Summary

Prosessoptimalisering ved hjelp av høy gjennomstrømning automatiserte mikrobioreaktorer i kinesisk hamster eggstokk celle dyrking

Published: May 18, 2020
doi:

Summary

Her presenterer vi en detaljert prosedyre for å kjøre en Design of Experiment i en automatisert mikrobioreaktor etterfulgt av celleinnhøsting og proteinkvantifisering ved hjelp av en Protein A-kolonne.

Abstract

Optimalisering av bioprosesser for å øke utbyttet av ønskede produkter er av betydning i biofarmasøytisk industri. Dette kan oppnås ved belastningsvalg og ved å utvikle bioprosessparametere. Shake kolber har blitt brukt til dette formålet. De mangler imidlertid evnen til å kontrollere prosessparametrene som pH og oppløst oksygen (DO). Denne begrensningen kan overvinnes ved hjelp av en automatisert mikrobioreaktor. Disse bioreaktorene etterligner dyrking i større skala. En av de viktigste fordelene med dette systemet er integreringen av Design of Experiment (DOE) i programvaren. Denne integreringen gjør det mulig å etablere en design der flere prosessparametere kan varieres samtidig. De kritiske prosessparametrene og optimale bioprosessforholdene kan analyseres i programvaren. Fokuset for arbeidet som presenteres her er å introdusere brukeren til trinnene som er involvert i prosessdesign i programvaren og inkorporeringen av DOE innenfor dyrkingskjøringen.

Introduction

Det globale biofarmasøytiske markedet var verdt mer enn US $ 250 milliarder i 2018 og har kontinuerlig ekspandert1. Farmasøytiske selskaper beveger seg bort fra å produsere små molekylære legemidler til bioteknologisk produserte terapeutiske midler som rekombinant proteiner. Disse alene er ansvarlige for en omsetning på mer enn $ 150 milliarder1. Pattedyrceller er nå mye brukt til produksjon av disse farmasøytiske rekombinantproteiner. I inneværende periode, blant de 68 godkjente produktene produsert av pattedyrceller, produseres 57 av kinesiskhamstereggstokkceller (CHO)2. CHO-celler brukes spesielt til produksjon av rekombinantproteiner som krever post-translasjonelle modifikasjoner. Disse cellene foretrekkes etter hvert som de vokser i en suspensjon og dermed muliggjør reproduserbare resultater i et serumfritt kjemisk definert medium3,,4. Den andre fordelen med å bruke CHO-celler er at glykanstrukturen til produktet ligner på det menneskelige monoklonale antistoffet (mAb) og resulterer i høyere rekombinant proteinutbytte og spesifikk produktivitet på grunn av genforsterkning5.

Utbyttet av rekombinant CHO (rCHO) cellekultur har økt med hundre ganger de siste to tiårene. Denne forbedringen tilskrives optimalisering av prosessparametrene, fôringsstrategi og utvikling av serumfri kjemisk definert medium6. Med økningen i kravene til farmasøytiske produkter øker trykket på kostnader og tidseffektivitet for utviklingen av produksjonsprosessen7. For å redusere trykket samtidig som produktkvaliteten har omdirigert fokuset til den farmasøytiske industrien på Quality by Design (QbD). QbD brukes til å forstå produktproduksjonen samt prosessen. Et viktig verktøy som brukes i ObD er Design of Experiment (DOE). Det bidrar til å øke forståelsen av prosessen ved å avsløre forholdet mellom ulike inndatavariabler og resulterende utdata. Bruk av DOE-tilnærmingen for å optimalisere bioprosessen er gunstig i de tidlige stadiene av prosjektet i assimilering av prosessforholdene og øke titerkvantiteten og kvaliteten. Denne tilnærmingen er gunstig sammenlignet med den gammeldagse strategien: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistiske tilnærmingene til DOE ved hjelp av klassisk, shainin eller Taguchi er langt bedre enn OFAT8.

Prosessen og medieoptimaliseringen kan utføres i shake kolbe. Kolbene er relativt billig. Det er imidlertid ikke mulig å kontrollere parametere som temperatur, pH og oppløst oksygen (DO). For å overvinne disse ulempene, kan multiuse benk-top bioreaktorer som spenner fra arbeidsvolum på 0,5 L til 5 L brukes. Reaktorene gir en omfattende on-line overvåking og prosesskontroll. Bruken av multiuse bioreaktoren er imidlertid tid og arbeidskrevende. For å overvinne disse ulempene, brukes en ny engangsbioreaktor som kombinerer den omfattende prosessen med å overvåke benk-top bioreaktoren og enkel håndtering av ristekolben. Det høye gjennomstrømningsscreeningssystemet og engangsteknologien har bidratt til å forbedre effektiviteten av prosessytelse og utvikling9.

