Summary
O microequilíbrio de cristal de quartzo pode fornecer propriedades precisas de massa e viscoelásticas para filmes na faixa de mícrons ou submicron, o que é relevante para investigações em sensoriamento biomédico e ambiental, revestimentos e ciência de polímeros. A espessura da amostra influencia quais informações podem ser obtidas a partir do material em contato com o sensor.
Abstract
Neste estudo, apresentamos vários exemplos de como a preparação fina do filme para experimentos de microequilíbrio de cristal de quartzo informa a modelagem adequada dos dados e determina quais propriedades do filme podem ser quantificadas. O microequilíbrio de cristal de quartzo oferece uma plataforma exclusivamente sensível para medir mudanças finas em propriedades de massa e/ou mecânicas de um filme aplicado, observando as mudanças na ressonância mecânica de um cristal de quartzo oscilando em alta freqüência. As vantagens dessa abordagem incluem sua versatilidade experimental, capacidade de estudar mudanças nas propriedades ao longo de uma ampla gama de comprimentos de tempo experimentais e o uso de pequenos tamanhos de amostra. Demonstramos que, com base na espessura e no modulus de cisalhamento da camada depositada no sensor, podemos adquirir informações diferentes do material. Aqui, este conceito é especificamente explorado para exibir parâmetros experimentais, resultando em cálculos em massa e viscoelásticos de colágeno adsorlado em complexos de ouro e polieletrólitos durante o inchaço em função da concentração de sal.
Introduction
O microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM) aproveita o efeito piezoelétrico de um cristal de quartzo para monitorar sua frequência ressonante, que depende da massa aderida à superfície. A técnica compara a freqüência ressonante e largura de banda de um sensor de cristal de quartzo at corte (normalmente na faixa de 5 MHz)1 no ar ou um fluido para a freqüência e largura de banda do sensor após a deposição de um filme. Existem vários benefícios para o uso do QCM para estudar propriedades e interfaces de película fina, incluindo a alta sensibilidade à massa e potencialmente a mudanças de propriedade viscoelásticas (dependendo da uniformidade e espessura da amostra), a capacidade de realizar estudos in situ2,e a capacidade de sondar uma escala de tempo reológica muito mais curta do que a reologia tradicional da tesoura ou análise dinâmica mecânica (DMA). Sondar um curto calendário reológico permite a observação de como a resposta neste período de tempo muda tanto ao longo de durações extremamente curtas (ms)3 e longas (anos)4. Esta capacidade é benéfica para o estudo de uma variedade de processos cinéticos e também é uma extensão útil das técnicas rheométricas tradicionais5,6.
A alta sensibilidade do QCM também levou ao seu uso pesado em aplicações biológicas estudando as interações fundamentais de biomoléculas extremamente pequenas. Uma superfície de sensor não revestida ou funcionalizada pode ser usada para investigar a adsorção de proteínas; ainda mais, biosensoriar através de eventos de ligação complexos entre enzimas, anticorpos e aptamers pode ser examinado com base em mudanças na massa7,8,9. Por exemplo, a técnica tem sido usada para entender a transformação das vesículas em um bilayer lipídico planar como um processo de duas fases de adsorção de vesículas contendo fluidos para uma estrutura rígida, observando mudanças correlacionantes na frequência e viscoelasticidade10. Nos últimos anos, o QCM também ofereceu uma plataforma robusta para monitorar a entrega de drogas por vesículas ou nanopartículas11. Na interseção da engenharia de materiais e da biologia molecular e celular, podemos usar o QCM para elucidar as principais interações entre materiais e componentes bioativos, como proteínas, ácidos nucleicos, lipossomos e células. Por exemplo, adsorção de proteína a um biomaterial medeia respostas celulares a jusante, como inflamação e é frequentemente usada como um indicador positivo de biocompatibilidade, enquanto em outros casos o apego de proteína extracelular a revestimentos que a interface com o sangue pode induzir coagulação perigosa nos vasos12,13. O QCM pode, portanto, ser usado como uma ferramenta para selecionar candidatos ideal para diferentes necessidades.
Duas abordagens comuns para a realização de experimentos de QCM coletam dados análogos do experimento: a primeira abordagem registra a mudança de frequência e a meia largura de banda(Γ)do pico de condução. A segunda abordagem, O QCM com dissipação (QCM-D), registra a mudança de frequência e o fator de dissipação, que é diretamente proporcional ao Γ por meio da equação 1,14
(1)
onde D é o fator de dissipação e dilema é a freqüência. Tanto D quanto Γ estão relacionados ao efeito de amortecimento que o filme tem no sensor, o que dá uma indicação da rigidez do filme. O subscript n denota o tom de freqüência ou harmônico, que são as freqüências ressonantes ímpares do sensor de quartzo (n = 1, 3, 5, 7...). Uma discussão mais adicional dos modelos que usam harmônicos múltiplos para obter as propriedades maciças e viscoelastic de uma película pode ser encontrada em uma revisão por Johannsmann14 e em papéis precedentes do grupo de Shull15,16,17,18.
