Summary
Le microbalance de cristal de quartz peut fournir la masse précise et les propriétés viscoélastiques pour des films dans la gamme de micron ou de submicron, qui est pertinent pour des investigations dans la détection biomédicale et environnementale, les revêtements, et la science de polymère. L'épaisseur de l'échantillon influence les informations qui peuvent être obtenues à partir du matériau en contact avec le capteur.
Abstract
Dans cette étude, nous présentons divers exemples de la façon dont la préparation mince du film pour les expériences de microbalance cristal l'indique la modélisation appropriée des données et détermine quelles propriétés du film peuvent être quantifiées. Le microbalance de cristal de quartz offre une plate-forme particulièrement sensible pour mesurer les changements fins dans la masse et/ou les propriétés mécaniques d'un film appliqué en observant les changements dans la résonance mécanique d'un cristal de quartz oscillant à haute fréquence. Les avantages de cette approche comprennent sa polyvalence expérimentale, sa capacité d'étudier les changements de propriétés sur un large éventail de durées expérimentales et l'utilisation de petites tailles d'échantillons. Nous démontrons que, en fonction de l'épaisseur et du modulus de cisaillement de la couche déposée sur le capteur, nous pouvons acquérir différentes informations à partir du matériau. Ici, ce concept est spécifiquement exploité pour afficher des paramètres expérimentaux résultant en des calculs de masse et viscoélastiques de collagène adsorbed sur l'or et les complexes de polyélectrolyte pendant le gonflement en fonction de la concentration de sel.
Introduction
Le microbalance de cristal de quartz (QCM) tire parti de l'effet piézoélectrique d'un cristal de quartz pour surveiller sa fréquence de résonance, qui dépend de la masse adhérée à la surface. La technique compare la fréquence et la bande passante résonnantes d'un capteur de cristal de quartz coupé AT (généralement de l'ordre de 5 MHz)1 dans l'air ou un fluide à la fréquence et à la bande passante du capteur après le dépôt d'un film. Il y a plusieurs avantages à utiliser le QCM pour étudier les propriétés et les interfaces minces de film, y compris la sensibilité élevée à la masse et potentiellement aux changements viscoélastiques de propriété (selon l'uniformité et l'épaisseur d'échantillon), la capacité d'exécuter des études in situ2,et la capacité de sonder une échelle de temps rhéologique beaucoup plus courte que la rhéologie traditionnelle de cisaillement ou l'analyse mécanique dynamique (DMA). Sonder un court laps de temps rhéologique permet d'observer comment la réponse à cette échelle de temps change à la fois sur des durées extrêmement courtes (ms)3 et longues (années)4. Cette capacité est bénéfique pour l'étude d'une variété de processus cinétiques et est également une extension utile des techniques rhéométriques traditionnelles5,6.
La sensibilité élevée du QCM a également conduit à son utilisation intensive dans des applications biologiques étudiant les interactions fondamentales des biomolécules extrêmement petites. Une surface de capteur non couchée ou fonctionnalisée peut être utilisée pour étudier l'adsorption protéique; encore plus loin, la biodétection par des événements de liaison complexes entre les enzymes, les anticorps et les aptamers peut être examinée en fonction des changements de masse7,8,9. Par exemple, la technique a été utilisée pour comprendre la transformation des vésicules en une bicouche lipidique planaire comme un processus en deux phases d'adsorption des vésicules contenant du liquide à une structure rigide en observant les changements de corrélation de la fréquence et la viscoélasticité10. Au cours des dernières années, le QCM a en outre offert une plate-forme robuste pour surveiller l'administration de médicaments par vésicules ou nanoparticules11. À l'intersection de l'ingénierie des matériaux et de la biologie moléculaire et cellulaire, nous pouvons utiliser le QCM pour élucider les interactions clés entre les matériaux et les composants bioactifs comme les protéines, les acides nucléiques, les liposomes et les cellules. Par exemple, l'adsorption protéique à un biomatériau sert de médiateur aux réponses cellulaires en aval comme l'inflammation et est souvent utilisée comme indicateur positif de biocompatibilité, tandis que dans d'autres cas, l'attachement extracellulaire des protéines aux revêtements qui interagissent avec le sang pourrait induire une coagulation dangereuse dans les vaisseaux12,13. Le QCM peut donc être utilisé comme un outil pour sélectionner les candidats optimaux pour différents besoins.
Deux approches communes pour l'exécution d'expériences QCM recueillent des données analogues de l'expérience : la première approche enregistre le décalage de fréquence et la demi-bande passante() du pic de conductance. La deuxième approche, qcM avec dissipation (QCM-D), enregistre le décalage de fréquence et le facteur de dissipation, qui est directement proportionnel à l'équation 1,14
(1)
où D est le facteur de dissipation et la fréquence est la fréquence. Les deux D et Les ' sont liés à l'effet d'amortissement du film sur le capteur, ce qui donne une indication de la rigidité du film. Le sous-scripte n désigne la fréquence de tonalité ou d'harmonique, qui sont les fréquences de résonance impaires du capteur de quartz (n ' 1, 3, 5, 7...). D'autres discussions sur les modèles utilisant plusieurs harmoniques pour obtenir la masse et les propriétés viscoélastiques d'un film peuvent être trouvées dans une critique par Johannsmann14 et les documents précédents du groupe Shull15,16,17,18.