I denne artikkelen er retningslinjene for å laste oppskriften i den automatiserte mikrobioreaktoren (AMBR) programvare oppført. Påvirkningen av ulike rørehastigheter og pH på levedyktig cellekonsentrasjon (VCC) og titer studeres i løpet av dette eksperimentet. Det eksperimentelle resultatet og analysen utføres med design av eksperimentprogramvare MODDE 12. Produktanalysen utføres i et høytrykks flytende kromatografi (HPLC) system med en Protein A-kolonne. Det er basert på prinsippet om at Fc-regionen i mAb binder seg til protein A med høy affinitet10,11. Med denne metoden er det mulig å identifisere og kvantifisere mAb. Kvantifiseringen utføres over de målte områdene på 280 nm.

Protocol

1. Preculture Prosedyre MERK: Rekombinant CHO DG44 celler med en levedyktig cellekonsentrasjon på 1 x 107 celler / ml brukes for denne protokollen. Tin hetteglasset som inneholder 1,2 ml celler til romtemperatur og overfør umiddelbart cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør som inneholder 10 ml kaldt frømedium. Sentrifuge det koniske sentrifugerøret i 5 minutter ved 190 x g og romtemperatur og kast supernatanten. <…

Representative Results

En oversikt over dyrkingen som utføres i denne studien presenteres i figur 2. Figur 2: Skjematisk representasjon av de eksperimentelle forholdene for å teste pH- og rørerhastighetsprofiler i kulturstasjonene. Figuren representerer også riktig layout for å plassere fartøyene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/6057…

Discussion

Optimalisering av prosessen for å øke utbyttet er av avgjørende betydning i biofarmasøytisk industri. Ristflasker kan potensielt brukes til screening av belastningen; Overvåkingen av prosessparametrene som pH og DO er imidlertid utilgjengelig ei kolbene. Mikrobioreaktorene har en fordel da de tillater kontinuerlig overvåking og kontroll av prosessen. Disse kontrollløkkene i mikrobioreaktoren gir også en tilstand som ligner på de i større skala, og dermed gir resultater som kan sammenlignes med de større biorea…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Det føderale utdannings- og forskningsdepartementet, Tyskland og BioProcessing-teamet til Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, for deres støtte.

Materials

1 mL disposable pipette tips, sterilized Sartorius Stedim Biotech GmbH A-0040
200 mM L-glutamine Corning, Merck 25-005-CV
24 Well deep well plates Sartorius Stedim Biotech GmbH A-0038
5 mL disposable pipette tips, sterilized Sartorius Stedim Biotech GmbH A-0039
ambr 15 automated microbioreactor system Sartorius Stedim Biotech GmbH 001-2804
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged Sartorius Stedim Biotech GmbH 001-1B86
Antifoam C Emulsion Sigma-Aldrich, Merck A8011
Bottle Top Sterile filter Corning, Merck CLS431474 0.1 μm pore size
CEDEX Detergent (3% Mucosol) Roche Innovatis AG 05-650-658-001
Cell counter Roche Innovatis AG 05-650-216-001 CEDEX HiRes
CHO DG44 cell line Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA) Sigma-Aldrich, Merck CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB) Sigma-Aldrich, Merck CR80026
CHOKO Production Medium Sigma-Aldrich, Merck CR80027
CHOKO Stock Culture Meium Sigma-Aldrich, Merck CR80028
Chromaster high pressure liquid chromatography system VWR International
Conical Centrifuge tube Corning, Merck SIAL0790
Ethanol Merck 1070179026
Glycine Carl Roth 56-40-6
HPLC Vials VWR International SUPLSU860181
PBS Sigma-Aldrich,Merck P4417
Protein A Column Thermo Fisher Scientific 1502226 POROS™ A 1.7 mL
Sodium chloride Sigma-Aldrich,Merck 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich,Merck 7558-79-4
Trypan Blue VWR International VWRVK940
YSI YSI Inc 2900D YSI 2900 Select

References

  1. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
  2. Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
  3. Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
  4. Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
  5. Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells – where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
  6. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
  7. Ao, S., Gelman, L. . Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).
  8. Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
  9. Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
  10. Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
  11. Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
  12. Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
  13. Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
  14. Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).

Play Video

Cite This Article
Nagraik, T., Gonzalez Salcedo, A., Solle, D., Scheper, T. Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation. J. Vis. Exp. (159), e60577, doi:10.3791/60577 (2020).

View Video