Uma consideração fundamental para a preparação de amostras QCM é como aplicar a película fina na superfície do sensor. Alguns métodos comuns incluem revestimento de rotação, revestimento de mergulho, revestimento de gota ou adsorção do filme na superfície do sensor durante o experimento19,20. Há quatro regiões para amostras de QCM: o limite de Sauerbrey, o regime viscoelastic, o regime maioria, e o regime overdamped. Para filmes suficientemente finos, o limite sauerbrey se aplica, onde a mudança de freqüência(δ)fornece a densidade de massa superficial do filme. Dentro do limite sauerbrey, as escalas de deslocamento de freqüência linearmente com o harmônico ressonante, n, e as mudanças no fator de amortecimento (D ou Γ) são geralmente pequenas. Neste regime, não há informações suficientes para determinar exclusivamente as propriedades reológicas da camada sem fazer suposições adicionais. Os dados deste regime são usados para calcular a densidade de massa superficial (ou espessura se a densidade é conhecida a priori) do filme. No regime a granel, onde o meio em contato com o cristal é suficientemente grosso, a onda de cisalhamento evanescente se propaga para o meio antes de ser completamente atenuada. Aqui, nenhuma informação de massa pode ser obtida usando δ. No entanto, nesta região, as propriedades viscoelásticas são determinadas de forma confiável usando a combinação de Δdecidida e ΔΓ 15,18. No regime a granel, se o meio for muito rígido, o filme vai amortecer a ressonância do sensor, impedindo a coleta de quaisquer dados confiáveis do QCM. O regime viscoelástico é o regime intermediário onde o filme é fino o suficiente para ter a onda de cisalhamento totalmente propagar através do filme, bem como têm valores confiáveis para o fator de amortecimento. O fator de amortecimento e δpodem então ser usados para determinar as propriedades viscoelásticas do filme, bem como a sua massa. Aqui, as propriedades viscoelásticas são dadas pelo produto da densidade e da magnitude do complexo modulus cisalhamento | G*| G *| p e o ângulo de fase dado por Φ = arctan (G" / G'). Quando os filmes são preparados no limite de Sauerbrey, a massa por unidade pode ser calculada diretamente com base na equação sauerbrey mostrada abaixo de21,
(2)
onde Δn é a mudança na frequência ressonante, n é o tom de interesse, hidrobordo1 é a frequência ressonante do sensor, Δm/A é a massa por área do filme, e Z q é a impedância acústica de quartzo, que para o quartzo cortado at é Z q = 8,84 x 106kg / m2s. O regime viscoelástico é mais apropriado para o estudo de filmes de polímeros, e o limite de massa é útil para estudar polímero viscoso22 ou soluções proteicas16. Os diferentes regimes dependem das propriedades do material de interesse, com a espessura ideal para caracterização viscoelástica e em massa geralmente aumentando com a rigidez do filme. A Figura 1 descreve as quatro regiões com relação à densidade areal do filme, modulus cisalhamento complexo e ângulo de fase, onde assumimos uma relação específica entre o ângulo de fase e a rigidez do filme que se mostrou relevante para materiais deste tipo. Muitos filmes de interesse prático são muito grossos para estudar as propriedades viscoelásticas com QCM, como certos biofilmes, onde as espessuras estão na ordem de dezenas a centenas de mícrons23. Tais filmes grossos geralmente não são apropriados para estudar usando o QCM, mas podem ser medidos usando ressonadores de frequência muito mais baixa (como ressonadores torsionais)23,permitindo que a onda de cisalhamento se propague ainda mais no filme.
Para determinar qual regime é relevante para uma determinada amostra de QCM, é importante entender o parâmetro d/λ n, que é a razão da espessura do filme(d)para o comprimento de onda de cisalhamento da oscilação mecânica do sensor de cristal de quartzo (λn)15,16,18. O regime viscoelástico ideal é d / λn = 0,05 - 0,218, onde os valores abaixo de 0,05 estão dentro do limite sauerbrey e valores acima de 0,2 abordagem do regime a granel. Uma descrição mais rigorosa de d / λn é fornecido em outros lugares15,18, mas é um parâmetro quantitativo delineando o limite Sauerbrey e o limite viscoelástico. Os programas de análise usados abaixo fornecem esse parâmetro diretamente.
Existem algumas limitações adicionais para analisar filmes finos com o QCM. Os cálculos sauerbrey e viscoelásticos assumem que o filme é homogêneo tanto ao longo da espessura do filme quanto lateralmente na superfície do eletrodo do QCM. Embora essa suposição torne difícil estudar filmes que tenham vazios ou enchimentos presentes, houve algumas investigações da QCM em filmes que consistem em nanopartículas enxertadas6. Se as heterogeneidades são pequenas em comparação com a espessura geral do filme, propriedades viscoelásticas confiáveis do sistema composto ainda podem ser obtidas. Para sistemas mais heterogêneos, os valores obtidos a partir de uma análise viscoelástica devem ser sempre vistos com grande cautela. Idealmente, os resultados obtidos a partir de sistemas com heterogeneidade desconhecida devem ser validados contra sistemas que são conhecidos por serem homogêneos. Esta é a abordagem que tomamos no sistema de exemplo descrito neste artigo.