Une considération clé pour la préparation des échantillons de QCM est de savoir comment appliquer le film mince sur la surface du capteur. Certaines méthodes courantes incluent le revêtement de spin, revêtement de trempette, revêtement de chute, ou adsorption du film sur la surface du capteur au cours de l'expérience19,20. Il y a quatre régions pour les échantillons de QCM : la limite de Sauerbrey, le régime viscoélastique, le régime en vrac, et le régime surdalé. Pour les films suffisamment minces, la limite Sauerbrey s'applique, où le décalage de fréquence(en)fournit la densité de masse de surface du film. Dans la limite de Sauerbrey, les échelles de décalage de fréquence linéairement avec l'harmonique résonnante, n, et les changements dans le facteur d'amortissement (D ou )sont généralement petits. Dans ce régime, il n'y a pas suffisamment d'information disponible pour déterminer uniquement les propriétés rhéologiques de la couche sans faire d'hypothèses supplémentaires. Les données de ce régime sont utilisées pour calculer la densité de masse de surface (ou l'épaisseur si la densité est connue a priori) du film. Dans le régime en vrac où le milieu en contact avec le cristal est suffisamment épais, l'onde de cisaillement évanescente se propage dans le milieu avant d'être complètement amortie. Ici, aucune information de masse ne peut être obtenue à l'aide de l'adresse '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Cependant, dans cette région, les propriétés viscoélastiques sont déterminées de façon fiable à l'aide de la combinaison de 15euros et de15euros. Dans le régime en vrac, si le support est trop rigide, le film amortira la résonance du capteur, empêchant la collecte de données fiables de la QCM. Le régime viscoélastique est le régime intermédiaire où le film est assez mince pour que l'onde de cisaillement se propage complètement à travers le film ainsi que des valeurs fiables pour le facteur d'amortissement. Le facteur d'amortissement etle facteur d'amortissement et le facteur d'amortissement peuvent ensuite être utilisés pour déterminer les propriétés viscoélastiques du film ainsi que sa masse. Ici, les propriétés viscoélastiques sont données par le produit de la densité et de l'ampleur du modulus complexe de cisaillement. G. p et l'angle de phase donné par 'arctan' (G" / G'). Lorsque les films sont préparés dans la limite de Sauerbrey, la masse par unité de surface peut être calculée directement sur la base de l'équation de Sauerbrey montrée ci-dessous21,
(2)
où lenest le changement de la fréquence de résonance, n est la tonalité d'intérêt,n 1 est la fréquence de résonance du capteur, m / A est la masse par zone du film, et Zq est l'impedance acoustique du quartz, qui pour AT quartz coupé est Zq 8,84 x 106kg / m2s. Le régime viscoélastique est le plus approprié pour l'étude des films polymères, et la limite en vrac est utile pour étudier le polymère visqueux22 ou les solutions protéiques16. Les différents régimes dépendent des propriétés du matériau d'intérêt, avec l'épaisseur optimale pour la caractérisation viscoélastique complète et de masse augmentant généralement avec la rigidité du film. La figure 1 décrit les quatre régions en ce qui concerne la densité aréale du film, le modulus complexe de cisaillement, et l'angle de phase, où nous avons supposé une relation spécifique entre l'angle de phase et la rigidité du film qui s'est avéré pertinent pour les matériaux de ce type. Beaucoup de films d'intérêt pratique sont trop épais pour étudier les propriétés viscoélastiques avec QCM, comme certains biofilms, où les épaisseurs sont de l'ordre de dizaines à des centaines de microns23. Ces films épais ne sont généralement pas appropriés pour l'étude à l'aide de la QCM, mais peuvent être mesurés à l'aide de résonateurs à basse fréquence (tels que les résonateurs de torsion)23, permettant à l'onde de cisaillement de se propager plus loin dans le film.
Pour déterminer quel régime est pertinent pour un échantillon qcM donné, il est important de comprendre le paramètre d /n, qui est le rapport de l'épaisseur du film (d) à la longueur d'onde de cisaillement de l'oscillation mécanique du capteur de cristal de quartz(n)15,16,18. Le régime viscoélastique idéal est d /n - 0,05 - 0,218, où les valeurs inférieures à 0,05 sont dans la limite de Sauerbrey et les valeurs supérieures à 0,2 approche nt le régime en vrac. Une description plus rigoureuse de d /n est fournie ailleurs15,18, mais il s'agit d'un paramètre quantitatif délimitant la limite Sauerbrey et la limite viscoélastique. Les programmes d'analyse utilisés ci-dessous fournissent ce paramètre directement.
Il y a quelques limites supplémentaires à l'analyse des films minces avec le QCM. Les calculs Sauerbrey et viscoélastique supposent que le film est homogène à la fois tout au long de l'épaisseur du film et latéralement à travers la surface de l'électrode de la QCM. Bien que cette hypothèse rend difficile l'étude des films qui ont des vides ou des charges présentes, il ya eu quelques enquêtes QCM dans les films composés de nanoparticules greffées6. Si les hétérogénéités sont faibles par rapport à l'épaisseur globale du film, des propriétés viscoélastiques fiables du système composite peuvent encore être obtenues. Pour les systèmes plus hétérogènes, les valeurs obtenues à partir d'une analyse viscoélastique doivent toujours être considérées avec une grande prudence. Idéalement, les résultats obtenus à partir de systèmes avec une hétérogénéité inconnue devraient être validés contre des systèmes qui sont connus pour être homogènes. C'est l'approche que nous avons adoptée dans le système d'exemple décrit dans le présent document.
