, maar vereisen ook aangepaste technieken voor optimale eiwitdetectie. Hier bieden we ons protocol voor de gehele mount fluorescentie immunohistochemie in zebravissen embryo’s en larven. Dit protocol beschrijft bovendien verschillende montagestrategieën die kunnen worden gebruikt en een overzicht van de voor- en nadelen die elke strategie biedt. We beschrijven ook wijzigingen in dit protocol om detectie van chromogene substraten in hele mountweefsel en fluorescentiedetectie in gesectioneerd larveweefsel mogelijk te maken. Dit protocol is in grote lijnen van toepassing op de studie van vele ontwikkelingsstadia en embryonale structuren.
De zebravis (Danio rerio) is ontstaan als een krachtig model voor de studie van biologische processen om verschillende redenen, waaronder korte generatie tijd, snelle ontwikkeling, en beaambaarheid aan genetische technieken. Als gevolg hiervan worden zebravissen vaak gebruikt in hoge doorvoer kleine molecuul schermen voor toxicologisch onderzoek en drugs ontdekking. Zebravissen zijn ook een aantrekkelijk model voor de studie van ontwikkelingsprocessen, aangezien één vrouwtje routinematig 50-300 eieren tegelijk kan produceren en de optisch heldere embryo’s zich extern ontwikkelen, waardoor ontwikkelingsprocessen efficiënt kunnen worden gevisualerd. Echter, vroeg onderzoek baseerde zich meestal op voorwaartse genetische schermen met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of andere mutageens als gevolg van uitdagingen bij het vaststellen van omgekeerde genetische technieken. Ongeveer twee decennia geleden werden morpholinos voor het eerst gebruikt bij zebravissen om gerichte genen neer te halen1. Morpholinos zijn kleine antisense oligonucleotiden die de vertaling van doelmRNA remmen na micro-injectie in een embryo in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een grote zwakte van morpholinos is dat ze worden verdund als de cellen te verdelen en over het algemeen verliezen effectiviteit door 72 uur na de bevruchting (hpf). Terwijl morpholinos een krachtig instrument blijven voor verstoring van het zebravisgen, worden transcriptionor-achtige effector nucleases (TALENs), zink-vinger nucleases (ZFNs), en geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPRs) meer recent gebruikt om direct gericht op de zebravis genoom2,3. Deze omgekeerde genetische strategieën, in combinatie met voorwaartse genetica en hoge doorvoerschermen, hebben de zebravissen vastgesteld als een krachtig model om genexpressie en functie te bestuderen.
De capaciteit om genfunctie te bestuderen vereist over het algemeen een evaluatie van de spatio-tijdelijke distributie van gen of genproductuitdrukking. De twee meest gebruikte technieken om dergelijke expressiepatronen te visualiseren tijdens de vroege ontwikkeling zijn in situ hybridisatie (ISH) en hele mount immunohistochemie (IHC). In situ hybridisatie werd voor het eerst ontwikkeld in 1969 en is gebaseerd op het gebruik van gelabelde antisense RNA sondes om mRNA expressie in een organisme te detecteren4. In tegenstelling, gelabelde antilichamen worden gebruikt in immunohistochemie om eiwitexpressie te visualiseren. Het idee van het etiketteren van eiwitten voor detectie dateert uit de jaren 19305 en de eerste IHC experiment werd gepubliceerd in 1941 toen FITC-gelabelde antilichamen werden gebruikt om pathogene bacteriën in geïnfecteerde weefsels op te sporen6. ISH en IHC zijn in de daaropvolgende decennia sterk geëvolueerd en verbeterd en worden nu zowel routinematig gebruikt in het moleculaire en diagnostische onderzoekslaboratorium7,8,9,10,11. Hoewel beide technieken voor- en nadelen hebben, biedt IHC verschillende voordelen ten opzichte van ISH. Praktisch, IHC is veel minder tijdrovend dan ISH en is over het algemeen minder duur, afhankelijk van de kosten van de primaire antilichaam. Bovendien, mRNA expressie is niet altijd een betrouwbare metrische van eiwitexpressie als het is aangetoond bij muizen en mensen dat slechts ongeveer een derde van de eiwit overvloed variatie kan worden verklaard door mRNA overvloed12. Om deze reden is IHC een belangrijk supplement om ISH-gegevens te bevestigen, indien mogelijk. Ten slotte kan IHC subcellulaire en co-lokalisatiegegevens verstrekken die niet kunnen worden bepaald door ISH13,14,15. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode om eiwitten betrouwbaar te detecteren door immunohistochemie in hele mount zebravisembryo’s en larven. Het doel van deze techniek is het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie van een eiwit van belang in het hele embryo. Deze technologie maakt gebruik van antigeenspecifieke primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Het protocol is gemakkelijk aan te passen aan gebruik op dia-gemonteerde weefselsecties en voor gebruik met chromogene substraten in plaats van fluorescentie. Met behulp van dit protocol, we aantonen dat de ontwikkeling van zebravissen skeletspier drukt ionotropische glutamaat receptoren, in aanvulling op acetylcholine receptoren. NMDA-type glutamaat receptor subunits zijn detecteerbaar op de longitudinale spier op 23 pkf.
Immunohistochemie is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de spatio-temporele expressie van vrijwel elk eiwit van belang in een organisme te karakteriseren. Immunohistochemie wordt gebruikt op een breed scala aan weefsels en modelorganismen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik bij zebravissen. Immunohistochemie bij verschillende soorten kan verschillende fixatie- en behandelingstechnieken vereisen, waardoor oplossingen worden geblokkeerd, afhankelijk van soorten en de aanwezigheid van endogene pe…
The authors have nothing to disclose.
Financiering van NIH subsidie 8P20GM103436 14.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
Microwave oven | Toastmaster | ||
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superglue gel | 3M Scotch | ||
TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |