Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.
Abstract
Die Optimierung von Bioprozessen zur Ertragssteigerung der gewünschten Produkte ist in der biopharmazeutischen Industrie von Bedeutung. Dies kann durch die Dehnungsauswahl und durch die Entwicklung von Bioprozessparametern erreicht werden. Zu diesem Zweck wurden Schüttelkolben verwendet. Sie sind jedoch nicht in der Lage, die Prozessparameter wie pH und gelösten Sauerstoff (DO) zu steuern. Diese Einschränkung kann mit Hilfe eines automatisierten Mikrobioreaktors überwunden werden. Diese Bioreaktoren imitieren den Anbau in größerem Maßstab. Einer der Hauptvorteile dieses Systems ist die Integration des Design of Experiment (DOE) in die Software. Diese Integration ermöglicht die Erstellung eines Entwurfs, bei dem mehrere Prozessparameter gleichzeitig variiert werden können. Die kritischen Prozessparameter und optimalen Bioprozessbedingungen können innerhalb der Software analysiert werden. Im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit steht die Einführung der Schritte der Prozessgestaltung in der Software und der Einbindung des DOE in den Kultivierungslauf.
Introduction
Der globale biopharmazeutische Markt war 2018 mehr als 250 Milliarden US-Dollar wert und hat sich kontinuierlich erweitert1. Pharmaunternehmen bewegen sich von der Herstellung kleiner molekularer Medikamente hin zu biotechnologisch hergestellten Therapeutika wie rekombinanten Proteinen. Diese allein sind für einen Umsatz von mehr als 150MilliardenUS-Dollar verantwortlich. Säugetierzellen werden heute ausgiebig für die Herstellung dieser pharmazeutischen rekombinanten Proteine verwendet. In der aktuellen Periode werden 57 der 68 von Säugetierzellen hergestellten Produkte von chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO)2produziert. CHO-Zellen werden speziell für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet, die posttranslationale Modifikationen erfordern. Diese Zellen werden bevorzugt, da sie in einer Suspension wachsen und ermöglichen dadurch reproduzierbare Ergebnisse in einem serumfreien chemisch definierten Medium3,4. Der andere Vorteil der Verwendung von CHO-Zellen ist, dass die Glyschstruktur des Produkts der des menschlichen monoklonalen Antikörpers (mAb) ähnelt und zu einer höheren rekombinanten Proteinausbeute und spezifischen Produktivität aufgrund der Genverstärkungführt 5.
Die Ausbeute der rekombinanten CHO(rCHO) Zellkultur hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten um das Hundertfache erhöht. Diese Verbesserung ist auf die Optimierung der Prozessparameter, die Fütterungsstrategie und die Entwicklung des serumfreien chemisch definierten Mediums6zurückzuführen. Mit dem steigenden Bedarf an pharmazeutischen Produkten erhöht sich der Druck auf Kosten und Zeiteffizienz bei der Entwicklung des Produktionsprozesses7. Um den Druck zu reduzieren und gleichzeitig die Produktqualität zu sichern, wurde der Fokus der pharmazeutischen Industrie auf Quality by Design (QbD) umgelenkt. QbD wird verwendet, um die Produktproduktion sowie den Prozess zu verstehen. Ein wichtiges Werkzeug, das im ObD verwendet wird, ist das Design of Experiment (DOE). Es trägt dazu bei, das Verständnis des Prozesses zu erhöhen, indem die Beziehung zwischen verschiedenen Eingabevariablen und resultierenden Ausgabedaten aufgedeckt wird. Die Anwendung des DOE-Ansatzes zur Optimierung des Bioprozesses ist in den frühen Phasen des Projekts von Vorteil, um die Prozessbedingungen zu assimilieren und die Titermenge und -qualität zu erhöhen. Dieser Ansatz ist vorteilhaft im Vergleich zur altmodischen Strategie: One-Factor-at-a-time (OFAT). Die statistischen Ansätze für DOE mit Klassik, Shainin oder Taguchi sind dem OFAT8weit überlegen.
Die Prozess- und Medienoptimierung kann in Schüttelkolben durchgeführt werden. Die Kolben sind relativ preiswert. Es ist jedoch nicht möglich, Parameter wie Temperatur, pH-Wert und gelösten Sauerstoff (DO) zu steuern. Um diese Nachteile zu überwinden, können Multiuse-Bench-Top-Bioreaktoren von einem Arbeitsvolumen von 0,5 l bis 5 L verwendet werden. Die Reaktoren bieten eine umfassende Online-Überwachung und Prozesskontrolle. Der Einsatz des Mehrzweck-Bioreaktors ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Um diese Nachteile zu überwinden, wird ein neuartiger Einweg-Bioreaktor eingesetzt, der den umfassenden Prozess der Überwachung des Tischbioreaktors und die einfache Handhabung des Schüttelkolbens kombiniert. Das Hochdurchsatz-Screening-System und die Einwegtechnologie haben dazu beigetragen, die Effizienz der Prozessleistung und -entwicklung zu steigern9.
In diesem Artikel sind die Richtlinien zum Laden des Rezepts in die automatisierte Mikrobioreaktor-Software (AMBR) aufgeführt. Der Einfluss unterschiedlicher Rührgeschwindigkeiten und pH-Werte auf die lebensfähige Zellkonzentration (VCC) und den Titer wird im Laufe dieses Experiments untersucht. Das experimentelle Ergebnis und die Analyse werden mit dem Entwurf der Experimentiersoftware MODDE 12 durchgeführt. Die Produktanalyse erfolgt in einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-System (HPLC) mit einer Protein-A-Säule. Es basiert auf dem Prinzip, dass die Fc-Region des mAb an Protein A mit hoher Affinität10,11bindet. Mit dieser Methode ist es möglich, das mAb zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Quantifizierung erfolgt über die gemessenen Elutionsspitzenflächen bei 280 nm.
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Protocol
1. Präkulturverfahren
HINWEIS: Für dieses Protokoll werden rekombinante CHO DG44-Zellen mit einer lebensfähigen Zellkonzentration von 1 x 107 Zellen/ml verwendet.
- Die Durchstechflasche mit 1,2 ml Zellen auf Raumtemperatur auftauen und die Zellsuspension sofort in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml kaltem Samenmedium übertragen.
- Zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenrohr 5 Minuten lang bei 190 x g und Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
- 150 ml des Saatmediums in einem 500 ml Schüttelkolben auf 36,8 °C vorheizen.
- Das Zellpellet in 10 ml vorgewärmten Samenmedium sanieren und die Zellen in den Schüttelkolben übertragen.
- Verwenden Sie 1 ml der Probe aus dem Kolben, um die anfängliche VCC und die Lebensfähigkeit mit einem Zellzähler zu messen.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit sollte nach dem Auftauen für einen erfolgreichen Anbau über 70 % liegen. - Inkubieren Sie den Schüttelkolben in einem Orbital-Shaker (Shakerdurchmesser 19 mm) bei 36,8 °C und 7,5%CO2 mit einer Schüttelleistung von 120 U/min.
HINWEIS: Diese Bedingungen variieren je nach Zellstamm und Medium. - Drei Tage nach dem Passieren der Zellen, entfernen Sie den Schüttelkolben aus dem Shaker und legen Sie ihn unter den laminaren Strömungsschrank. Nehmen Sie 1 ml Probe, um die endgültige Zellkonzentration zu messen. Berechnen Sie das Volumen, das auf ein frisches vorgewärmtes Samenmedium übertragen werden soll, so dass die anfängliche Zellkonzentration in der neuen Passage 2 x 105 Zellen/ml beträgt.
- Durchreise der Zellen insgesamt 5 Mal vor der Übertragung auf den Bioreaktor für den Hauptanbau.
2. Hauptanbau
- Messen Sie die endgültige Zellkonzentration der Präkultur. Berechnen Sie das Volumen, das auf den Bioreaktor übertragen werden soll, so dass die anfängliche Zellkonzentration im Reaktor 3 x 105 Zellen/ml beträgt.
- Füllen Sie den Reaktor einen Tag vor der Impfung mit Produktionsmedium, um den Reaktor auszugleichen, und legen Sie die Prozessparameter wie Temperatur, pH und DO fest.
HINWEIS: Die Anbaubedingungen betragen 36,8 °C und 60% Konzentration von gelöstem Sauerstoff (DO). Wir haben Rührergeschwindigkeiten von 1050 Rpm und 1300 Rpm zusammen mit pKs von 6.9, 7.1 und 7.3 getestet. Die Gesamtdauer des Anbaus beträgt 12 Tage, bis die Zellen geerntet werden. Der Chargenprozess läuft 72 Stunden, danach wird das Vorschubmedium alle 24 stunden hinzugefügt. Das für den Anbau zu verwendende Protokoll wird im nächsten Segment detailliert aufgeführt.
3. Schreiben des Rezepts in der automatisierten Mikrobioreaktor-Software
HINWEIS: Es gibt zwei Möglichkeiten, ein Rezept in der AMBR-Zellkultursoftware zu schreiben: Es wird entweder mithilfe eines Assistenten oder durch manuelles Hinzufügen jedes Schritts erstellt. Für die Zwecke dieses Protokolls werden Schritte mit dem Assistenten angezeigt.
- Erstellen eines neuen Experiments
- Öffnen Sie die AMBR-Zellkultursoftware und klicken Sie im Registerkarte Einführung auf Neues Experiment erstellen.
- Laden des Rezepts
- Geben Sie auf der Registerkarte Neues Experiment den Namen des Experiments zusammen mit dem Datum ein, an dem es durchgeführt werden soll.