Un point important que nous éclairons dans cet article est la correspondance exacte entre les mesures DE QCM effectuées dans le domaine de la fréquence (où est rapporté) et les expériences de domaine temporel (où D est signalé). Les résultats de deux expériences QCM différentes, un domaine temporel et un domaine de fréquence, sont décrits, chacun impliquant un système modèle différent mais conceptuellement lié. Le premier système est un exemple simple d'attachement au collagène au capteur pour illustrer la cinétique de liaison représentative et l'équilibre de l'adsorption au fil du temps au cours d'une mesure de domaine temporel (QCM-D). Le collagène est la protéine la plus abondante dans le corps, connue pour sa polyvalence des comportements de liaison et de morphologie. La solution de collagène utilisée ici ne nécessite pas de fonctionnalisation supplémentaire de la surface d'or du capteur pour induire l'adsorption9. Le deuxième système expérimental est un complexe de polyélectrolytes (PEC) composé de sulfonate de polystyrène anionique (PSS) et de poly cationique (diallyldimethylammonium) (PDADMA) préparé de la même manière que Sadman et al.22. Ces matériaux gonflent et deviennent mous dans le sel (KBr dans ce cas) solutions, offrant une plate-forme simple pour étudier la mécanique des polymères en utilisant une approche de domaine de fréquence (QCM-Z). Pour chaque protocole, le processus de préparation, de prise et d'analyse d'une mesure est indiqué à la figure 2. Le schéma montre que la principale différence entre les approches QCM-Z et QCM-D réside dans l'étape de collecte de données et l'instrumentation utilisée dans l'expérience. Toutes les techniques de préparation d'échantillons mentionnées sont compatibles avec les deux approches, et chaque approche peut analyser des échantillons dans les trois régions représentées à la figure 1.
Nos données démontrent que la préparation d'échantillons, que ce soit par revêtement de capteur avant ou pendant une mesure, dicte la capacité d'extraire les propriétés viscoélastiques d'un système. En concevant les premières étapes d'une expérience de manière appropriée, nous pouvons déterminer quelles informations nous pouvons recueillir avec précision au cours de l'étape d'analyse.
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Protocol
Adsorption de collagène DE QCM-D
1. Préparation de l'échantillon et pré-nettoyage du capteur
- Préparer 20 ml de tampon d'acétate de 0,1 M, en ajustant le pH avec HCl et NaOH au besoin pour atteindre le pH 5,6.
- Ajouter la solution de collagène de queue de rat à la 20 ml de tampon d'acétate dans des conditions stériles à une concentration finale de 10 g/mL.
- Nettoyer le capteur de quartz enduit d'or pour enlever le matériel organique et biologique25,26.
- Placez le capteur côté actif vers le haut dans une chambre UV/Ozone et traitez la surface pendant environ 10 min.
- Chauffer un mélange de 5:1:1 d'eau déionisée (dH2O), d'ammoniac (25%) peroxyde d'hydrogène (30%) à 75 oC. Placez le capteur dans la solution pendant 5 min.
- Rincer le capteur avec dH2O et sécher avec un jet de gaz azoté.
- Placez le capteur côté actif vers le haut dans une chambre UV/Ozone et traitez la surface pendant 10 min.
REMARQUE : La procédure de nettoyage doit être immédiatement effectuée avant une mesure afin de minimiser la contamination de l'environnement à la surface du capteur.
2. Acquisition de données de mesure QCM-D
- Activez tout l'équipement nécessaire pour prendre une mesure, y compris la pompe, l'unité électronique et le logiciel informatique.
- Retirez le module d'écoulement de la plate-forme de la chambre et dévisser les grandes vis de pouce pour ouvrir le module.
- Si le capteur a été laissé de côté après le nettoyage initial (étapes 1.3.1-1.3.4), rincez le capteur avec de l'eau déionisée (dH2O) et séchez avec un jet de gaz azoté pour s'assurer qu'il n'y a pas de contaminants à la surface.
- Montez le capteur dans le module d'écoulement sur l'anneau O exposé, en séchant d'abord la zone avec un jet de gaz azoté et en vérifiant que l'anneau O est couché à plat. Le capteur doit être placé avec le côté de surface actif vers le bas et l'électrode en forme d'ancre orientée vers le marqueur dans le module d'écoulement.
- Tournez les vis du pouce pour sceller le module d'écoulement et remplacez-le sur la plate-forme de la chambre. Fixez tout tube de pompe PTFE nécessaire au module d'écoulement et à la pompe externe.
- À l'aide du logiciel informatique approprié, définir la température du module d'écoulement à 37 oC. Surveillez la température changeante pendant 10-15 min pour s'assurer qu'elle équilibre à la valeur désirée.
- Trouvez les fréquences de résonance initiales du capteur. Si aucune fréquence de résonance n'est trouvée par le logiciel, vérifiez que le module de débit est correctement positionné sur la plate-forme de la chambre ou re-montez le capteur dans le module de débit pour s'assurer qu'il est centré et qu'il fait un contact électrique approprié.
- Placez le tube de pompe d'insee dans la solution saline aphatée 1x tamponnée par le phosphate (PBS). Démarrez le débit externe de la pompe à 25 l/min et inspectez visuellement le tube pour vous assurer que le liquide circule dans le tube.
REMARQUE : Le débit des fluides peut être plus facile à voir en augmentant momentanément le débit de fluide à 100 l/min ou plus. Si le liquide ne semble pas se déplacer à travers le tube, il est très probable que les deux parties du module d'écoulement ne créent pas un joint approprié. Essayez de serrer les vis du pouce, de serrer les connecteurs de la tubulure à l'insee et à la sortie, ou de remontage du capteur pour être sûr que l'anneau O est plat et centré. - Laisser le flux fluide du 1x PBS à travers le module de débit pendant au moins 15 min pour bien réquilibrer.
- Démarrer la mesure dans le logiciel informatique pour commencer l'acquisition de données. Surveillez les valeurs de fréquence et de dissipation pendant au moins 5 minutes afin d'assurer une ligne de base stable.
- Arrêtez la pompe et déplacez le tube d'entrée vers la solution tampon collagène-acétate, et reprenez le flux de fluide. Notez l'heure de cet événement pour une analyse ultérieure.
- Laissez les nouvelles valeurs de fréquence et de dissipation s'équilibrer à une valeur stable. Ici, nous nous attendons à ce que cette stabilisation se produise après 8-12 h.
- Arrêtez la pompe, déplacez le tube d'entrée vers la solution 1x PBS et reprenez le flux de fluide. Notez l'heure de cet événement pour une analyse ultérieure.
- Laissez les nouvelles valeurs de fréquence et de dissipation s'équilibrer à une valeur stable. Ici, cette stabilisation se produit après 30 min.
REMARQUE : Les étapes 2.13 et 2.14 peuvent être répétées pour chaque nouvelle période de flux de fluide dans des expériences plus rigoureuses avec un plus grand nombre d'étapes. - Mettre fin à l'acquisition de données de la mesure et enregistrer les données.
- Nettoyer et démonter l'équipement QCM.
- Augmentez le débit de fluide de la pompe externe à 500 l/min ou plus et placez le tube d'entrée dans une solution de 2 % de solution de nettoyage Hellmanex pendant au moins 20 min.
REMARQUE : Pour d'autres expériences, si une analyse plus approfondie du capteur est souhaitée, retirez le capteur avant l'étape 2.16.1 et placez un autre capteur de nettoyage dans le module. - Arrêtez la pompe et déplacez le tube d'entrée à dH2O, et reprendre le flux de fluide pour rincer davantage le système pendant au moins 20 min.
- Arrêtez le flux de fluide et retirez le capteur du module d'écoulement. Séchez le capteur et l'intérieur du module d'écoulement avec un flux de gaz azoté. Éteignez le logiciel informatique, l'unité électronique et la pompe péristétique.
REMARQUE : Les capteurs enduits d'or peuvent être nettoyés correctement, comme détaillé dans les étapes 1.3.1-1.3.4, et réutilisés pour plusieurs mesures. Les indications qu'un capteur ne peut plus être réutilisé pour des mesures fiables peuvent inclure, mais ne sont pas limités à une grande variabilité des fréquences de résonance initiales et des dérives significatives dans les mesures de base avec le débit tampon. Les données peuvent être ouvertes et analysées dans le logiciel préféré, y compris ceux fournis par les entreprises qui se spécialisent dans l'équipement QCM-D.
- Augmentez le débit de fluide de la pompe externe à 500 l/min ou plus et placez le tube d'entrée dans une solution de 2 % de solution de nettoyage Hellmanex pendant au moins 20 min.
Enflure du complexe de polyélectrolytes de QCM
3. Préparation de l'échantillon
REMARQUE : Cette expérience a été réalisée à l'aide d'un programme MATLAB développé au sein du groupe de recherche Shull pour la collecte et l'analyse de données.
- Tout d'abord, placez un capteur de cristal de quartz nu dans un support d'échantillon connecté à l'analyseur de réseau vectoriel et à l'ordinateur. Allumez l'analyseur pour appliquer une tension oscillante au capteur, et de recueillir un spectre de conductance de référence pour le capteur dans l'air.
- Immerger le porte-échantillon dans un bécher sans lèvres de 100 ml rempli d'eau distillée et recueillir un spectre de conductance de référence pour le capteur nu dans l'eau.
- Préparer une solution de 0,5 M de bromure de potassium (KBr).
- Dissoudre 1,79 g de KBr dans 30 ml d'eau distillée. Agiter jusqu'à dissolution.
- Insérez une petite plaquette de silicium dans la solution KBr à un angle pour créer une diapositive pour le capteur de quartz pendant l'étape d'annealing pour empêcher le film de sortir du capteur.
- Préparer le capteur pour le revêtement de spin.
- Définiz les paramètres du spin coat à 10 000 tr/min, 8 000 accélérations et 5 s.
- Insérez le capteur sur le coucheur de spin et allumez le vide.
- Couvrez la surface du capteur avec de l'éthanol et exécutez le porte-couches pour nettoyer la surface du capteur.
- Ajouter le PEC (PSS:PDADMA préparé de la même manière que détaillé dans Sadman et al. 22) à la surface du capteur.
- Si le complexe est en deux phases (polymère riche et polymère pauvre), insérez lentement le tuyau dans la solution. Évacuez la tuyauterie en soufflant des bulles tout en déplaçant la tuyauterie dans la phase plus dense riche en polymères.
- Après avoir libéré quelques bulles dans la phase riche en polymères, élaborer 0,5-0,75 ml de la solution riche en polymères dans le pipet. Maintenir la pression sur l'ampoule de pipet pour ne pas permettre à la phase pauvre de polymère d'entrer dans le pipet, tirer le pipet hors de la solution.
- Essuyez l'extérieur de la pipet à l'aide d'un Kimwipe. Ajoutez suffisamment de solution dans le sens de la goutte sur la surface du capteur de quartz pour couvrir complètement la surface. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles visibles dans la solution sur la surface du capteur.
- Enrobez l'échantillon PEC et submergez immédiatement le capteur dans la solution 0,5 M KBr pour éviter la cristallisation du sel sur le film.
REMARQUE : Cette étape est parfois difficile à coordonner. Relâchez le capteur juste au-dessus de la solution KBr pour de meilleurs résultats. - Laisser le film annexer pendant au moins 12 h.
REMARQUE : Pour faciliter l'exécution de l'expérience, préparez l'étape 4 le soir et laissez le film s'enliquer toute la nuit.
4. Mesure du film dans l'air et l'eau
- Transférer le capteur dans un bécher rempli d'eau distillée pour retirer l'excès de KBr du film et du côté arrière du capteur. Laissez le capteur dans la solution pendant 30-60 min.
- Prenez une mesure du film dans l'air. Référence au capteur nu dans l'air. Permettre aux données du film d'être alquissés.
- Insérez du sulfate de calcium séché dans un bécher sans lèvres de 100 ml et mesurez l'épaisseur du film complètement sec. Retirer le sulfate de calcium du bécher et rincer le bécher à l'eau distillée.
- Remplir le bécher sans lèvres de 100 ml avec 30 ml d'eau distillée. Insérez une barre d'agitation pour vous assurer que l'eau circule autour du film. Mesurer le film dans l'eau pendant environ 30-45 min ou jusqu'à ce que les données du film soient libés. Référence au capteur nu dans l'eau.
- Préparer une solution de 15 ml de 3 M KBr dans de l'eau distillée. Mesurer 5,35 g de KBr dans un cylindre gradué et remplir à 15 ml d'eau distillée. Tourbillonner jusqu'à dissolution.
- Ajouter la solution KBr au bécher avec de l'eau distillée par incréments de 0,1 M. Le tableau 1 décrit les incréments de 0,1 M en mL de 3 M KBr solution. Affrontez le film loin de l'endroit où la solution KBr est ajoutée à l'eau afin que le film ne se dissolve pas. Assurez-vous que le système a réquilibé avant d'ajouter un autre ajout de la solution KBr.
- Une fois que toutes les données ont été acquises, retirez le film du support et placez-le dans un bécher d'eau distillée. Laisser le sel quitter le film (30-60 min) et sécher le film à l'air.
- Pour nettoyer le film PEC du capteur, ajouter KBr au bécher et faire tourbillonner doucement la solution. Laisser reposer de 5 à 10 min. Répétez ce processus 2 à 3 fois, puis rincez le capteur avec de l'eau distillée.
REMARQUE : Le capteur peut être nettoyé et réutilisé si la réponse du capteur est toujours bonne. Cela peut être vérifié par le capteur ayant de petites lectures de bande passante absolue pour les harmoniques d'intérêt (lt;100 Hz).
5. Analyse des données
- Ouvrez l'analyse de données QCM-D MATLAB GUI créée par Sadman (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Ouvrez le film dans le fichier de données d'air en sélectionnant « Charger QCM ».
REMARQUE : Le groupe Shull a développé une interface graphique Python similaire pour la collecte et l'analyse de données pour QCM(https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Une partie du code d'analyse est fournie dans les informations supplémentaires pour analyser les données et générer les chiffres dans ce document. - Sélectionnez le calcul souhaité (soit 3,5,3 ou 3,5,5), gamma, et le film dans les icônes de l'air. Cliquez sur Terrain QCM.
- Déterminez l'épaisseur du film sec à l'aide du point de données le plus équilibrant (généralement le dernier point de données) de l'expérience. Enregistrez cette valeur.
- Ouvrez le film dans le fichier de données sur l'eau. Sélectionnez les mêmes paramètres que dans l'étape 5.2, à l'exception du film dans l'eau au lieu du film dans l'air.
- Après chaque étape d'équilibre de l'expérience de gonflement, déterminez l'épaisseur du film, le modulus complexe de cisaillement et l'angle de phase viscoélastique. Enregistrez ces valeurs avec la force ionique (allant de 0-1 M par incréments de 0,1 M).
- Déterminer le pourcentage d'enflure
(3)
où dp est l'épaisseur du film de la solution et dpsec est l'épaisseur du film sec.
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les changements de fréquence avec le temps pendant l'adsorption protéique présentent une courbe et un plateau caractéristiques montrés dans la figure 3A-B. Le lavage tampon initial de 1x PBS à travers la surface du capteur nu n'induit que des changements négligeables de fréquence, offrant une base de référence stable pour agir comme une référence pour les points de données futurs. L'introduction de la solution de collagène provoque l'adsorption protéique de commencer, observée comme une diminution constante de la fréquence au fil du temps, jusqu'à ce que la densité des plateaux de collagène adhérents à une ligne de base stable (Figure 3A). La fréquence exacte et les valeurs de masse dépendront fortement de la pureté et de l'énergie de surface du capteur. Compte tenu de ces paramètres, le lavage tampon final élimine seulement une petite quantité de protéines non respectées de la surface du capteur, ce qui entraîne une légère augmentation de la fréquence. Nous ne devrions toujours nous attendre qu'à une légère diminution de la masse au cours de cette période, démontrant une quantité stable de protéines liées au capteur (Figure 3B).
On ne saurait trop insister sur l'importance d'atteindre une mesure de fréquence stable pour chaque période. De légères fluctuations des variables environnementales comme la température, l'humidité et la concentration des solutions peuvent entraîner des différences observables dans les données brutes. Par conséquent, la modification de ces variables avant au moins 5-10 minutes de fréquence stable et les mesures des facteurs de dissipation peut dénaturer les changements exacts de fréquence et de dissipation. Un exemple de jeu de données sous-optimal est affiché dans la figure 3C-D. Ici, les mêmes paramètres de concentration de solution et de débit sont utilisés comme Figure A-B, mais l'environnement de l'instrument n'a pas été autorisé à l'équilibre avant de commencer la mesure. Le tassement naturel de la fréquence oscillante du capteur se produit en même temps qu'une température changeante et une concentration de fluide, dissimulant toute ligne de base potentielle qui servira de référence (figure 3C). Nous sommes plutôt obligés de choisir une moyenne de l'ensemble de la plage de fréquencedynamique dans la période pour agir comme une référence. Enfin, le flux de collagène n'est pas autorisé à l'équilibre à une masse stable avant de commencer le lavage FINAL DE PBS, comme le voit les changements de fréquence encore changeants juste avant que le PBS entre dans le système. Cette action n'a pas d'impact sur les calculs de masse mais ne caractérise pas entièrement le potentiel adsorptif de la protéine sur le capteur (Figure 3D).
Pendant les premiers stades de l'expérience d'adsorption de collagène, le film est dans le régime de Sauerbrey, indiqué par des valeurs de '' '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Au fur et à mesure que l'expérience progresse, le film se déplace dans le régime viscoélastique, indiqué par des valeurs de '/nqui ne se chevauchent plus (t 'gt; 2.5 h). Reconnaissant ce changement de comportement, les données obtenues à partir de l'expérience de collagène ont été analysées pour examiner la masse aréale et les propriétés viscoélastiques en utilisant deux méthodes différentes. Le premier utilise un script Python compilé par le groupe Shull. Ce script a les mêmes fondements mathématiques que le logiciel de collecte et d'analyse de données MATLAB utilisé pour l'expérience PEC. Il utilise un modèle de droit du pouvoir pour tenir compte des différences de propriété aux harmoniques adjacentes15 et est fourni dans l'information supplémentaire. La deuxième méthode utilise des valeurs déterminées à partir d'un modèle viscoélastique dans un logiciel commercial pour calculer la masse arépéenne, le modulus complexe de cisaillement et l'angle de phase du film de collagène. Le modèle viscoélastique de ce logiciel rapporte l'épaisseur (d), le modulus élastique et la viscosité. Le modulus élastique et la viscosité sont les éléments d'un modèle Kelvin-Voigt, et sont convertis à l'ampleur et la phase du modulus complexe par les expressions suivantes:
(4)
(5)
oùle capteurde quartz (5 MHz)est la fréquence fondamentale du capteur de quartz. La figure 4 montre les propriétés viscoélastiques déterminées pour l'adsorption de collagène calculée à partir des valeurs de net de Ddes troisième et cinquième harmoniques. La figure 5 compare les propriétés de la figure 4 avec les propriétés converties à partir des résultats du logiciel commercial. Comme on peut le voir dans la figure 5, les valeurs logicielles commerciales rapportent que le film est plus doux que le script Python.
La figure 6 décrit une relation qui a été observée dans les expériences précédentes de QCM3,22 montrant une relation linéaire entre l'angle de phase viscoélastique et le logarithme de l'ampleur du modulus complexe de cisaillement. La ligne verte indique cette relation linéaire, ayant des points d'arrivée d'un fluide newtonien tel que l'eau G. p 105Pa , g/cm3 et 90 degrés à3 x 15 mHz)et un polymère élastique solide ou vitreux (en anglais) G. p 109Pa , g/cm3 et 0 euros). De nombreux matériaux polymères étudiés à l'aide du QCM suivent cette tendance empirique générale, qui a été quantifiée à l'aide du système complexe PSS:PDADMA22. Comme le PEC est soumis à des solutions avec des concentrations de sel plus élevées, l'échantillon passe d'un échantillon rigide et vitreux à être plus visqueux et fluide comme; ce spectre de propriétés tombe sur la ligne verte. À des fins de comparaison, les propriétés calculées à l'aide du script Python pour le film de collagène hydroversé sont également tracées dans la figure 6. La relation entre les G. on s'attend à ce que les deux systèmes soient les mêmes pour les deux systèmes, étant donné que les deux systèmes sont des polymères vitreux gonflés d'eau. La teneur en eau du film détermine le point spécifique le long de la courbe. Ici, le système PEC avec des propriétés mécaniques les plus proches du système de collagène correspond à une solution de 20 wt% polymère. Nous déduisons de cette comparaison que la concentration de polymère dans le film de collagène adsorbed est également proche de 20 wt.%. Ce résultat est très utile, obtenu dans notre cas par la comparaison des résultats obtenus à partir de deux expériences QCM bien conçues. L'une de ces expériences était une expérience de domaine temporel (QCM-D, collagène) et l'autre était une expérience de domaine de fréquence (QCM-Z, PEC), mais ces types d'expériences sont complètement interchangeables, avec l'un ou l'autre protocole suffisant dans les deux cas.
Figure 1 : Terrain des régimes Sauerbrey, viscoélastique, en vrac et surdalés. L'intrigue montre des régimes où différents types d'informations peuvent être obtenus à partir de données QCM, en fonction de la masse aréale de l'échantillon (liée à l'épaisseur) et des propriétés viscoélastiques. Au-dessous de la ligne bleue se trouve le régime de Sauerbrey, où seule l'épaisseur de l'échantillon est calculée. Pour la région moyenne, les propriétés de masse et de viscoélastique de l'échantillon peuvent être calculées. Dans le régime en vrac en haut à gauche de la parcelle, des informations viscoélastiques peuvent être obtenues, mais les expériences ne sont plus sensibles à l'épaisseur de l'échantillon. En haut à droite, le régime surdalé indique que l'échantillon est trop épais pour qu'une mesure QCM soit effectuée. Dans l'intrigue, une relation linéaire est supposée entre l'angle de phase viscoélastique à la troisième harmonique et le journal de l'ampleur du modulus complexe de cisaillement (ligne verte à la figure 6). Le régime en vrac est défini comme la région où l'épaisseur est plus de deux fois la longueur de décomposition de l'onde de cisaillement. Le régime de Sauerbrey est défini comme la région oùle régime de Sauerbrey est défini comme étant la région où le régime de Sauerbrey est inférieur à 20 000 Hz(D5 et 1600 ppm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Diagramme de flux des étapes principales d'une mesure QCM. Schéma d'une expérience QCM-Z ou QCM-D. Le diagramme dans la première étape est un capteur QCM (gris) avec les électrodes d'or (or) et le film sur le dessus du capteur (violet), avec les différentes techniques utilisées pour appliquer un film à la surface du capteur. L'épaisseur du film, d, est indiquée. La deuxième étape met en évidence les données des protocoles expérimentaux QCM-Z (en haut) et QCM-D (en bas). La troisième étape consiste à déterminer la région où l'échantillon peut être analysé. La quatrième étape montre les données résultantes de la région d'analyse donnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : « Bonnes » et « mauvaises » données QCM-D pour l'adsorption de collagène. Parcelles de la fréquence et des facteurs d'amortissement pour l'expérience d'adsorption de collagène. (A) Changements de fréquences equilibées, (B) Changements de facteurs d'amortissement equilibrated, (C) Changements de fréquence non-équilibrisés et (D) Changements de facteur d'amortissement non équilibrants. Dans (B) et (D), le décalage du facteur d'amortissement est tracé comme le facteur de dissipation, D, et la bande passante, , puisque le même paramètre est mesuré par les deux décalages. La fréquence et les changements gamma sont normalisés à leurs harmoniques respectives(n ' 3 ou 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse viscoélastique du collagène à l'aide d'un modèle de droit du pouvoir. La masse aréale (A), le modulus complexe de cisaillement (B) et l'angle de phase viscoélastique (C) pour l'expérience d'adsorption de collagène. Les 10 premiers h montrent l'étape principale d'adsorption du collagène à la surface du capteur, avec la période entre 10 et 20 montrant l'étape d'équilibre avant le lavage tampon effectué à 20 h. Les barres d'erreur représentent des incertitudes dans les calculs pour l'épaisseur et les propriétés viscoélastiques, en supposant une erreur dans 'et ' égal à 1% de '. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse viscoélastique du collagène à l'aide d'un modèle de droit du pouvoir et d'un modèle de logiciel commercial. La masse aréale (A), le modulus complexe de cisaillement (B) et l'angle de phase viscoélastique (C) pour l'expérience d'adsorption de collagène. Les valeurs de l'aétée sont déterminées avec l'écriture Python à l'aide des valeurs de 'et D à partir des données expérimentales tandis que les valeurs D sont converties à partir des résultats du modèle viscoélastique du logiciel commercial. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Parcelle modifiée de Van Gurp-Palmen du collagène et des données PSS:PDADMA. Une parcelle de l'angle de phase viscoélastique et le modulus complexe de cisaillement au-dessus de la gamme générale des échantillons mesurables utilisant QCM. La ligne verte indique la relation linéaire entre les deux propriétés qui a été supposée dans l'élaboration de la figure 1. Les données du complexe de polyélectrolytes PSS:PDADMA (PEC) sont réimprimées avec la permission de Sadman et al. 22, copyright 2017 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Molarité de solution (M) | mL de 3 M KBr |
| 0.1 | 1 |
| 0.2 | 1.1 |
| 0.3 | 1.2 |
| 0.4 | 1.3 |
| 0.5 | 1.4 |
| 0.6 | 1.5 |
| 0.7 | 1.6 |
| 0.8 | 1.8 |
| 0.9 | 1.9 |
| 1 | 2 |
Tableau 1 : Incréments de Molar pour l'expérience de gonflement de PEC. La quantité (en mL) de 3 M de bromure de potassium solution nécessaire pour augmenter la molarité de la solution d'eau de 0,1 M pour l'expérience de gonflement.
Fichiers supplémentaires: Code Python. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les résultats d'adsorption de collagène couvrent les régimes sauerbrey et viscoélastique. En traçant les décalages de fréquence normalisés au nombre harmonique correspondant, nous observons que la limite de Sauerbrey est vraie pour environ les 2 premières heures de la mesure. Avec l'augmentation de la masse adhérant au capteur, cependant, les changements de fréquence normalisés pour les troisième et cinquième harmoniques commencent à s'écarter les uns des autres(t 'gt; 2 h), indiquant une capacité à déterminer les propriétés viscoélastiques du film adsorbed.
Une comparaison directe entre les résultats de modélisation viscoélastique du logiciel et la modélisation de la loi de puissance du groupe Shull indiquent une différence notable dans les propriétés matérielles calculées. Au cours de la mesure, les données modélisées viscoélastiques provenant de logiciels commerciaux représentaient une couche plus épaisse et plus douce avec un modulus de cisaillement complexe inférieur(figure 5). Les différences dans les propriétés viscoélastiques entre ces modèles sont dues aux hypothèses faites dans les calculs pour chaque système. Une différence concerne une hypothèse qui doit être faite au sujet de la dépendance de fréquence des propriétés viscoélastiques. Une hypothèse doit être faite parce que la réponse de fréquence à une harmonique donnée (n ' 3, par exemple), dépend de trois paramètres (pd, G3 p,3euros ), mais seulement deux quantités indépendantes sontmesurées. En raison de cet écart, nous devons obtenir au moins une quantité supplémentaire (soit le décalage de fréquence ou la dissipation) à partir d'une harmonique supplémentaire sans ajouter une inconnue supplémentaire au problème. L'épaisseur et la densité ne dépendent évidemment pas de la fréquence, mais le modulus complexe de cisaillement ne. L'approche de droit du pouvoir est basée sur le fait que sur une petite plage de fréquences, nous pouvons supposer que l'angle de phase est constant, avec une réponse rhéologique équivalente à un matériau avec un comportement de droit du pouvoir sur une gamme beaucoup plus large de fréquences15,16,18. L'exposant de la loi de puissance, n'est pas un paramètre réglable, mais est égal à 90 degrés, avec des degrés. Avec l'hypothèse de la loi sur 
le pouvoir, nous avons3 euros et5 et 5 . Pour la modélisation viscoélastique quantitative, le modèle de droit du pouvoir représente la meilleure combinaison de précision et de simplicité, donnant des résultats plus fiables que d'autres approches communes, y compris le modèle Kelvin-Voigt, où G' est supposé être indépendant de n et G" est supposé augmenter linéairement avec n.
Compte tenu de la configuration expérimentale pour les données PSS:PDADMA, des expériences en vrac et les régimes viscoélastiques ont été effectuées pour générer les données dans la figure 6. Le protocole détaille la préparation de l'échantillon pour les expériences de régime viscoélastique, avec les expériences en vrac étant effectuées en regardant la réponse du capteur à une solution avec le PEC, le sel et l'eau présents. Afin de préparer les échantillons pour les expériences de régime viscoélastique, il est important de comprendre la plage d'épaisseur cible pour rester dans le régime viscoélastique et d'éviter de suramortissement de la réponse du capteur. Pour le système PSS:PDADMA, cette plage idéale est de 0,8 à 1,6 m. Étant donné que le PEC augmente initialement en épaisseur de 45-50% lorsqu'il est gonflé dans l'eau, ce comportement a dû être pris en compte dans les épaisseurs de film initiales, ce qui fait une plage cible pour l'épaisseur initiale de l'échantillon de 0,45 à 0,65 m. Avoir une bonne compréhension de la façon dont le film se comportera au cours de l'expérience est important pour comprendre la meilleure plage d'épaisseur cible ainsi que la meilleure méthode pour la préparation de l'échantillon18.
Indépendamment de la configuration instrumentale exacte, ces procédures démontrent l'importance d'examiner la préparation d'échantillon avant de commencer une expérience de QCM. L'épaisseur de la couche appliquée détermine les informations qui peuvent être extraites des données mesurées. Avant de commencer toute mesure, le chercheur doit examiner l'information la plus nécessaire de l'expérience et comprendre les limites de la technique. Une compréhension des propriétés viscoélastiques du film est utile lors de la détermination de l'épaisseur de l'échantillon correct et la méthode de préparation. Pour les échantillons appropriés, les instruments QCM du domaine temporel et du domaine de fréquence peuvent être utilisés de manière experte pour recueillir des données précises pour un large éventail d'applications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le FNS (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. et E.S. reconnaissent le soutien du FNS (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
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