Summary
Kvarts krystal mikrobalance kan give nøjagtige masse og viskoelastiske egenskaber for film i micron eller submikron Range, som er relevant for undersøgelser i biomedicinsk og miljømæssig sensing, belægninger, og polymer videnskab. Prøve tykkelsen påvirker, hvilke oplysninger der kan fås fra det materiale, som er i kontakt med sensoren.
Abstract
I denne undersøgelse præsenterer vi forskellige eksempler på, hvordan tynd film forberedelse til kvarts krystal mikrobalance eksperimenter informerer den relevante modellering af dataene og afgør, hvilke egenskaber af filmen kan kvantificeres. Quartz Crystal Micro balance tilbyder en unikt følsom platform til måling af fine ændringer i masse og/eller mekaniske egenskaber af en anvendt film ved at observere ændringer i mekanisk resonans af en kvarts krystal oscere ved høj frekvens. Fordelene ved denne fremgangsmåde omfatter dens eksperimentelle alsidighed, evne til at studere ændringer i egenskaber over en bred vifte af eksperimentelle tids længder, og brugen af små prøvestørrelser. Vi viser, at baseret på tykkelsen og forskydnings modulus af laget deponeret på sensoren, kan vi erhverve forskellige oplysninger fra materialet. Her er dette koncept specifikt udnyttes til at vise eksperimentelle parametre resulterer i masse og viskoelastisk beregninger af adsorbede kollagen på guld og polyelektrolyt komplekser under hævelse som en funktion af saltkoncentration.
Introduction
Kvarts krystal mikrobalance (QCM) udnytter den piezoelektriske effekt af en kvarts krystal til at overvåge sin resonansfrekvens, som er afhængig af massen klæbet til overfladen. Teknikken sammenligner resonansfrekvens og båndbredde af en på cut kvarts krystal sensor (typisk i intervallet 5 MHz)1 i luft eller en væske til hyppigheden og båndbredden af sensoren efter deposition af en film. Der er flere fordele ved at bruge qcm til at studere tynde film egenskaber og grænseflader, herunder den høje følsomhed over for masse og potentielt viskoelastiske ændringer i ejendom (afhængigt af prøve ensartethed og tykkelse), evnen til at udføre undersøgelser på situ2, og evnen til at sonde en meget kortere rheologisk tidshorisont end traditionelle shear reologi eller dynamisk mekanisk analyse (DMA). Sondering af en kort rheologisk tidshorisont giver mulighed for observation af, hvordan reaktionen på denne tidshorisont ændrer både over ekstremt korte (MS)3 og lange (år) varigheder4. Denne evne er gavnlig for studiet af en række kinetiske processer og er også en nyttig forlængelse af traditionelle rheometriske teknikker5,6.
Den høje følsomhed af QCM har også ført til sin tunge brug i biologiske applikationer studere de grundlæggende interaktioner af ekstremt små biomolekyler. En ubelagt eller funktionaliseret sensor overflade kan anvendes til at undersøge protein adsorption; yderligere kan plasmonic gennem komplekse bindende hændelser mellem enzymer, antistoffer og aptamers undersøges på grundlag af ændringer i massen7,8,9. For eksempel, teknikken er blevet brugt til at forstå omdannelsen af vesikler til en planar lipid-tolags som en to-faset proces af adsorptions af væske-holdige vesikler til en stiv struktur ved at observere korrelation ændringer i frekvens og viskoelasticitet10. I de senere år har QCM desuden tilbudt en robust platform til overvågning af lægemiddel levering med vesikler eller nanopartikler11. Ved skæringspunktet mellem Materialeteknik og molekylær og cellulær biologi kan vi bruge QCM til at belyse nøgle interaktioner mellem materialer og bioaktive komponenter som proteiner, nukleinsyrer, Liposomer og celler. For eksempel, protein adsorptions til et biomateriale medierer downstream cellulære reaktioner såsom inflammation og bruges ofte som en positiv indikator for biokompatibilitet, mens i andre tilfælde ekstracellulære protein fastgørelse til belægninger, der grænseflade med blod kan fremkalde farlig størkning i fartøjer12,13. QCM kan derfor bruges som et værktøj til at udvælge kandidater optimalt til forskellige behov.
To almindeligt forekommende tilgange til udførelse af QCM-eksperimenter samler analoge data fra eksperimentet: den første metode registrerer frekvens skiftet og den halve båndbredde (Γ) af konduktionens spids. Den anden fremgangsmåde, QCM med afledning (QCM-D), registrerer frekvens skiftet og afledning faktor, som er direkte proportional med Γ gennem ligning 1,14
1
hvor D er den afledning faktor og ƒ er frekvensen. Både D og Γ er relateret til dæmpnings effekten filmen har på sensoren, hvilket giver en indikation af stivheden af filmen. Sænket skrift n betegner frekvensen overtone eller harmonisk, som er den ulige resonansfrekvenser af kvarts sensoren (n = 1, 3, 5, 7...). Yderligere diskussion af modeller ved hjælp af flere harmoniske for at opnå de masse og viskoelastiske egenskaber af en film kan findes i en anmeldelse af johannsmann14 og tidligere papirer fra shull Group15,16,17,18.