Um ponto importante que ilustramos neste artigo é a correspondência exata entre as medições de QCM feitas no domínio de frequência (onde o Γ é relatado) e os experimentos de domínio do tempo (onde D é relatado). Resultados de dois experimentos diferentes de QCM, domínio de uma vez e um domínio de frequência, são descritos, cada um envolvendo um sistema de modelo diferente, mas conceitualmente relacionado. O primeiro sistema é um exemplo simples de apego de colágeno ao sensor para ilustrar cinética sem ligarepresentativa e equilíbrio de adsorção ao longo do tempo durante uma medição de domínio de tempo (QCM-D). O colágeno é a proteína mais abundante no corpo, conhecida por sua versatilidade de comportamentos de ligação e morfologia. A solução de colágeno usada aqui não requer funcionalização adicional da superfície de ouro do sensor para induzir adsorção9. O segundo sistema experimental é um complexo de polieletrólito (PEC) composto por sulfona de poliestireno aniônico (PSS) e poli cationic (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparado da mesma forma que Sadman et al.22. Estes materiais incham e tornam-se macios em soluções de sal (KBr neste caso), oferecendo uma plataforma simples para estudar a mecânica de polímeros usando uma abordagem de domínio de frequência (QCM-Z). Para cada protocolo, o processo de preparação, tomada e análise de uma medição é mostrado na Figura 2. O esquema mostra que a principal diferença entre as abordagens QCM-Z e QCM-D está na etapa de coleta de dados e na instrumentação utilizada no experimento. Todas as técnicas de preparação de amostras mencionadas são compatíveis com ambas as abordagens, e cada abordagem pode analisar amostras nas três regiões descritas na Figura 1.
Nossos dados demonstram que a preparação das amostras, seja pelo revestimento do sensor antes ou durante uma medição, dita a capacidade de extrair as propriedades viscoelásticas de um sistema. Ao projetar os estágios iniciais de um experimento adequadamente, podemos determinar quais informações podemos coletar com precisão durante a etapa de análise.
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Protocol
Adsorção de colágeno QCM-D
1. Preparação da amostra e pré-limpeza do sensor
- Prepare 20 mL de 0,1 M tampão de acetato, ajustando o pH com HCl e NaOH conforme necessário para alcançar pH = 5,6.
- Adicione a solução de colágeno da cauda de rato aos 20 mL de tampão de acetato em condições estéreis a uma concentração final de 10 μg/mL.
- Limpe o sensor de quartzo revestido a ouro para remover material orgânico e biológico25,26.
- Coloque o sensor ativo do lado para cima em uma câmara UV / Ozônio e tratar a superfície por aproximadamente 10 min.
- Aqueça uma mistura de 5:1:1 de água desionizada (dH2O), amônia (25%) e peróxido de hidrogênio (30%) a 75 °C. Coloque o sensor na solução por 5 min.
- Lave o sensor com dH2O e seque com um fluxo de gás nitrogênio.
- Coloque o sensor ativo do lado para cima em uma câmara UV / Ozônio e tratar a superfície por 10 min.
NOTA: O procedimento de limpeza deve ser imediatamente realizado antes de uma medida para minimizar a contaminação ambiental na superfície do sensor.
2. Aquisição de dados de medição QCM-D
- Ligue todos os equipamentos necessários para fazer uma medição, incluindo a bomba, unidade eletrônica e software de computador.
- Retire o módulo de fluxo da plataforma de câmara e desaparafusar os parafusos de polegar grande para abrir o módulo.
- Se o sensor foi deixado de fora após a limpeza inicial (etapas 1.3.1-1.3.4), lave o sensor com água desionizada (dH2O) e seque com um fluxo de gás nitrogênio para garantir que não haja contaminantes na superfície.
- Monte o sensor no módulo de fluxo no anel O exposto, primeiro secando a área com um fluxo de gás nitrogênio e verificando se o anel O está deitado. O sensor deve ser colocado com o lado da superfície ativa para baixo e eletrodo em forma de âncora orientado para o marcador no módulo de fluxo.
- Vire os parafusos do polegar para selar o módulo de fluxo e substituí-lo na plataforma de câmara. Anexe a tubulação necessária da bomba PTFE ao módulo de fluxo e à bomba externa.
- Usando o software de computador apropriado, defina a temperatura do módulo de fluxo para 37 °C. Monitorar a mudança de temperatura para 10-15 min para garantir que ele equilibra com o valor desejado.
- Encontre as frequências de ressonância inicial do sensor. Se alguma frequência de ressonância não for encontrada pelo software, verifique se o módulo de fluxo está corretamente posicionado na plataforma de câmara ou remontar o sensor no módulo de fluxo para garantir que ele seja centrado e fazer contato elétrico adequado.
- Coloque a tubulação da bomba de enseada na solução soline amorteceu de fosfato 1x (PBS). Inicie o fluxo de bomba externa a 25 μL/min e inspecione visualmente a tubulação para ter certeza de que o fluido está fluindo através do tubo.
NOTA: O fluxo de fluidos pode ser mais fácil de ver aumentando momentaneamente a taxa de fluxo de fluidopara 100 μL/min ou maior. Se o fluido não parece estar se movendo através do tubo, é mais provável que as duas partes do módulo de fluxo não estão criando um selo adequado. Tente apertar os parafusos do polegar, apertando os conectores da tubulação à entrada e à tomada, ou remontando o sensor para ser certo que o O-anel é liso e centrado. - Permitir o fluxo de fluido do PBS 1x através do módulo de fluxo por pelo menos 15 min para equilibrar corretamente.
- Comece a medição no software de computador para iniciar a aquisição de dados. Monitorar os valores de frequência e dissipação por pelo menos 5 min para garantir uma linha de base estável.
- Pare a bomba e mova a tubulação da entrada à solução do amortecedor do colágeno-acetato, e retome o fluxo fluido. Observe o momento deste evento para análise posterior.
- Permita que os novos valores de frequência e dissipação se equilibrem a um valor estável. Aqui, esperamos que essa estabilização ocorra após 8-12 h.
- Pare a bomba, mova a tubulação da entrada de volta à solução de 1x PBS, e retome o fluxo fluido. Observe o momento deste evento para análise posterior.
- Permita que os novos valores de frequência e dissipação se equilibrem a um valor estável. Aqui, essa estabilização ocorre após 30 min.
NOTA: Os passos 2.13 e 2.14 podem ser repetidos para cada novo período de fluxo de fluidos em experimentos mais rigorosos com um maior número de etapas. - Termine a aquisição de dados da medição e salve os dados.
- Limpe e desmonte o equipamento QCM.
- Aumentar a taxa de fluxo de fluidos da bomba externa para 500 μL/min ou maior e coloque a tubulação de entrada em uma solução de 2% solução de limpeza Hellmanex por pelo menos 20 min.
NOTA: Para outros experimentos, se for desejada uma análise mais aprofundada do sensor, retire o sensor antes da etapa 2.16.1 e coloque outro sensor de limpeza no módulo. - Pare a bomba e mova a tubulação da entrada ao dH2O, e retome o fluxo fluido para nivelar mais o sistema para pelo menos 20 min.
- Pare o fluxo de fluido e retire o sensor do módulo de fluxo. Seque o sensor e dentro do módulo de fluxo com um fluxo de gás nitrogênio. Desligue o software de computador, a unidade eletrônica e a bomba peristaltic.
NOTA: Os sensores revestidos de ouro podem ser devidamente limpos, conforme detalhado nas etapas 1.3.1-1.3.4, e reutilizados para várias medições. As indicações de que um sensor não pode mais ser reutilizado para medições confiáveis podem incluir, mas não estão limitadas à grande variabilidade nas frequências de ressonância inicial e a desvios significativos nas medições de base com fluxo tampão. Os dados podem ser abertos e analisados no software preferido, incluindo aqueles fornecidos por empresas especializadas em equipamentos QCM-D.
- Aumentar a taxa de fluxo de fluidos da bomba externa para 500 μL/min ou maior e coloque a tubulação de entrada em uma solução de 2% solução de limpeza Hellmanex por pelo menos 20 min.
Inchaço complexo de polieletrólitos da QCM
3. Preparação da amostra
NOTA: Este experimento foi realizado usando um programa MATLAB desenvolvido dentro do grupo de pesquisa Shull para coleta e análise de dados.
- Primeiro, posicione um sensor de cristal de quartzo nu em um suporte de amostra conectado ao analisador de rede vetorial e computador. Ligue o analisador para aplicar uma tensão oscilante ao sensor e colete um espectro de condução de referência para o sensor no ar.
- Submergir o suporte da amostra em um copo de 100 mL sem lábios cheio de água destilada e coletar um espectro de condução de referência para o sensor nu na água.
- Prepare uma solução de 0,5 M de brometo de potássio (KBr).
- Dissolva 1,79 g de KBr em 30 mL de água destilada. Agite até dissolver.
- Insira uma pequena bolacha de silício na solução KBr em um ângulo para criar um slide para o sensor de quartzo durante a etapa de annealing para evitar que o filme saia do sensor.
- Prepare o sensor para o revestimento de rotação.
- Defina os parâmetros de revestimento de spin para 10.000 rpm, 8.000 aceleração e 5 s.
- Insira o sensor no coater da rotação e gire sobre o vácuo.
- Cubra a superfície do sensor com etanol e executar o coater spin para limpar a superfície do sensor.
- Adicione o PEC (PSS:PDADMA preparado da mesma forma que detalhado em Sadman et al. 22) para a superfície do sensor.
- Se o complexo está em duas fases (polímero rico e polímero pobre), lentamente inserir o pipet na solução. Evacue o pipet fundindo bolhas ao mover o pipet na fase rica do polímero mais densa.
- Depois de liberar um par de bolhas na fase rica em polímeros, elaborar 0,5-0,75 mL da solução rica em polímero para o pipet. Mantendo a pressão sobre a lâmpada pipet para não permitir que a fase polímera pobres para entrar no pipet, tirar o pipet fora da solução.
- Limpe o lado de fora do pipet usando um Kimwipe. Adicione bastante solução dropwise na superfície do sensor de quartzo para cobrir completamente a superfície. Certifique-se de que não há bolhas visíveis na solução na superfície do sensor.
- Revestir a amostra PEC e submergir imediatamente o sensor na solução de 0,5 M KBr para evitar a cristalização de sal no filme.
NOTA: Esta etapa às vezes é difícil de coordenar. Libere o sensor logo acima da solução KBr para obter melhores resultados. - Permita que o filme para anneal por pelo menos 12 h.
NOTA: Para facilitar a realização do experimento, prepare o passo 4 à noite e permita que o filme anneal durante a noite.
4. Medição do Filme em Ar e Água
- Transfira o sensor para um copo cheio de água destilada para remover o excesso de KBr do filme e da parte traseira do sensor. Deixe o sensor na solução por 30-60 min.
- Faça uma medição do filme no ar. Referência ao sensor desencapado no ar. Permita que os dados do filme se equilibrem.
- Insira sulfato de cálcio seco em um copo sem lábios de 100 mL e medir a espessura do filme completamente seco. Retire o sulfato de cálcio do copo e lave o copo com água destilada.
- Encha o copo sem lábios de 100 mL com 30 mL de água destilada. Insira uma barra de agitação para garantir que a água está circulando ao redor do filme. Medir o filme em água por cerca de 30-45 min ou até que os dados do filme são equilibrados. Referência ao sensor desencapado na água.
- Prepare uma solução de 15 mL de 3 M KBr em água destilada. Medida 5,35 g de KBr em um cilindro graduado e preencher a 15 mL com água destilada. Redemoinho até dissolver.
- Adicione a solução KBr ao copo com água destilada em incrementos de 0,1 M. A Tabela 1 descreve os incrementos de 0,1 M na solução mL de 3 M KBr. Enfrente o filme longe de onde a solução KBr está sendo adicionada à água para que o filme não se dissolva. Certifique-se de que o sistema tenha se equilibrado antes de adicionar outra adição da solução KBr.
- Depois que todos os dados foram adquiridos, remova a película do suporte e coloc em um copo da água destilada. Deixe o sal deixar o filme (30-60 min) e secar o ar do filme.
- Para limpar o filme PEC do sensor, adicione KBr ao copo e gentilmente redemoinho a solução. Deixe descansar por 5-10 min. Repita este processo 2-3 vezes, em seguida, lave o sensor com água destilada.
NOTA: O sensor pode ser limpo e reutilizado se a resposta do sensor ainda for boa. Isso pode ser verificado pelo sensor com pequenas leituras de largura de banda absoluta para os harmônicos de interesse (<100 Hz).
5. Análise de dados
- Abra a análise de dados QCM-D MATLAB GUI criada por Sadman(https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Abra o filme em arquivo de dados aéreos selecionando "Load QCM".
NOTA: O grupo Shull desenvolveu um Python GUI semelhante para coleta e análise de dados para QCM(https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Uma parte do código de análise é fornecida nas informações complementares para analisar os dados e gerar os números deste artigo. - Selecione o cálculo desejado (3,5,3 ou 3,5,5), gama,e filme em ícones do ar. Clique na trama QCM.
- Determine a espessura do filme seco usando o ponto de dados mais equilibrado (normalmente o último ponto de dados) do experimento. Registre esse valor.
- Abra o filme em arquivo de dados de água. Selecione os mesmos parâmetros do passo 5.2, exceto para o filme em água em vez de filme no ar.
- Após cada etapa de equilíbrio do experimento inchaço, determinar a espessura do filme, modulus cisalhamento complexo, eo ângulo de fase viscoelástica. Registre esses valores junto com a força iônica (variando de 0 a 1 M em incrementos de 0,1 M).
- Determinar o inchaço percentual como
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onde dp é a espessura do filme a partir da solução e dpseco é a espessura do filme seco.
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Representative Results
As mudanças de frequência com o tempo durante a adsorção de proteínas apresentam uma curva característica e platô mostrado na Figura 3A-B. A lavagem tampão inicial de 1x PBS através da superfície de sensato induz apenas mudanças insignificantes na frequência, oferecendo uma linha de base constante para atuar como referência para pontos de dados futuros. A introdução da solução de colágeno faz com que a adsorção de proteína saqueie, observada como uma diminuição constante na frequência ao longo do tempo, até a densidade de platôs de colágeno respeitados em uma linha de base estável(Figura 3A). A frequência exata e os valores de massa serão altamente dependentes da pureza e da energia superficial do sensor. Dado estes parâmetros, a lavagem tampão final remove somente uma pequena quantidade de proteína não aderida da superfície do sensor, tendo por resultado um aumento ligeiro na freqüência. Devemos sempre esperar apenas uma ligeira diminuição na massa durante este período, demonstrando uma quantidade estável de proteína ligada ao sensor(Figura 3B).
A importância de alcançar uma medida de frequência estável para cada período não pode ser exagerada. Pequenas flutuações nas variáveis ambientais, como temperatura, umidade e concentração de soluções, podem levar a diferenças observáveis nos dados brutos. Portanto, alterar essas variáveis antes de pelo menos 5-10 min de frequência estável e medições do fator de dissipação pode deturpar as mudanças exatas na frequência e dissipação. Um exemplo de um conjunto de dados abaixo do ideal é mostrado na Figura 3C-D. Aqui, os mesmos parâmetros de concentração e taxa de fluxo da solução são usados como figura A-B,mas o ambiente do instrumento não foi permitido equilibrar antes de começar a medida. A fixação natural da freqüência oscilante do sensor está ocorrendo ao mesmo tempo que uma mudança de temperatura e concentração de fluidos, disfarçando qualquer linha de base potencial que atuará como referência(Figura 3C). Em vez disso, somos forçados a escolher uma média de toda a faixa de frequência dinâmica no período para atuar como referência. Finalmente, o fluxo de colágeno não é permitido equilibrar em uma massa estável antes de iniciar a lavagem PBS final, como pode ser visto pelas mudanças de freqüência ainda mudando pouco antes do PBS entra no sistema. Esta ação não afeta os cálculos de massa, mas não caracteriza totalmente o potencial adsortivo da proteína no sensor(Figura 3D).
Durante os estágios iniciais do experimento de adsorção de colágeno, o filme está no regime de Sauerbrey, indicado por valores de Δurgência/n que são independentes de n (t < 2 h na Figura 3). À medida que o experimento avança, o filme se move para o regime viscoelástico, indicado por valores de Δ/penan que já não se sobrepõem(t > 2,5 h). Reconhecendo essa mudança de comportamento, os dados obtidos do experimento de colágeno foram analisados para analisar a massa areal e as propriedades viscoelásticas usando dois métodos diferentes. O primeiro usa um script Python compilado pelo grupo Shull. Este script tem os mesmos fundamentos matemáticos que o software de coleta e análise de dados MATLAB usado para o experimento PEC. Ele usa um modelo de lei de poder para explicar as diferenças de propriedade em harmônicos adjacentes15 e é fornecido nas informações complementares. O segundo método utiliza valores determinados a partir de um modelo viscoelástico em um pacote de software comercial para calcular a massa areal, o modulus de cisalhamento complexo e o ângulo de fase do filme de colágeno. O modelo viscoelástico deste software relata a espessura (d), modulus elástico (μ), e viscosidade (η). O modulus e a viscosidade elásticos são os elementos de um modelo de Kelvin-Voigt, e são convertidos ao valor e à fase do modulus complexo através das seguintes expressões:
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onde ωn = 2πnƒ1 onde ƒ1 é a freqüência fundamental do sensor de quartzo (5 MHz). A figura 4 mostra as propriedades viscoelásticas determinadas para a adsorção de colágeno calculada a partir dos valores δn e ΔDn do terceiro e quinto harmônicos. A figura 5 compara as propriedades da Figura 4 com as propriedades convertidas a partir dos resultados do software comercial. Como pode ser visto na Figura 5,os valores de software comercial relatam que o filme seja mais suave do que o script Python.
A Figura 6 descreve uma relação que tem sido observada em experimentos qcm anteriores3,22 mostrando uma relação linear entre o ângulo de fase viscoelástica e o logarithm da magnitude do complexo modulus de cisalhamento. A linha verde indica essa relação linear, tendo pontos finais de um fluido newtoniano, como a água (| G*| G *| p = 105Pa • g/cm3 e Φ = 90° em ƒ3 = 15 mHz) e um polímero elástico sólido ou vítreo (| G*| G *| p = 109Pa • g/cm3 e Φ = 0°). Muitos materiais poliméricos estudados usando o QCM seguem essa tendência empírica geral, que foi quantificada usando o sistema complexo PSS:PDADMA22. Como a PEC é submetida a soluções com maiores concentrações de sal, a amostra transita de uma amostra rígida e vítrea para ser mais viscosa e fluida como; este espectro de propriedades cai na linha verde. Para fins de comparação, as propriedades calculadas usando o script Python para o filme de colágeno equilibrado também são traçadas na Figura 6. A relação entre | G*| G *| p e Φ é esperado para ser o mesmo para ambos os sistemas, dado que ambos os sistemas são polímeros vítreos inchados com água. O conteúdo de água do filme determina o ponto específico ao longo da curva. Aqui, o sistema pec com propriedades mecânicas mais próximas do sistema de colágeno corresponde a uma solução de polímero de 20 wt%. Inferimos a partir desta comparação que a concentração de polímeros no filme de colágeno adsorbed também está perto de 20 wt.%. Este resultado é muito útil, obtido no nosso caso pela comparação dos resultados obtidos a partir de dois experimentos QCM devidamente concebidos. Um desses experimentos foi um experimento de domínio do tempo (QCM-D, colágeno) e o outro foi um experimento de domínio de frequência (QCM-Z, PEC), mas esses tipos de experimento são completamente intercambiáveis, com qualquer protocolo suficiente em ambos os casos.
Figura 1: Enredo dos regimes sauerbrey, viscoelástico, a granel e overdamped. O enredo mostra regimes onde diferentes tipos de informações podem ser obtidos a partir de dados qcm, com base na amostra areal massa (relacionada à espessura) e as propriedades viscoelásticas. Abaixo da linha azul está o regime de Sauerbrey, onde apenas a espessura da amostra é calculada. Para a região média, as propriedades de massa e viscoelásticas da amostra podem ser calculadas. No regime a granel no canto superior esquerdo da trama, informações viscoelásticas podem ser obtidas, mas os experimentos não são mais sensíveis à espessura da amostra. No canto superior direito, o regime ultrapassado indica que a amostra é muito espessa para uma medição de QCM ser realizada. Na trama, uma relação linear é assumida entre o ângulo de fase viscoelástica no terceiro harmônico e o registro da magnitude do complexo modulus de cisalhamento (linha verde na Figura 6). O regime a granel é definido como a região onde a espessura é mais do dobro do comprimento da decadência da onda de cisalhamento. O regime de Sauerbrey é definido como a região onde δumentou/3 e Δurgência/5 diferem por menos de 10 Hz e o regime overdamped é o regime onde Γ5 é maior do que 20.000 Hz (D5 > 1600 ppm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Diagrama de fluxo de etapas principais dentro de uma medida de QCM. Esquemático de um experimento QCM-Z ou QCM-D. O diagrama na primeira etapa é um sensor QCM (cinza) com os eletrodos de ouro (ouro) e filme em cima do sensor (roxo), com as diferentes técnicas usadas para aplicar uma película na superfície do sensor. A espessura do filme, d, é indicado. A segunda etapa destaca os dados dos protocolos experimentais QCM-Z (superior) e QCM-D (inferior). O terceiro passo é onde se determina a região onde a amostra pode ser analisada. A quarta etapa mostra os dados resultantes da determinada região de análise. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: "Bom" e "Bad" QCM-D dados para adsorção de colágeno. Parcelas da freqüência e fatores de amortecimento para o experimento de adsorção de colágeno. (A) Mudanças de frequência equilibradas, (B) Mudanças de fator de amortecimento equilibrado, (C) Mudanças de frequência não equilibradas e (D) Mudanças de fator de amortecimento não equilibrado. Em (B) e (D), a mudança de fator de amortecimento é traçada como o fator de dissipação, D, e a largura de banda, Γ, uma vez que o mesmo parâmetro é medido por ambas as mudanças. As mudanças de frequência e gama são normalizadas para seus respectivos harmônicos(n = 3 ou 5). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Análise viscoelástica do colágeno usando um modelo de lei de poder. A (A) massa areal, (B) modulus complexo da tesoura, e (C) ângulo viscoelastic da fase para a experiência do adsorption do colagénio. As primeiras 10 h mostram o estágio principal do adsorption do colagen à superfície do sensor, com o período entre 10 e 20 que mostra o estágio da equilíbrioção antes da lavagem do amortecedor executada em 20 h. As barras de erro representam incertezas nos cálculos para a espessura e propriedades viscoelásticas, assumindo um erro em Δe ΔΓ igual a 1% de Γ. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Análise viscoelástica do colágeno usando um modelo de lei de poder e modelo de software comercial. A (A) massa areal, (B) modulus complexo da tesoura, e (C) ângulo viscoelastic da fase para a experiência do adsorption do colagénio. Os valores de Γ são determinados com o script Python usando os valores δextrair e ΔD a partir dos dados experimentais, enquanto os valores D são convertidos a partir dos resultados do modelo viscoelástico do software comercial. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Gráfico modificado de Van Gurp-Palmen do colágeno e PSS:PDADMA. Um lote do ângulo viscoelástico da fase e o modulus complexo da tesoura sobre a escala geral das amostras mensuráveis usando QCM. A linha verde indica a relação linear entre as duas propriedades que foi assumida no desenvolvimento da Figura 1. Os dados do complexo de polieletrólitos PSS:PDADMA (PEC) são reimpressos com permissão de Sadman et al. 22, direitos autorais 2017 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Molaridade da Solução (M) | mL de 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
Tabela 1: Incrementos molar para o experimento de inchaço pec. A quantidade (em mL) de 3 M solução de brometo de potássio necessária para aumentar a molaridade da solução de água em 0,1 M para o experimento inchaço.
Arquivos suplementares: Código Python. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Os resultados da adsorção de colágeno abrangem os regimes sauerbrey e viscoelásticos. Ao traçar as mudanças de frequência normalizadas para o número harmônico correspondente, observamos que o limite de Sauerbrey é válido para aproximadamente os primeiros 2 h da medição. Com o aumento da adesão em massa ao sensor, no entanto, as mudanças de frequência normalizadas para o terceiro e quinto harmônicos começam a desviar-se um do outro(t > 2 h), indicando uma capacidade de determinar propriedades viscoelásticas do filme adsorbed.
Uma comparação direta entre os resultados de modelagem viscoelástica do software e a modelagem da lei de poder do grupo Shull indica uma diferença notável nas propriedades materiais calculadas. Ao longo da medição, os dados de modelagem viscoelástica do software comercial representaram uma camada mais espessa e suave com um modulus de cisalhamento complexo inferior (Figura 5). As diferenças nas propriedades viscoelásticas entre esses modelos se devem às suposições feitas nos cálculos de cada sistema. Uma diferença diz respeito a uma suposição que precisa ser feita sobre a dependência de frequência das propriedades viscoelásticas. Alguma suposição precisa ser feita porque a resposta de frequência em um determinado harmônico (n = 3, por exemplo), depende de três parâmetros (pd,| G*3| p, Φ3), mas apenas duas quantidades independentes(Δƒ3 e ΔΓn ~ ΔDn)são medidos. Devido a essa discrepância, precisamos obter pelo menos uma quantidade adicional (seja a mudança de frequência ou dissipação) de um harmônico adicional sem adicionar um desconhecido adicional ao problema. A espessura e densidade, obviamente, não dependem da freqüência, mas o modulus cisalhamento complexo faz. A abordagem da lei de poder é baseada no fato de que, em uma pequena faixa de frequência, podemos supor que o ângulo de fase é constante, com uma resposta reológica equivalente a um material com um comportamento de lei de poder sobre uma gama muito maior de freqüências15,16,18. O expoente da lei de poder, Λ, não é um parâmetro ajustável, mas é igual a Φ / 90°, com Φ em graus. Com a suposição da lei de poder, 
temos Φ3 = Φ5 e . Para modelagem quantitativa viscoelástica, o modelo de lei de poder representa a melhor combinação de precisão e simplicidade, dando resultados mais confiáveis do que outras abordagens comuns, incluindo o modelo Kelvin-Voigt, onde G' é assumido como independente de n e G" é assumido para aumentar linearmente com n.
Considerando a configuração experimental para os dados pss:pdadma, experimentos em massa e os regimes viscoelásticos foram realizados para gerar os dados na Figura 6. O protocolo detalha a preparação da amostra para os experimentos do regime viscoelástico, com os experimentos em massa sendo realizados olhando para a resposta do sensor a uma solução com a PEC, sal e água presente. A fim de preparar as amostras para os experimentos do regime viscoelástico, é importante entender a faixa de espessura alvo para permanecer dentro do regime viscoelástico e evitar overdamping a resposta do sensor. Para o sistema PSS:PDADMA, esta faixa ideal é de ~0,8 - 1,6 μm. Uma vez que a PEC inicialmente aumenta em espessura em 45-50% quando inchada em água, esse comportamento teve que ser contabilizado nas espessuras iniciais do filme, tornando-se um intervalo alvo para a espessura inicial da amostra de ~0,45 - 0,65 μm. Ter uma boa compreensão de como o filme vai se comportar durante o experimento é importante para a compreensão da melhor faixa de espessura alvo, bem como o melhor método para a preparação da amostra18.
Independentemente da configuração instrumental exata, esses procedimentos demonstram a importância de considerar a preparação da amostra antes de iniciar um experimento QCM. A espessura da camada aplicada determina as informações que podem ser extraídas dos dados medidos. Antes de iniciar qualquer medição, o pesquisador deve considerar quais informações são mais necessárias do experimento e entender as limitações da técnica. Uma compreensão das propriedades viscoelásticas do filme é útil ao determinar a espessura correta da amostra e método de preparação. Para amostras apropriadas, os instrumentos QCM de domínio de tempo e frequência podem ser habilmente usados para coletar dados precisos para uma ampla gama de aplicativos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. e E.S. reconhecem o apoio da NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
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