- Aktivieren Sie den Kontrollpunkt für die Kulturstation und die Gefäße, die während des Anbaus verwendet werden sollen. Die Auto Add DOE Tags werden auch für einen einfachen Übergang während der Programmierung des DOE-Experiments aktiviert. Klicken Sie auf Weiter, um zur nächsten Registerkarte zu wechseln.
- Legen Sie Informationen über die Zugabe von Medien in das Gefäß zusammen mit Antischaum, Inokulum, Futter und Glukose fest.
- Aktivieren Sie den Prüfpunkt Medienplatte hinzufügen. Definieren Sie den Plattentyp, den Namen und die Position der Platte, die das Medium enthält.
VORSICHT: Je nach Art der Platte und wenn die Platte einen Deckel enthält, aktivieren Sie die Überprüfung auf Is Lidded, um eine reibungslose Funktion des Flüssigkeitshandlers zu gewährleisten - Klicken Sie auf Medien zu Schiffen hinzufügen. Geben Sie das Volumen des Mediums ein, das in die Gefäße eingefügt werden soll. Definieren Sie die Kartierung der Übertragung des Mediums von der Platte zu den Gefäßen. Klicken Sie auf Weiter, um zur nächsten Registerkarte zu wechseln.
- Aktivieren Sie den Prüfpunkt Medienplatte hinzufügen. Definieren Sie den Plattentyp, den Namen und die Position der Platte, die das Medium enthält.
- Stellen Sie die Anbaubedingungen im Reaktor ein.
- Nachdem die Medieninformationen in die Software eingespeist wurden, weisen Sie die Anbaubedingungen zu. Klicken Sie auf Condition Media und füllen Sie die Temperatur, Ziel-DO, den oberen pH-Grenzwert und das Rühren von RPM (Aufrühren oder Nachunterrühren) aus.
- Setzen Sie die Zugabe von Inokulumen in die Gefäße.
- Aktivieren Sie Zellenplatte hinzufügen. Definieren Sie den Plattentyp, den Namen und die Position der Platte, die das Medium enthält.
- Klicken Sie auf Zellen zu Gefäßen hinzufügen. Geben Sie den Zeitpunkt der Impfung und das Volumen des Mediums ein, das den Gefäßen hinzugefügt werden soll.
- Definieren Sie den Weg, den der Flüssigkeitshandler zur Übertragung der Zelle von der Platte zu den Gefäßen zurückgelegt hat. Klicken Sie auf Weiter, um zur nächsten Registerkarte zu wechseln.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Die Pipettenspitzen deaktiviert sind, um Kreuzkontaminationunden und eine falsche anfängliche lebensfähige Zellkonzentration zu vermeiden.
- Set Zugabe von Futter, Glukose und Antischaum.
HINWEIS: Das Verfahren zur Zugabe von Futtermitteln, Glukose und Antischaum ist ähnlich. Für dieses Protokoll wird das Verfahren für "Feed" aufgeführt. Dies kann für Glukose und Antischaum repliziert werden.- Aktivieren Sie die Vorschubplatte hinzufügen und definieren Sie den Plattentyp, den Namen und die Position. Klicken Sie auf Feed zu Gefäßen hinzufügen und geben Sie das Volumen des Futters ein, das den Gefäßen hinzugefügt werden soll. Definieren Sie die Kartierung der Übertragung des Futters von der Platte zu den Gefäßen.
- Je nach Anbau die Anzahl der Futterzusätze hinzufügen. Für diesen Anbau wird der Reaktor nach 72 Stunden alle 24 Stunden zugeführt.
- Fügen Sie manuell die Zeitverzögerung zwischen der Fütterung hinzu, indem Sie die Daten aus den hinzugefügten Zellenin Delay eingeben. Der erste Tag der Fütterung ist nach 72 Stunden Impfung und der nächste ist nach 96 Stunden und so weiter.
HINWEIS: Antischaumzusatz ist so programmiert, dass er jeden Tag hinzugefügt wird, um ein Schaumwährend während des Anbaus zu vermeiden.
- Legen Sie die Probenahme während des Anbaus fest.
- Aktivieren Sie die Beispielplatte hinzufügen und definieren Sie den Plattentyp, den Namen und die Position.
- Überprüfen Sie die Probe aus den Schiffen und geben Sie das Volumen der Probe ein, die aus den Gefäßen entfernt werden soll. Definieren Sie die Kartierung der Übertragung der Probe von den Gefäßen auf die Platte. Stellen Sie sicher, dass das Volumen während des gesamten Anbaus nicht unter 10 ml sinkt.
- Fügen Sie die Anzahl der Proben hinzu, die während des Anbaus entnommen werden sollen. Fügen Sie ähnlich wie bei der Fütterung die Zeit hinzu, zu der die Probe für jeden Eingangsprobenpunkt aus dem Behälter entfernt wird.
- Speichern Sie den Prozess. Es ist jetzt bereit für die Ausführung.
HINWEIS: Um den reibungslosen Ablauf des Protokolls zu gewährleisten, wechseln Sie zur Registerkarte Prozessschritte in der AMBR-Zellenkultursoftware, und wählen Sie Prozessschrittansicht aus, um den Ablauf des Rezepts zu visualisieren.
- Geben Sie auf der Registerkarte Neues Experiment den Namen des Experiments zusammen mit dem Datum ein, an dem es durchgeführt werden soll.
- Versuchsplanung im automatisierten Mikrobioreaktor
- Um die DOE-Software des Bioreaktors laufen zu lassen, stellen Sie sicher, dass das Rezept in der Hauptsoftware gespeichert und einsatzbereit ist.
- Öffnen Sie die AMBR 15 DOE Software und klicken Sie auf Untersuchung und wählen Sie Neu.
- Geben Sie den Namen der neuen DOE-Untersuchung in das Dialogfeld Untersuchung erstellen ein.
- Um der DOE-Untersuchung ein Experiment zuzuweisen, öffnen Sie das Rezept, das erstellt wurde, um die verschiedenen Parameter zu untersuchen. Klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie das entsprechende Experiment aus.
- Definieren Sie den DOE-Faktor.
- Die Schiffs-Tags sind bereits in der Spalte eingetragen. Um den gewünschten DOE-Faktor zu definieren, wählen Sie den Parameter aus und klicken Sie auf die Spalte mit der Bezeichnung DOE-Faktor. Wählen Sie Neu und fügen Sie die Einheiten, Abkürzung, Unter- und Obergrenze der Faktoren (z. B. Temperatur, DO, pH) hinzu.
- Definieren Sie den Antwortfaktor.
- Nachdem die DOE-Faktoren definiert wurden, definieren Sie die Antwortvariablen, auf deren Grundlage die experimentelle Analyse strukturiert werden soll.
- Definieren Sie auf der Registerkarte Antworten die Werte, die für die Analyse der Daten berücksichtigt werden sollen.
- Klicken Sie auf DOE-Antworten bearbeiten und definieren Sie den Namen der Antwort, Abkürzung, Einheiten, Minimal- und Maximalgrenzen (z. B. Titer, lebensfähige Zellkonzentration).
- Nachdem die Antworten definiert wurden, wählen Sie die AMBR-Variable für jede Antwort aus, und definieren Sie die Variable. Eine Antwort kann automatisch einer Mikrobioreaktorvariablen zugeordnet werden, Wählen Sie die erforderliche Variable aus der Dropdown-Liste aus.
- Ändern Sie die Gleichung für jede Antwort in Abhängigkeit von der Anforderung. Die Wahl liegt zwischen den minimalen, maximalen, ersten, letzten und durchschnittlichen Daten.
- Erstellen Sie ein Design.
- Verwenden Sie den Assistenten zum Starten des Entwurfs, um den Typ des experimentellen Entwurfs auszuwählen, um die Anzahl der Replikationen und Mittelpunkte hinzuzufügen oder zu entfernen.
- Wählen Sie das Ziel aus, das die Auswahl der Designs und Modelle bestimmt:
Screening: Verwendet lineare und Interaktionsmodelle, um die wichtigen Faktoren zu finden
Optimierung (RSM), verwendet quadratische und kubische Modelle für detaillierte Modellierung und Optimierung
Split-Ziel: Modelle für Formulierung und Prozessfaktoren können separat gewählt werden - Sobald das Ziel festgelegt ist, wählen Sie das Modell und den Entwurf zusammen mit der Anzahl der Mittelpunkte und Replikationen.
- Klicken Sie auf Fertig stellen und wechseln Sie zur nächsten Registerkarte.
- Definieren Sie das Experiment.
HINWEIS: Die DOE-Faktoren sind in der rechten Spalte der Software aufgeführt. Bei der Auswahl der gewünschten Faktoren werden die Schiffe hervorgehoben, die mit dem gewünschten Parameter experimentieren. Die Schiffe innerhalb der Kulturstation können durch Rechtsklick auf das Schiff bewegt und an den gewünschten Ort bewegt werden.- Erstellen Sie Arbeitspakete, die in die AMBR-Zellenkultursoftware importiert werden können. Je nach Anzahl der Experimente werden die verschiedenen Arbeitspakete erstellt und für die weitere Implementierung gespeichert.
- Ausführung des Experiments in den Arbeitspaketen, die auf dem AMBR-Steuer-Laptop erstellt wurden
- Klicken Sie auf der Registerkarte Experimentieren auf DOE-Experiment erstellen und suchen Sie nach dem Arbeitspaket, das mit der DOE-Software erstellt wurde.
- Initialisieren Sie den Prozess, indem Sie auf Startklicken.
- Analyse der experimentellen Ergebnisse
- Nachdem das Experiment ausgeführt wurde, exportieren Sie die Daten mit Export DOE Results. Das Fenster DOE-Ergebnisse exportieren wird geöffnet, und die Zeilen, die das Kulturschiff und die Station angeben, sind in der Tabelle aufgeführt.
- Wählen Sie die gewünschten Zeilen aus und klicken Sie auf Exportierte ausgewählte Zeilen oder Experimentelle Daten exportieren, um alle Ergebnisse zu speichern und die Datei zur weiteren Analyse zu speichern.
- Importieren Sie die Daten in das AMBR DOE-Modul, indem Sie zur Registerkarte Ergebnisse wechseln und Ergebnisse importierenauswählen.
- Suchen Sie nach der gewünschten Datendatei, und klicken Sie auf die Analyseergebnisse.
- Analysieren Sie die Ergebnisse weiter in MODDE.
4. Durchführung des Anbaus im automatisierten Mikrobioreaktor
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden vom Benutzer mit Hilfe des protokolls ausgeführt, das in der oben genannten Software geschrieben ist. Die Schritte werden vom Benutzer durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- Beladen der Schiffe
- Öffnen Sie die gammasterilisierten Kulturgefäße unter einem laminaren Strömungsschrank und orientieren Sie sich in der Kulturstation, wie in Abbildung 2dargestellt.
- Reinigen Sie die Klemmplatte mit 70% Ethanol und doppelt destilliertem Wasser. Dann autoklavieren Sie die Platte und legen Sie sie auf das Gefäß.
- Montieren Sie die Klemmplatte mit einer Rührplatte, um sicherzustellen, dass jeder Stift fest fixiert ist.
- Ziehen Sie sowohl die Rührplatte als auch die Klemmplatte an der Rühreinheit fest.
- Ausführen der Mikrobioreaktor-Software
- Verwenden Sie das in Abschnitt 3 geschriebene Programm, um den Anbau auszuführen.
- Visualisieren Sie die geplanten oder abgeschlossenen Prozessschritte auf der Registerkarte Prozess. Ändern Sie die Kultivierungsschritte während des Prozesses nach Bedarf, indem Sie zuerst den Flüssigkeitshandler anhalten und dann das Prozessrezept bearbeiten.
- Fügen Sie antifoam zu den Gefäßen hinzu, bevor der Rührer gestartet wird, um sicherzustellen, dass es während des Anbaus nicht zu übermäßig enumwomitt. Der Antischaum wird regelmäßig hinzugefügt und der Schaum visuell erkannt.
- Einbau von Medien in das Schiff
- Füllen Sie die 24 Well-Platte, die mit den Mikrobioreaktoren geliefert wird, manuell mit sterilen Medien und legen Sie sie auf dem dafür vorgesehenen Deck des Systems. Stellen Sie sicher, dass die Platte in dem vom geschriebenen Programm bezeichneten Deck platziert wird (Abschnitt 3). Die Befüllung des Schiffes erfolgt gemäß Abschnitt 3.2.2.
HINWEIS: Die Temperatur und der Rührer beginnen unmittelbar nach zugabe des Mediums und des Antischaums. Der Sensorleser wird 1 Stunde nach dem Befüllen des Behälters aktiviert (Startmonitorschritt). Die Vergasung jedes Schiffes beginnt, sobald der Reader aktiviert wurde. Die Medien müssen mindestens 6 Stunden vor der pH-Neukalibrierung und Impfung ausgeglichen werden. Die Prozessparameter können in der Software geändert werden, wie in Abschnitt 3.2.3 erwähnt.
- Füllen Sie die 24 Well-Platte, die mit den Mikrobioreaktoren geliefert wird, manuell mit sterilen Medien und legen Sie sie auf dem dafür vorgesehenen Deck des Systems. Stellen Sie sicher, dass die Platte in dem vom geschriebenen Programm bezeichneten Deck platziert wird (Abschnitt 3). Die Befüllung des Schiffes erfolgt gemäß Abschnitt 3.2.2.
- Impfung
- Messen Sie die lebensfähige Zellkonzentration nach dem5. Durchgang. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die an die Gefäße übertragen werden sollen, um sicherzustellen, dass die anfängliche Zellkonzentration in allen Gefäßen 3 x 105 Zellen/ml beträgt.
- Übertragen Sie die Zellen auf eine 24 tiefe Brunnenplatte, so dass das Volumen der Suspension mindestens 1,6-mal so groß ist wie das erforderliche Volumen. Für ein erforderliches Volumen von 2 ml des Inokulums 3,2 ml Zellsuspension in jeden Brunnen in der Platte übertragen.
- Legen Sie die 24 Brunnenplatte in das dafür vorgesehene Deck. Die Schiffe werden wie in Abschnitt 3.2.4 geimpft.
- Tägliche Sampeln und Analytik
- Entfernen Sie täglich mit dem Flüssigkeitshandler eine 460-L-Probe aus den Gefäßen. Verdünnen Sie 200 l der Probe mit 800 l gefiltertem 1x PBS-Puffer (5x Verdünnung), und legen Sie sie dann in den Zellzähler.
- Zentrifugieren Sie die restliche Probe für 5 min bei 190 x g und Raumtemperatur und speichern Sie den Überstand zur weiteren Analyse (Glucose, Laktat, Glutamin und Glutamat).
- 100 l des Überstandes bei -20 °C bis zum Ende des Anbaus zur Proteinquantifizierung einfrieren.
- Ende des Anbaus
- Wenn die Prozessparametersteuerung (d. h. Temperatur, Rührung, pH und DO) beendet ist, beenden Sie die Überwachung des Prozesses.
- Lösen Sie die Rührplatte und die Klemmplatte.
- Entfernen Sie die Kulturgefäße und reinigen Sie die Kulturstationen. Legen Sie die Trocknungsplatten auf die Kulturstationen und schrauben Sie sie ein.
- In der Zwischenzeit die Klemmplatten gründlich mit 70% Ethanol und doppelt destilliertem Wasser reinigen.
- Klicken Sie in der Bioreaktor-Software auf Stopp, sobald der Trocknungszyklus abgeschlossen ist.
- Zellkultur-Ernte
- Erntezellen an Tag 12 des Anbaus durch manuelle Entfernung des Gefäßgehalts in 50 ml Zentrifugenrohre. Zentrifugieren Sie die Zellbrühe bei 190 x g für 30 min.
- Entsorgen Sie das Zellpellet und lagern Sie den Überstand bei -20 °C.
5. Messung der mAb-Konzentration
- Verwenden Sie eine 1,7 ml Protein-A-Säule zur Quantifizierung des Proteins während des Kultivierungslaufs.
-
Bereiten Sie den Gleichgewichts- und Elutionspuffer vor, bevor Sie die Proben auftauen.
- Verwenden Sie eine Lösung von 0,5 M Na2HPO4 mit 0,5 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,9 als Ausgleichspuffer und einer Lösung von 100 mM Glycin mit 0,5 M NaCl mit einem pH-Wert von 2 als Elutionspuffer.
- Filtern Sie beide Puffer durch eine 0,2 m Membran und Degas, bevor sie für die Analyse platziert werden.
- Reinigen Sie das Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystem (HPLC) mit frisch zubereitetem Ausgleichspuffer.
- Laden Sie die Protein-A-Säule auf das HPLC-System.
- Chromatographie mit einer Durchflussrate von 1 ml/min. Stellen Sie die Säulenofentemperatur auf 30 °C und die Autosamplertemperatur auf 10 °C ein.
- Die gefrorenen Proben bei Raumtemperatur auftauen und jeweils 225 l durch eine 0,22-m-PVDF-Membran filtern. Verdünnen Sie die Proben mit höherer Konzentration des gewünschten Proteins sind in einem 1:20 Verhältnis mit Gleichgewichtspuffer und filtern durch die Membran vor der Platzierung in den Autosampler.
- Platzieren Sie die Samples im Autosampler. Laden Sie die Methode und sequenziap.
HINWEIS: Das Verfahren besteht aus drei Phasen (siehe Abbildung 1):Injektion der Probe in die Spalte für die ersten zwei Minuten; gefolgt von Elutionspuffer für 8 min und Säulenregeneration mit Ausgleichspuffer für 10 min.
Abbildung 1: Protein A Chromatogramm, das die verschiedenen Phasen während eines einzelnen Durchlaufs darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Abbildung 2gibt einen Überblick über den Anbau dieser Studie .
Abbildung 2: Schematische Darstellung der experimentellen Bedingungen zum Testen von pH- und Rührergeschwindigkeitsprofilen in den Kulturstationen. Die Abbildung stellt auch das richtige Layout für die Aufstellung der Schiffe dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Zellwachstum in den automatisierten Mikrobioreaktoren ist vergleichbar mit den Mehrzweck-Bioreaktoren. Dies ist in Abbildung 3dargestellt. Die Zellkonzentration aus den drei verschiedenen Skalen wird verglichen und es wird beobachtet, dass der 15 ml automatisierte Mikrobioreaktor den 2 L-Glas-Bioreaktor imitiert. Die Ergebnisse des Schüttelkolbens werden auch verglichen, um den Vorteil des AMBR zu zeigen.
Abbildung 3: Vergleich der lebensfähigen Zellkonzentration in verschiedenen Maßstäben. 15 ml Mikrobioreaktor, 150 ml Schüttelkolben und 2 L Mehrzweckglas-Bioreaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Einfluss unterschiedlicher Rührgeschwindigkeit und pH-Wert wird in den automatisierten Mikrobioreaktoren untersucht. Die lebensfähige Zellkonzentration (VCC) ist einer der entscheidenden Parameter, um die Kultivierung zu vergleichen. Abbildung 4 stellt den Vergleich der VCC- und monoklonalen Antikörperkonzentration in den verschiedenen Mikrobioreaktoren dar. Abbildung 5 stellt das Antwortkonturdiagramm der beiden für den Vergleich berücksichtigten Antworten dar, nämlich die VCC- und die mAb-Konzentration. Die Werte sind in den Behältern mit dem gleichen pH-Wert und unterschiedlicher Rührgeschwindigkeit vergleichbar, was darauf hindeutet, dass die für diesen Prozess gewählte Rührgeschwindigkeit keinen signifikanten Einfluss auf die Prozessleistung hat. Für künftige Kultivierungen würde die Rührgeschwindigkeit von 1050 Umdrehungen min verwendet, um Einschäumungen zu vermeiden.
Der pH-Wert wirkt sich jedoch auffällig auf die Prozessausgabedaten aus. Der negative Einfluss von pH 6,9 auf den VCC ist in Abbildung 4A zubeobachten. Das Wachstum der Zellen verbesserte sich unter der Kultur bei pH 7,3 gegenüber pH 7,1 signifikant. In Abbildung 5Bwird die monoklonale Antikörperkonzentration der verschiedenen Kultivierungen verglichen. Die Produktion des mAb ist in den Behältern, die bei pH 7,3 gehalten werden, langsamer; die Konzentration des Endprodukts ist jedoch mit dem Behälter vergleichbar, der bei pH 7.1 gehalten wird.
Abbildung 4: Ergebnis des DOE-Experiments. (A) Lebendiges Zellkonzentrationsprofil des Kultivierungslaufs zur Untersuchung des Einflusses von pH- und Rührgeschwindigkeit (B) Monoklonales Antikörperkonzentrationsprofil auf das Fütterungsbatchverfahren unter den jeweiligen Anbaubedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Reaktionskonturdiagramm, das den Einfluss von pH- und Rührergeschwindigkeit auf die maximal lebensfähige Zellkonzentration bzw. den monoklonalen Antikörper anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Einer der Vorteile des AMBR ist die kontinuierliche Überwachung und Kontrolle des Anbaus. Die Überwachung des pH-Werts ist in Abbildung 6zu beobachten. Der pH-Wert wird am Sollwert mit CO2gesteuert. Die Bolusfütterung ab Tag 3 ist für die Spitze der Werte verantwortlich.
Abbildung 6: pH-Überwachung in den automatisierten Mikrobioreaktoren für den Anbau mit Sollwert punkten von pH 6,9, 7,1 und 7,3 und einer Rührerdrehzahl von 1050 Umdrehungen pro Minute. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die für die zukünftigen Prüfungen verwendeten Prozessparameter wurden auf eine Rührgeschwindigkeit von 1050 Umdrehungen pro Minute und einen pH-Wert von 7,1 eingegrenzt.
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Discussion
Die Optimierung des Prozesses zur Ertragssteigerung ist in der biopharmazeutischen Industrie von entscheidender Bedeutung. Schüttelkolben könnten möglicherweise für das Screening der Sorte verwendet werden; Die Überwachung der Prozessparameter wie pH und DO ist jedoch in den Kolben nicht verfügbar. Die Mikrobioreaktoren haben einen Vorteil, da sie eine kontinuierliche Überwachung und Kontrolle des Prozesses ermöglichen. Diese Regelkreise im Mikrobioreaktor bieten auch einen ähnlichen Zustand wie in größerem Maßstab und liefern somit Ergebnisse, die mit den größeren Bioreaktoren vergleichbar sind. Ein weiterer Vorteil des Mikrobioreaktors ist die breite Palette von Bedingungen, die innerhalb des gleichen Zeitrahmens und zu niedrigeren Kosten im Vergleich zu Tisch-Top-Bioreaktoren in Bezug auf Zeit und Arbeit getestet werden können12,13 . Die kleinere Größe ist auch vorteilhaft in Bezug auf geringere Betriebskosten aufgrund der reduzierten Menge an Substrat und reduzierten Platzbedarf für parallele Operationen; die Kosten der Schiffe müssen jedoch berücksichtigt werden, da es im Vergleich zum Multiuse-Bioreaktor der Bank höher sein kann, den Anbau in den Einweg-Mikrobioreaktoren durchzuführen.
Obwohl es mehrere Vorteile für das System gibt, gibt es einige erhebliche Nachteile für die Verwendung der Mikro-Bioreaktoren. Das Ändern des pH-Werts und der DO für jedes Schiff innerhalb einer Kulturstation ist möglich; die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur können jedoch für ein einzelnes Gefäß nicht geändert werden. Dies erhöht die Anzahl der Experimente, die durchgeführt werden, um die optimale Rührgeschwindigkeit und Temperatur zu bestimmen. Die Online-Messungen sind auf pH und DO beschränkt. Die Echtzeit-Prozessüberwachung der kritischen Prozessparameter (CPP), wie Temperatur, pH-Wert, DO, wäre von Vorteil, um die Verzögerung zwischen Probenahme und Analyse zu vermeiden. Es hat das Potenzial, ein nützliches Werkzeug zur Optimierung der Produktivität zu sein14. Die Entwicklung im Bereich der spektroskopischen Messungen in Mikrobioreaktoren könnte sich in den zukünftigen Modellen als vorteilhaft erweisen.
Die Vorteile überwiegen die Nachteile des automatisierten Mikrobioreaktors. Es gibt jedoch einige Kriterien, die beim Betrieb dieser Systeme berücksichtigt werden müssen. In erster Linie ist die Gestaltung des Skripts, um die Kultivierung erfolgreich auszuführen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das geschriebene Skript alle wichtigen Schritte wie die Definition der Platten zusammen mit der korrekten Kartierung der Platte und der Gefäße einbezieht. Alle Parameter müssen vor Beginn des Experiments überprüft werden. Stellen Sie sicher, dass keine Prozessschritte gleichzeitig geplant sind. Dies führt dazu, dass die Arbeitsstation einen Schritt über den anderen entscheidet.
Ein weiteres wichtiges Kriterium, auf das man sich konzentrieren muss, ist die Verwendung der Klemmplatten. Die Platten werden vor jedem Anbau autoklaviert; dies kann zu Schäden an den O-Ringen führen. Überprüfen Sie die O-Ringe vor dem Autoklavieren visuell. Fehlerhafte O-Ringe können zu unerwarteten Abweichungen in der DO- und pH-Steuerung führen. Der andere Faktor für fehlerhafte Messwerte könnte eine lose Verbindung zwischen der Klemmplatte und den Gefäßen sein. Stellen Sie sicher, dass die Klemmplatte und die Rührplatten fest an der Rühreinheit befestigt sind. Verwenden Sie das mit dem System gelieferte Anzugswerkzeug.
Während der Kultivierung ist es wichtig, den Schaum visuell zu überwachen. Zu Beginn des Anbaus sind mindestens 20 l Antischaum erforderlich. Das Schäumen führt dazu, dass Flüssigkeit im Trog der Klemmplatte vorhanden ist. Ein Überschuss des Schaums in der Klemmplatte führt zu einem Überlauf, was dazu führt, dass der Schaum am Boden der Kulturstation gesammelt wird, wodurch die vom Sensor zu lesenden pH- und DO-Spots verschleiert werden.
Ein weiterer wichtiger Faktor, auf den wir uns konzentrieren sollten, ist der Einsatz der DOE-Software. Die integrierte DOE-Software ermöglicht eine schnelle Gestaltung des Prozesses unter Einbeziehung der relevanten Bedingungen. Die Visualisierung der verwendeten Gefäße stellt sicher, dass kein Faktor übersehen wurde. Einer der Vorteile der DOE-Analyse besteht darin, dass die Experimente über Arbeitspakete konfiguriert werden können, wobei jeder Bioreaktor mit definierten Bioverarbeitungsparametern konfiguriert werden kann. Alle generierten Daten werden mit MODDE analysiert. Die Software verwaltet die große Menge an Daten, die im Laufe des Experiments generiert werden. Ein verallgemeinertes Submengen-Design-Setup erzeugt eine Sequenz von reduziertem Design-Set und löst so das Problem mit multivariater Kalibrierung.
In diesem Artikel wird ein detailliertes Verfahren zum Ausführen eines Versuchsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor gezeigt. Das Protokoll wurde entwickelt, um sich auf den Feedbatch-Prozess zu konzentrieren. Die DOE-Software unterstützte bei der Ermittlung der optimalen Prozessparameter zur Erhöhung der Biomasse und der Titerkonzentration. Die Anbaudaten wurden auch mit einem Experiment in einem Shakekolben und einem 2 L-Bench-Top-Bioreaktor verglichen. Die Ergebnisse zeigen die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Prozesses. Ziel des Protokolls war es, den Einsatz automatisierter Mikrobioreaktoren in einem Futterchargenprozess zu demonstrieren und die Bioverarbeitungsparameter mit der DOE-Software zu analysieren. Daraus lässt sich schließen, dass die automatisierten Mikrobioreaktoren für die Prozessentwicklung nützlich sind und auf ein Semiperfusionssystem15erweitert werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), dem Bundesministerium für Bildung und Forschung, Deutschland, und dem BioProcessing-Team der Sartorius Stedim Biotech GmbH, Deutschland, für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G.
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al.
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