En vigtig overvejelse for at forberede QCM prøver er, hvordan man anvender den tynde film på sensoren overflade. Nogle almindeligt forekommende metoder omfatter spin belægning, dip belægning, drop coating, eller adsorptions af filmen på sensoren overflade under eksperimentet19,20. Der er fire regioner for QCM-prøver: Sauerbrey-grænsen, det viskoelastiske regime, bulk-regimet og det over dampede regime. For tilstrækkeligt tynde film gælder grænsen for Sauerbrey, hvor frekvens skiftet (Δƒ) giver en overflade massetæthed af filmen. Inden for Sauerbrey-grænsen skaleres frekvens skiftet lineært med resonans harmoniske, n, og ændringer i Dæmpningsfaktoren (D eller Γ) er generelt små. I dette regime foreligger der ikke tilstrækkelige oplysninger til entydigt at bestemme lagets rheologiske egenskaber uden at fremsætte yderligere antagelser. Data i denne ordning anvendes til at beregne overfladens massetæthed (eller tykkelse, hvis tætheden er kendt a priori) af filmen. I bulk regime, hvor mediet i kontakt med krystal er tilstrækkeligt tyk, den passive shear bølge udbreder i mediet, før den er helt fugtet. Her kan der ikke indhentes masse oplysninger ved hjælp af Δƒ. I denne region bestemmes de viskoelastiske egenskaber dog pålideligt ved hjælp af kombinationen af Δƒ og δγ 15,18. I bulk regime, hvis mediet er for stiv, vil filmen fugt ud resonansen af sensoren, forhindrer indsamlingen af eventuelle pålidelige data fra QCM. Det viskoelastiske regime er det mellemliggende regime, hvor filmen er tynd nok til at have forskydnings bølgen fuldt udformeret gennem filmen samt have pålidelige værdier for Dæmpningsfaktoren. Dæmpningsfaktoren og Δƒ kan derefter anvendes til at bestemme filmens viskoelastiske egenskaber samt dens masse. Her er de viskoelastiske egenskaber givet af produktet af tætheden og størrelsen af den komplekse shear modulus | G* | p og den fasevinkel, som er givet af Φ = ARCTAN (g " / g"). Når film fremstilles i Sauerbrey-grænsen, kan massen pr. arealenhed beregnes direkte på grundlag af Sauerbrey-ligningen, der er vist under21,
2
hvor δƒn er ændringen i resonansfrekvensen, n er over tonen af interesse, ƒ1 er resonansfrekvens af sensoren, Δm / A er massen pr område af filmen, og Zq er den akustiske impedans af kvarts, som for at cut kvarts er zq = 8,84 x 106kg / m2s. Det viskoelastiske regime er mest velegnet til studiet af polymer film, og bulk-grænsen er nyttig til at studere viskøs polymer22 eller proteinopløsninger16. De forskellige regimer afhænger af egenskaberne af det materiale af interesse, med den optimale tykkelse for fuld viskoelastisk og masse karakterisering generelt stigende med filmen stivhed. Figur 1 beskriver de fire regioner med hensyn til den areal tæthed af filmen, komplekse shear modulus, og fasevinkel, hvor vi har antaget en specifik sammenhæng mellem fasevinkel og film stivhed, der har vist sig at være relevant for materialer af denne type. Mange film af praktisk interesse er for tykke til at studere de viskoelastiske egenskaber med QCM, såsom visse biofilm, hvor tykkelserne er på rækkefølgen af snesevis til hundredvis af mikron23. Sådanne tykke film er generelt ikke egnet til at studere ved hjælp af QCM, men kan måles ved hjælp af meget lavere frekvens resonatorer (såsom torsions resonatorer)23, hvilket gør det muligt for forskydnings bølgen at udbrede yderligere ind i filmen.
For at afgøre, hvilken ordning der er relevant for en given qcm-prøve, er det vigtigt at forstå parameteren d /λn , som er forholdet mellem filmens tykkelse (d) og forskydnings bølgelængden for den mekaniske svingning af kvarts krystal sensoren (λn)15,16,18. Den ideelle viskoelastisk regime er d /λn = 0,05-0,218, hvor værdier under 0,05 er inden for Sauerbrey grænse og værdier over 0,2 nærmer bulk regime. En mere stringent beskrivelse af d /λn er givet andetsteds15,18, men det er en kvantitativ parameter afgrænse Sauerbrey grænse og viskoelastisk grænse. De analyseprogrammer, der bruges nedenfor, angiver denne parameter direkte.
Der er nogle yderligere begrænsninger for at analysere tynde film med QCM. De Sauerbrey og viskoelastiske beregninger antager, at filmen er homogen både i hele filmens tykkelse og sideværts over elektrodeoverfladen af QCM. Selv om denne antagelse gør det udfordrende at studere film, der har hulrum eller fyldstoffer til stede, har der været nogle QCM undersøgelser af film bestående af podede nanopartikler6. Hvis forskelligartethed er små sammenlignet med den samlede filmtykkelse, kan der stadig opnås pålidelige viskoelastiske egenskaber af det sammensatte system. For mere heterogene systemer bør værdier opnået fra en viskoelastisk analyse altid ses med stor forsigtighed. Ideelt set bør resultater opnået fra systemer med ukendt heterogenitet valideres i forhold til systemer, der vides at være homogene. Det er den fremgangsmåde, vi har benyttet i det eksempel, der beskrives i dette dokument.
Et vigtigt punkt, som vi illustrerer i dette papir er den nøjagtige korrespondance mellem QCM målinger udført i frekvens domænet (hvor Γ er rapporteret) og tids domæne eksperimenter (hvor D er rapporteret). Resultater fra to forskellige QCM-eksperimenter, et tids domæne og et frekvens domæne, er beskrevet, hver med et andet, men konceptuelt beslægtet model system. Det første system er et simpelt eksempel på kollagen fastgørelse til sensoren for at illustrere repræsentative bindende kinetik og ækvibrering af adsorptions over tid i løbet af en tid domæne (QCM-D) måling. Kollagen er den mest rigelige protein i kroppen, kendt for sin alsidighed af bindende adfærd og morfologi. Den kollagenopløsning, der anvendes her, kræver ikke yderligere funktionalisering af sensorens gyldne overflade for at inducere adsorptions9. Det andet eksperimentelle system er et polyelektrolyt kompleks (PEC) sammensat af anionisk polystyren sulfonat (PSS) og kationisk poly (diallyldimethylammonium) (PDADMA), der er fremstillet på samme måde som Sadman et al.22. Disse materialer svulmer og bliver bløde i salt (KBr i dette tilfælde) løsninger, der tilbyder en enkel platform til at studere polymer mekanik ved hjælp af en frekvens domæne tilgang (QCM-Z). For hver protokol vises processen med at forberede, tage og analysere en måling i figur 2. Skematisk viser, at den væsentligste forskel mellem QCM-Z og QCM-D tilgange er i dataindsamlings trinnet og instrumentering, der anvendes i forsøget. Alle de nævnte prøve forberedelses teknikker er kompatible med begge tilgange, og hver tilgang kan analysere prøver i de tre regioner, der er afbildet i figur 1.
Vores data viser, at forberedelsen af prøver, enten ved sensor belægning før eller under en måling, dikterer evnen til at udtrække de viskoelastiske egenskaber af et system. Ved at designe de tidlige stadier af et eksperiment korrekt, kan vi bestemme, hvilke oplysninger vi præcist kan samle i løbet af analyse trinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
QCM-D kollagen adsorption
1. prøveforberedelse og sensor Forrengøring
- Du skal tilberede 20 mL 0,1 M acetatbuffer, justere pH-værdien med HCl og NaOH efter behov for at opnå pH = 5,6.
- Der tilsættes Rottehale kollagen opløsning til 20 mL acetatbuffer under sterile forhold til en endelig koncentration på 10 μg/mL.
- Rengør den guldbelagte kvarts sensor for at fjerne organisk og biologisk materiale25,26.
- Placer sensoren aktivside op i et UV/ozon kammer og Behandl overfladen i ca. 10 minutter.
- Opvarm en 5:1:1 blanding af deioniseret vand (dH2O), ammoniak (25%) og hydrogenperoxid (30%) til 75 °C. Placer sensoren i opløsningen i 5 min.
- Skyl sensoren med dH2O og tør med en strøm af nitrogen gas.
- Placer sensoren aktivside op i et UV/ozon kammer og Behandl overfladen i 10 minutter.
Bemærk: rengøringsproceduren skal straks udføres før en måling for at minimere miljøforureningen på sensorens overflade.
2. QCM-D måling data erhvervelse
- Aktivér alt nødvendigt udstyr for at foretage en måling, herunder pumpen, elektronikenheden og computer softwaren.
- Fjern flow modulet fra kammer platformen, og Skru de store tommelskruer af for at åbne modulet.
- Hvis sensoren er udeladt efter den indledende rengøring (trin 1.3.1-1.3.4), skylles sensoren med deioniseret vand (dH2O) og tørres med en strøm af nitrogen gas for at sikre, at der ikke er forurenende stoffer på overfladen.
- Monter sensoren i flow modulet på den udsatte O-ring, første tørring af området med en strøm af nitrogen gas og kontrol af, at O-ringen ligger fladt. Sensoren skal placeres med den aktive overflade side nedad og anker formet elektrode orienteret mod markøren i flow modulet.
- Drej tommelskruerne for at forsegle flow modulet og Udskift det på kammer platformen. Fastgør de nødvendige PTFE-pumpeslanger til flow modulet og den eksterne pumpe.
- Brug den relevante computer software til at indstille temperaturen på flow modulet til 37 °C. Overvåg temperaturændringen i 10-15 min for at sikre, at den er i ligevægt med den ønskede værdi.
- Find sensorens oprindelige resonansfrekvenser. Hvis der ikke findes resonansfrekvenser af softwaren, skal du kontrollere, at flow modulet er korrekt placeret på kammer platformen eller re-montere sensoren i flow modulet for at sikre, at den er centreret og gør korrekt elektrisk kontakt.
- Placer indløbs pumpeslangen i 1x fosfat-Buffered Saline (PBS) opløsning. Start den udvendige pumpe strøm med 25 μL/min og Inspicér slangen visuelt for at sikre, at væsken flyder gennem røret.
Bemærk: væske gennemstrømningen kan være lettere at se ved momentant at øge væskestrømmen til 100 μL/min eller højere. Hvis væsken ikke ser ud til at bevæge sig gennem røret, er det højst sandsynligt, at de to dele af flow modulet ikke skaber en ordentlig forsegling. Prøv at stramme tommelfingeren skruer, stramme forbindelserne af slangen til indløb og udløb, eller re-montering sensoren for at være sikker på, at O-ringen er fladt og centreret. - Lad væskestrømmen af 1x PBS gennem flow modulet i mindst 15 min til korrekt ækvibrere.
- Start målingen i computer softwaren for at starte dataindsamlingen. Overvåg frekvens-og sprede værdierne i mindst 5 minutter for at sikre en stabil baseline.
- Stop pumpen og Flyt indløbs slangen til kollagen-acetatbuffer opløsningen, og Genoptag væskestrømmen. Bemærk tidspunktet for denne begivenhed til senere analyse.
- Tillad, at de nye frekvens-og afledning-værdier er i ligevægt til en stabil værdi. Her forventer vi, at denne stabilisering sker efter 8-12 h.
- Stop pumpen, Flyt indløbs slangen tilbage til 1x PBS-opløsningen, og Genoptag væskestrømmen. Bemærk tidspunktet for denne begivenhed til senere analyse.
- Tillad, at de nye frekvens-og afledning-værdier er i ligevægt til en stabil værdi. Her, denne stabilisering sker efter 30 min.
Bemærk: trin 2,13 og 2,14 kan gentages for hver ny periode af væske gennemstrømning i mere stringente eksperimenter med et større antal etaper. - Afslut dataindsamlingen af målingen, og Gem dataene.
- Rengør og demonterer QCM-udstyret.
- Øg væskestrømmen på den eksterne pumpe til 500 μL/min eller højere, og Placer indløbs slangen i en opløsning på 2% Hellmanex rengøringsopløsning i mindst 20 minutter.
Bemærk: for andre eksperimenter, hvis yderligere analyse af sensoren ønskes, Fjern sensoren før trin 2.16.1 og Placer en anden rengørings sensor i modulet. - Stop pumpen og Flyt indløbs slangen til dH2O, og Genoptag væskestrømmen for at skylle systemet yderligere i mindst 20 minutter.
- Stop væskestrømmen, og fjern sensoren fra flow modulet. Tør sensoren og indersiden af flow modulet med en strøm af nitrogen gas. Sluk for computer software, elektronik enhed og peristaltisk pumpe.
Bemærk: de guldbelagte sensorer kan rengøres korrekt, som beskrevet i trin 1.3.1-1.3.4, og genbruges til flere målinger. Indikationer af, at en sensor ikke længere kan genbruges til pålidelige målinger, kan omfatte, men er ikke begrænset til, stor variation i Initial resonansfrekvenser og signifikant driver i baseline målinger med buffer flow. Data kan åbnes og analyseres i den foretrukne software, herunder dem, der leveres af virksomheder, der specialiserer sig i QCM-D-udstyr.
- Øg væskestrømmen på den eksterne pumpe til 500 μL/min eller højere, og Placer indløbs slangen i en opløsning på 2% Hellmanex rengøringsopløsning i mindst 20 minutter.
QCM Polyelektrolyt kompleks hævelse
3. forberedelse af prøver
Bemærk: dette eksperiment blev udført ved hjælp af et MATLAB program udviklet inden for Shull Research gruppen til dataindsamling og analyse.
- Placer først en bar kvarts krystal sensor i en prøveholder, der er forbundet med vektor netværks analysator og computer. Tænd analysatoren for at anvende en svingende spænding på sensoren, og Saml et reference lednings spektrum for sensoren i luften.
- Under Sænk prøveholderen i et lipless 100 mL bægerglas fyldt med destilleret vand og Saml et reference lednings spektrum for den bare sensor i vand.
- Forbered en 0,5 M opløsning af kaliumbromid (KBr).
- 1,79 g KBr opløses i 30 mL destilleret vand. Ryst indtil opløst.
- Indsæt en lille silicium-wafer i KBr-opløsningen i en vinkel for at oprette en slide til Quartz-sensoren under udglødnings trinnet for at forhindre, at filmen kommer ud af sensoren.
- Klargør sensoren til spin belægning.
- Indstil spin coat-parametrene til 10.000 rpm, 8.000 acceleration og 5 s.
- Sæt sensoren på spin Coater og tænd for vakuum.
- Dæk overfladen af sensoren med ethanol, og Kør spin Coater for at rengøre sensor overfladen.
- Tilføj PEC (PSS: PDADMA udarbejdet på samme måde som beskrevet i Sadman et al. 22) til sensorens overflade.
- Hvis komplekset er i to faser (polymer rig og polymer dårlig), langsomt indsætte pipet i opløsningen. Evakuer pipet ved at blæse bobler, mens du flytter pipet ind i tættere polymer rige fase.
- Efter frigivelse af et par bobler i polymer rige fase, trække op 0,5-0,75 mL af polymer rige opløsning i pipet. Opretholde trykket på pipet pære til ikke at tillade polymer dårlig fase at komme ind i pipet, trække pipet ud af opløsningen.
- Tør det udvendige af pipetten af med en Kimwipe. Tilføj nok løsning dråbevis på overfladen af Quartz sensor til helt at dække overfladen. Sørg for, at der ikke er synlige bobler i opløsningen på sensorens overflade.
- Spin coat PEC-prøven og Nedsænk straks sensoren i 0,5 M KBr-opløsningen for at forhindre salt krystallisering på filmen.
Bemærk: dette trin er sommetider vanskeligt at koordinere. Slip sensoren lige over KBr-løsningen for at få de bedste resultater. - Lad filmen anneal i mindst 12 h.
Bemærk: for at gøre eksperimentet lettere, skal du forberede trin 4 om aftenen og lade filmen udgløde natten over.
4. måling af filmen i luft og vand
- Overfør sensoren til et bægerglas fyldt med destilleret vand for at fjerne den overskydende KBr fra filmen og bagsiden af sensoren. Lad sensoren stå i opløsningen i 30-60 min.
- Tag en måling af filmen i luften. Reference til den nøgne sensor i luften. Gør det muligt at ækvibrere filmdataene.
- Indsæt tørret calciumsulfat i et 100 mL lipless bægerglas, og mål den helt tørre filmtykkelse. Fjern calciumsulfat fra bægerglasset og skyl bægerglasset med destilleret vand.
- Fyld 100 mL lipless bægerglas med 30 mL destilleret vand. Indsæt en Stir stang for at sikre, at vandet cirkulerer omkring filmen. Mål filmen i vand i ca. 30-45 min. eller indtil filmdataene er ækvibrerede. Reference til den nøgne sensor i vand.
- Der forberedes en 15 mL opløsning på 3 M KBr i destilleret vand. Mål 5,35 g KBr i en gradueret cylinder og fyld til 15 mL med destilleret vand. Hvirvles til opløst.
- Tilsæt KBr-opløsningen til bægerglasset med destilleret vand i intervaller på 0,1 M. Tabel 1 viser intervaller på 0,1 m i ml 3 m KBR-opløsning. Se filmen væk fra, hvor KBr-opløsningen tilsættes til vandet, så filmen ikke opløses. Sørg for, at systemet er ækvibreret, før du tilføjer en anden tilsætning af KBr-opløsningen.
- Når alle data er erhvervet, skal du fjerne filmen fra holderen og anbringe den i et bægerglas med destilleret vand. Lad saltet forlade filmen (30-60 min) og lufttørre filmen.
- For at rense PEC-filmen fra sensoren skal du tilføje KBr til bægerglasset og forsigtigt hvirvle opløsningen. Lad det sidde i 5-10 min. Gentag denne proces 2-3 gange, skyl derefter sensoren med destilleret vand.
Bemærk: sensoren kan rengøres og genbruges, hvis reaktionen fra sensoren stadig er god. Dette kan kontrolleres af sensoren med små absolutte båndbredde aflæsninger for harmoniske af interesse (< 100 Hz).
5. data analyse
- Åbn QCM-D data analysis MATLAB GUI skabt af sadman (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27. Åbn filmen i Air data File ved at vælge "Load QCM."
Bemærk: Shull Group har udviklet en lignende Python GUI til dataindsamling og analyse for QCM (https://github.com/shullgroup/rheoQCM). En del af analyse koden findes i de supplerende oplysninger til både analyse af data og generering af tallene i dette papir. - Vælg den ønskede beregning (enten 3, 5, 3 eller 3, 5, 5), gammaog film i luft ikoner. Klik på plot QCM.
- Bestem tykkelsen af den tørre film ved hjælp af det mest ækvibrerede datapunkt (typisk det sidste datapunkt) fra eksperimentet. Optag denne værdi.
- Åbn filmen i Water data File. Vælg de samme parametre som i trin 5,2, bortset fra film i vand i stedet for film i luften.
- Efter hver ækvibration trin af hævelsen eksperiment, bestemme filmtykkelse, komplekse shear modulus, og viskoelastisk fasevinkel. Registrere disse værdier sammen med den ioniske styrke (spænder fra 0-1 M i 0,1 M intervaller).
- Bestem procent hævelsen som
3
hvor DP er filmens tykkelse fra opløsningen og DPDry er den tørre filmtykkelse.
3Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ændringer i hyppighed med tid under protein adsorptions udviser en karakteristisk kurve og plateau vist i figur 3a-B. Den første buffer vask på 1x PBS på tværs af den bare sensor overflade inducerer kun ubetydelige ændringer i frekvensen, hvilket giver en stabil baseline til at fungere som en reference for fremtidige datapunkter. Indførelsen af kollagen opløsning forårsager protein adsorptions til at begynde, observeret som en støt fald i hyppighed over tid, indtil tætheden af klæbet kollagen plateauer ved en stabil baseline (figur 3a). De nøjagtige frekvens-og Masseværdier vil være meget afhængige af sensorens renhed og overfladeenergi. I betragtning af disse parametre fjerner den endelige buffer vask kun en lille mængde af ikke-klæbet protein fra sensor overfladen, hvilket resulterer i en let stigning i frekvensen. Vi bør altid forvente kun et lille fald i massen i denne periode, hvilket viser en stabil mængde proteinbundet til sensoren (figur 3B).
Det er ikke overvurderet, hvor vigtigt det er at nå en stabil frekvensmåling for hver periode. Små udsving i miljøvariabler som temperatur, fugtighed og opløsning kan føre til observerbare forskelle i rådata. Derfor kan ændring af disse variabler før mindst 5-10 min stabile frekvens og spredning faktor målinger fejlrepræsentere de nøjagtige ændringer i hyppighed og spredning. Et eksempel på et suboptimalt datasæt vises i figur 3C-D. Her anvendes den samme opløsning koncentration og flow rate parametre som figur A-B, men instrument miljøet var ikke tilladt at ækvibrere før påbegyndelse af målingen. Den naturlige afløsning af sensorens svingende frekvens sker samtidig med en ændring af temperatur og væske koncentration og tilsløre enhver potentiel baseline, der vil fungere som reference (figur 3C). Vi er i stedet tvunget til at vælge et gennemsnit af hele det dynamiske frekvensområde i perioden til at fungere som en reference. Endelig er kollagen-flowet ikke tilladt at ækvibrere ved en stabil masse, før den endelige PBS Wash påbegyndes, som det ses af de stadigt skiftende frekvens Skift lige før PBS kommer ind i systemet. Denne handling påvirker ikke beregningerne af massen, men karakteriserer ikke fuldt ud det adsorberende potentiale af proteinet på sensoren (figur 3D).
I de tidlige stadier af kollagen-adsorptions eksperimentet er filmen i Sauerbrey-regimet, indikeret ved værdier af Δƒ/n , der er uafhængige af n (t < 2 h i figur 3). Efterhånden som eksperimentet skrider frem, bevæger filmen sig ind i det viskoelastiske regime, indikeret ved værdier af Δƒ/n , som ikke længere overlapper (t > 2,5 h). Erkender denne ændring i adfærd, de data, opnået fra kollagen eksperiment blev analyseret for at se på areal masse og viskoelastisk egenskaber ved hjælp af to forskellige metoder. Den første bruger et Python-script, der er kompileret af Shull-gruppen. Dette script har samme matematiske funda, som MATLAB dataindsamling og analyse software, der anvendes til PEC eksperiment. Det bruger en Power Law model til at konto for ejendoms forskelle på tilstødende harmoniske15 og er indeholdt i de supplerende oplysninger. Den anden metode bruger værdier bestemt fra en viskoelastisk model i en kommerciel softwarepakke til at beregne areal massen, komplekse forskydnings modulus og fase vinklen af kollagen-filmen. Den viskoelastiske model fra denne software rapporterer tykkelsen (d), elastisk modulus (μ) og viskositet (η). Den elastiske modulus og viskositet er elementerne i en Kelvin-Voigt model, og konverteres til omfanget og fasen af den komplekse modulus via følgende udtryk:
4
5
hvor ωn = 2πnƒ1 , hvor ƒ1 er den grundlæggende hyppighed af kvarts sensoren (5 MHz). Figur 4 viser de viskoelastiske egenskaber, som er fastlagt for kollagen-adsorptions, beregnet ud fra værdierne δƒn og ΔDn i tredje og femte harmonisk. Figur 5 sammenligner egenskaberne fra figur 4 med de egenskaber, som er konverteret fra de kommercielle software resultater. Som det fremgår af figur 5, rapporterer de kommercielle software værdier, at filmen er blødere end Python-scriptet.
Figur 6 beskriver et forhold, som er blevet observeret i tidligere qcm-eksperimenter3,22 , der viser en lineær sammenhæng mellem den viskoelastiske fasevinkel og logaritmen af størrelsen af den komplekse forskydnings modulus. Den grønne linje indikerer dette lineære forhold, der har slutpunkter af en Newtonian væske, såsom vand (| G* | p = 105PA • g/cm3 og Φ = 90 ° ved ƒ3 = 15 MHz) og en elastisk fast eller glasagtig polymer (| G* | p = 109PA • g/cm3 og Φ = 0 °). Mange polymer materialer undersøgt ved hjælp af QCM følge denne generelle empiriske tendens, som blev kvantificeret ved hjælp af PSS: PDADMA Complex system22. Da PEC er udsat for opløsninger med højere saltkoncentrationer, er prøve overgangene fra at være en stiv, glasagtig prøve til at være mere viskøs og flydende som; dette spektrum af egenskaber falder på den grønne linje. Til sammenligningsformål er de egenskaber, der beregnes ved hjælp af Python-scriptet for den ækvibrerede kollagen-film, også afbildet i figur 6. Forholdet mellem | G* | p og Φ forventes at være den samme for begge systemer, da begge systemer er glasagtig polymerer opsvulmet med vand. Vandindholdet i filmen bestemmer det specifikke punkt langs kurven. Her svarer PEC-systemet med mekaniske egenskaber, der er tættest på kollagen-systemet, til en 20 WT% polymeropløsning. Vi udleder af denne sammenligning, at polymer koncentrationen i den adsorbede kollagen film er også tæt på 20 WT .%. Dette resultat er en meget nyttig en, opnået i vores tilfælde ved sammenligningen af resultater opnået fra to passende designet QCM eksperimenter. Et af disse eksperimenter var et tids domæne (QCM-D, kollagen) eksperiment og den anden var en frekvens domæne (QCM-Z, PEC) eksperiment, men disse typer af eksperiment er helt udskiftelige, med enten protokol sufficing i begge tilfælde.
Figur 1: plot af Sauerbrey, viskoelastisk, bulk, og over dampet regimer. Plottet viser regimer, hvor forskellige typer af oplysninger kan fås fra QCM data, baseret på prøveareal massen (relateret til tykkelse) og de viskoelastiske egenskaber. Under den blå linje er Sauerbrey regime, hvor kun tykkelsen af prøven beregnes. For den midterste region kan prøvens masse-og viskoelastiske egenskaber beregnes. I bulk-regimet i øverste venstre del af plottet kan der opnås viskoelastisk information, men eksperimenterne er ikke længere følsomme over for prøve tykkelsen. Øverst til højre angiver det over dampede regime, at prøven er for tyk til, at der kan udføres en QCM-måling. I plottet antages et lineært forhold mellem den viskoelastiske fasevinkel ved den tredje harmoniske og loggen af størrelsen af den komplekse forskydnings modulus (grøn linje i figur 6). Bulk regime er defineret som den region, hvor tykkelsen er mere end dobbelt så henfalds længden af forskydnings bølgen. Sauerbrey-regimet defineres som den region, hvor δƒ/3 og δƒ/5 afviger med mindre end 10 Hz, og det over dampede regime er regimet, hvor Γ5 er større end 20.000 Hz (D5 > 1600 ppm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: flow diagram over større trin inden for en QCM-måling. Skematisk af et QCM-Z-eller QCM-D-eksperiment. Diagrammet i første trin er en QCM-sensor (grå) med guld elektroderne (guld) og film på toppen af sensoren (lilla) med de forskellige teknikker, der anvendes til at anvende en film på sensor overfladen. Tykkelsen af filmen, d, er indiceret. Det andet trin fremhæver dataene fra forsøgsprotokollerne QCM-Z (top) og QCM-D (bottom). Det tredje trin er, hvor man afgør den region, hvor prøven kan analyseres. Det fjerde trin viser de resulterende data fra det givne analyseområde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: "god" og "dårlig" QCM-D data for kollagen adsorption. Observationsområder for hyppigheden og dæmpnings faktorerne for kollagen-adsorptions forsøget. (A) ækvibrerede frekvens Skift, (B) ækvibrerede dæmpningsfaktor forskydninger, (C) ikke-ækvibrerede frekvens Skift, og (D) ikke-ligevægt dæmpningsfaktor forskydninger. I (B) og (d), er Dæmpningsfaktoren forskydning afbildet som afledning faktor, D, og båndbredden, Γ, da den samme parameter måles ved begge Skift. Frekvens-og gamma forskydningerne er normaliseret til deres respektive harmoniske (n = 3 eller 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: viskoelastisk analyse af kollagen ved hjælp af en Power Law model. Den (A) areal masse, (B) komplekse shear modulus, og (C) viskoelastisk fasevinkel for kollagen adsorptions eksperiment. Den første 10 h viser den vigtigste adsorptions fase af kollagen til sensor overfladen, med perioden mellem 10 og 20 viser ækvilibrering fase før buffer vask udføres ved 20 h. Fejl barerne repræsenterer usikkerhed i beregningerne for tykkelsen og viskoelastisk egenskaber, idet de antager en fejl i Δƒ og δγ svarende til 1% af Γ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: viskoelastisk analyse af kollagen ved hjælp af en Power Law model og kommerciel software model. Den (A) areal masse, (B) komplekse shear modulus, og (C) viskoelastisk fasevinkel for kollagen adsorptions eksperiment. Γ -værdierne bestemmes med Python-scriptet ved hjælp af Δƒ-og δD -værdierne fra de eksperimentelle data, mens D -værdierne konverteres fra resultaterne af den viskoelastiske model fra den kommercielle software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: modificeret van Gurp-Palmen plot af kollagen og PSS: PDADMA data. En afbildning af den viskoelastiske fasevinkel og den komplekse forskydnings modulus over det generelle udsnit af prøver, der måles ved hjælp af QCM. Den grønne linje angiver den lineære sammenhæng mellem de to egenskaber, som blev antaget i udviklingen af figur 1. Data for PSS: PDADMA polyelektrolyt kompleks (PEC) genoptrykkes med tilladelse fra Sadman et al. 22, Copyright 2017 amerikanske kemiske samfund. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Molaritet af opløsning (M) | mL af 3 M KBr |
| 0,1 | 1 |
| 0,2 | 1,1 |
| 0,3 | 1,2 |
| 0,4 | 1,3 |
| 0,5 | 1,4 |
| 0,6 | 1,5 |
| 0,7 | 1,6 |
| 0,8 | 1,8 |
| 0,9 | 1,9 |
| 1 | 2 |
Tabel 1: molære intervaller for PEC-ekspande ingen. Den mængde (i mL) af 3 M kaliumbromid opløsning, som er nødvendig for at øge vand opløsningens Molaritet med 0,1 M for det ekspande ende eksperiment.
Supplerende filer: Python-kode. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollagen adsorptions resultaterne spænder over Sauerbrey og viskoelastiske regimer. Ved at plotte frekvens forskydningerne normaliseret til det tilsvarende harmoniske tal, bemærker vi, at Sauerbrey-grænsen gælder for omtrent de første 2 timer af målingen. Med en stigende masse, der klæber til sensoren, begynder de normaliserede frekvens forskydninger for den tredje og femte harmonika dog at afvige fra hinanden (t > 2 timer), hvilket indikerer en evne til at bestemme den adsorbede Films viskoelastiske egenskaber.
En direkte sammenligning mellem den viskoelastiske modellering resultater fra softwaren og Power Law modellering fra Shull Group indikerer en mærkbar forskel i beregnede materialeegenskaber. I løbet af målingen repræsenterede de viskoelastiske modellede data fra kommerciel software et tykkere, blødere lag med en lavere kompleks forskydnings modulus (figur 5). Forskellene i de viskoelastiske egenskaber mellem disse modeller skyldes de antagelser, der er foretaget i beregningerne for hvert system. En forskel vedrører en antagelse, der skal gøres om frekvens afhængighed af de viskoelastiske egenskaber. En vis antagelse skal foretages, fordi frekvensrespons ved en given harmonisk (n = 3, for eksempel), afhænger af tre parametre (PD, | G*3| p, Φ3), men der måles kun to uafhængige mængder (δƒ3 og δγn ~ ΔDn). På grund af denne uoverensstemmelse skal vi indhente mindst én ekstra mængde (enten frekvens Skift eller spredning) fra en ekstra harmonisk uden at tilføje en yderligere ukendt for problemet. Tykkelsen og tæthed naturligvis ikke afhænger af frekvensen, men den komplekse shear modulus gør. Den Power Law tilgang er baseret på det faktum, at over en lille frekvensområde, kan vi antage, at fasevinkel er konstant, med en rheologiske svar svarende til et materiale med en Power-Law adfærd over en langt større spektrum af frekvenser15,16,18. Effekt loven eksponent, Λ, er ikke en justerbar parameter, men er lig med Φ/90 °, med Φ i grader. Med Power Law antagelse, har vi Φ3 = φ5 og 
. For kvantitativ viskoelastisk modellering repræsenterer Power Law-modellen den bedste kombination af nøjagtighed og enkelhed, hvilket giver mere pålidelige resultater end andre fælles tilgange, herunder Kelvin-Voigt-modellen, hvor g ' antages at være uafhængig af n og g " antages at stige lineært med n.
I betragtning af den eksperimentelle opsætning af PSS: PDADMA-data blev der udført eksperimenter i bulk og de viskoelastiske regimer til generering af dataene i figur 6. Protokollen beskriver prøveforberedelsen til de viskoelastiske regime eksperimenter, med bulk eksperimenter udføres ved at se på sensoren respons på en opløsning med PEC, salt og vand til stede. For at forberede prøverne til de viskoelastiske regime eksperimenter, er det vigtigt at forstå målet tykkelse område for at forblive inden for viskoelastisk regime og undgå over dæmpning reaktionen af sensoren. For PSS: PDADMA-systemet er dette ideelle område ~ 0,8-1,6 μm. Da PEC oprindeligt stiger i tykkelse med 45-50%, når svulmede i vand, denne adfærd skulle være tegnede sig i den oprindelige film tykkelser, hvilket gør et mål område for den oprindelige prøve tykkelse på ~ 0,45-0,65 μm. At have en god forståelse af, hvordan filmen vil opføre sig i løbet af eksperimentet er vigtigt for at forstå den bedste mål tykkelse rækkevidde samt den bedste metode til prøveforberedelse18.
Uanset den nøjagtige instrumentale set-up, disse procedurer viser vigtigheden af at overveje prøveforberedelse før du begynder et QCM eksperiment. Tykkelsen af det anvendte lag afgør, hvilke oplysninger der kan udtrækkes fra de målte data. Før du påbegynder en måling, skal forskeren overveje, hvilke oplysninger der er mest nødvendige fra eksperimentet og forstå de begrænsninger af teknikken. En forståelse af filmens viskoelastiske egenskaber er nyttig, når den korrekte prøve tykkelse og tilberedningsmetode bestemmes. For passende prøver, både tids domæne og frekvens domæne QCM instrumenter kan være fagligt bruges til at indsamle nøjagtige data til en bred vifte af applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. og E.S. anerkender støtte fra NSF (DMR-1751308).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | For collagen adsorption |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228 | For collagen adsorption |
| Aqueous QCM probe | AWSensors | CLS 00050 A | For polyelectrolyte swelling |
| Collagen I Rat Protein, Tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | For collagen adsorption |
| Distilled water | Sigma-Aldrich | EM3234 | For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 793175-1GA-PB | For polyelectrolyte swelling |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | For collagen adsorption |
| Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | For collagen adsorption |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | For collagen adsorption |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666A | For polyelectrolyte swelling |
| NP2K VNA | Makarov Instruments | For polyelectrolyte swelling | |
| Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 | Sigma-Aldrich | 409022 | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water | Sigma-Aldrich | 561967-500G | For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al. |
| Potassium Bromide | Sigma-Aldrich | 793604-1KG | For polyelectrolyte swelling |
| QSense QCM Explorer System | Biolin Scientific | For collagen adsorption | |
| Sodium acetate, anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | For collagen adsorption |
| Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP | Laurell technologies | For polyelectrolyte swelling |
References
- Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
- Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
- Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
- Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
- Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
- Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
- Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
- Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
- Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
- Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
- Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
- Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
- Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
- Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
- Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
- Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
- Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
- Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
- Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
- Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
- Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
- Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2017).
- Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2015).
- Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
- Sadman, K. sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).
