Здесь мы представляем протокол для флуоресцентного антитела-опосредованного обнаружения белков в целых препаратах эмбрионов зебры и личинок.
Иммуногистохимия является широко используемым методом для изучения экспрессии белка и локализации в нормальных состояниях развития и болезни. Хотя многие протоколы иммуногистохимии были оптимизированы для тканей и тканей млекопитающих, эти протоколы часто требуют модификации и оптимизации для немлекопитающих модельных организмов. Зебрафиш все чаще используется в качестве модели системы в основных, биомедицинских и трансляционных исследованиях для исследования молекулярных, генетических и клеточных биологических механизмов процессов развития. Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели системы, но и требуют модифицированных методов для оптимального обнаружения белка. Здесь мы предоставляем наш протокол для всемонтированной флуоресценции иммуногистохимии в эмбрионах зебры и личинок. Этот протокол дополнительно описывает несколько различных стратегий монтажа, которые могут быть использованы и обзор преимуществ и недостатков каждой стратегии обеспечивает. Мы также описываем изменения в этом протоколе, чтобы позволить обнаружение хромогенных субстратов в целой ткани крепления и обнаружение флуоресценции в секционированных личитульных тканях. Этот протокол в целом применим к изучению многих стадий развития и эмбриональных структур.
Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной моделью для изучения биологических процессов по нескольким причинам, включая короткое время генерации, быстрое развитие и удобство генетических методов. В результате, зебрафиш обычно используются в высокой пропускной связи малых молекул экранов для токсикологических исследований и открытия наркотиков. Зебрафиш также является привлекательной моделью для изучения процессов развития, учитывая, что одна женщина может регулярно производить 50-300 яиц за один раз, а оптически прозрачные эмбрионы развиваются внешне, что позволяет эффективно визуализировать процессы развития. Тем не менее, ранние исследования опирались главным образом на передние генетические экраны с использованием N-этил-N-нитросуреа (ENU) или других мутагенов из-за проблем в создании обратных генетических методов. Примерно два десятилетия назад, морфолинос были впервые использованы в зебрафиш для нокдауна целевых генов1. Morpholinos являются небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые препятствуют переводу целевой мРНК после микроинъекции в эмбрион на ранней стадии развития. Основным недостатком морфинос является то, что они разбавляются по мере деления клеток и, как правило, теряют эффективность на 72 часа после оплодотворения (hpf). В то время как морфолиносы остаются мощным инструментом для нарушения гена зебры, транскрипционный активатор- эффектоподобный эффект (TALENs), нуклизы цинка-пальца (ЗФН) и кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPRs) в последнее время используются для непосредственной цели генома зебры2,3. Эти обратные генетические стратегии, в сочетании с вперед генетики и высокой пропускной технологии экраны, создали зебры в качестве мощной модели для изучения экспрессии генов и функции.
Способность изучать функцию генов обычно требует оценки пространственно-временного распределения экспрессии генов или генных продуктов. Два наиболее часто используемых методов визуализации таких моделей выражения в начале разработки на месте гибридизации (ISH) и целом горе иммуногистохимии (IHC). На месте гибридизация была впервые разработана в 1969 году и опирается на использование помеченных антисмысловых зондов РНК для обнаружения экспрессии мРНК в организме4. В отличие от этого, помеченные антитела используются в иммуногистохимии для визуализации экспрессии белка. Идея маркировки белков для обнаружения восходит к5 1930-х годов и первый эксперимент IHC был опубликован в 1941 году, когда FITC помечены антитела были использованы для обнаружения патогенных бактерий в инфицированных тканях6. ISH и IHC значительно эволюционировали и значительно улучшились в течение последующих десятилетий и в настоящее время оба регулярно используются в молекулярно-диагностической исследовательской лаборатории7,8,9,10,11. Хотя оба метода имеют преимущества и недостатки, IHC предлагает ряд преимуществ по сравнению с ISH. Практически, IHC гораздо меньше времени, чем ISH и, как правило, дешевле в зависимости от стоимости первичного антитела. Кроме того, выражение мРНК не всегда является надежным показателем экспрессии белка, как было продемонстрировано у мышей и людей, что только около трети вариации изобилия белка можно объяснить изобилием мРНК12. По этой причине, IHC является важным дополнением для подтверждения данных ISH, когда это возможно. Наконец, IHC может предоставить данные субклеточной и совместной локализации, которые не могут быть определены ISH13,14,15. Здесь мы описываем пошаговый метод надежного обнаружения белков иммуногистохимией в целых эмбрионах зебры и личинках. Целью данной методики является определение пространственного и временного выражения белка, интересуемого во всем эмбрионе. Эта технология использует антиген-специфические первичные антитела и флуоресцентно помеченные вторичные антитела. Протокол легко адаптируется к использованию на слайд-установленных секциях тканей и для использования с хромогенными субстратами вместо флуоресценции. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что развитие скелетных мышц зебры выражает ионотропные рецепторы глутамата, в дополнение к рецепторам ацетилхолина. NMDA-типа глутаматных рецепторов субъединиц обнаруживаются на продольной мышцы на 23 л.с.
Иммуногистохимия является универсальным инструментом, который может быть использован для характеристики пространственно-временного выражения практически любого белка, интересующегося организмом. Иммуногистохимия используется на самых разнообразных тканях и модельных организмах….
The authors have nothing to disclose.
Финансирование из гранта NIH 8P20GM103436 14.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
Microwave oven | Toastmaster | ||
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superglue gel | 3M Scotch | ||
TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |