Summary
هنا، نقدم بروتوكولات ل 1) نشر الأسير المختبري للفراشة الزرقاء ميامي المهددة بالانقراض اتحاديا(Cyclargus thomasi bethunebakeri)،و 2) تقييم المعلومات الأساسية تاريخ الحياة مثل وقت التنمية غير ناضجة وعدد من stadia اليرقال. ويمكن تكييف كلتا الطريقتين للاستخدام مع برامج الحفظ الأخرى خارج الموقع.
Abstract
تحسين المعرفة من خارج الموقع أفضل الممارسات للفراشات المعرضة للخطر مهم لتوليد نتائج ناجحة برنامج الحفظ والاسترداد. كما يمكن للبحوث المتعلقة بهؤلاء السكان الأسيرين أن تسفر عن بيانات قيمة لمعالجة الثغرات الرئيسية في المعلومات المتعلقة بسلوك الفئات المستهدفة وتاريخ حياتها وإيكولوجياها. نحن نصف بروتوكول لنشر أسيرة من الانقراض الاتحادي ة Cyclargus thomasi bethunebakeri التي يمكن استخدامها كنموذج لبرامج أخرى الفراشة المعرضة للخطر خارج الموقع، وخاصة تلك الموجودة في Lycaenidae الأسرة. كما نقدم بروتوكولبسيط ومباشر لتسجيل مقاييس تاريخ الحياة المختلفة التي يمكن أن تكون مفيدة لإعلام منهجيات الموقع بالإضافة إلى تكييفها للدراسات المختبرية لـ lepidopteraالأخرى.
Introduction
تشير قائمة متزايدة من الدراسات إلى انخفاضات عالمية واسعة النطاق وخطيرة في عدد الفراشات1،2،3،4،5. ويشمل ذلك الغالبية العظمى من الأنواع المعرضة للخطر. وغالباً ما تستخدم برامج الحفظ المصممة للتخفيف من حدة هذه الانخفاضات مزيجاً من الاستراتيجيات بما في ذلك رصد السكان، وإدارة الموائل وترميمها، والبحث العلمي، والانتشار الأسير، ونقل الكائنات الحية6. داخل الولايات المتحدة وأقاليمها وحدها، يتم إدراج ما مجموعه 30 فراشة تصنيفها بموجب قانون الأنواع المهددة بالانقراض (ESA) إما مهددة أو مهددة بالانقراض، مع 21 من هذه التي وافقت على مشاريع أو خطط الاسترداد النهائية. وبالنسبة لهذه الضريبة، يوصي أكثر من نصف استراتيجيات الاسترداد المحددة بالانتشار الأسير أو ينص على أنه ينبغي تقييم الانتشار الأسير7. وقد نما استخدام جهود الحفظ خارج الموقع للفراشات بشكل كبير في السنوات الأخيرة8،9، ولديه القدرة على أن يكون أداة حاسمة للمساعدة في جهود الإنعاش10. وتشارك العديد من المؤسسات والمنظمات والوكالات حاليا مع جهود خارج الموقع لما لا يقل عن 11 فراشة المدرجة في وكالة الإيسا taxa (أي Cyclargus thomasi bethunebakeri، Euphydryas edititha quino، Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, وSperyeria zerene hippolyta) والعديد من الضرائب الأخرى المعرضة للخطر (على سبيل المثال, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Spiria Eumaeus أتالا)11. وعلى الرغم من عدد الجهود القوية والناجحة، لا يزال هناك نقص في التواصل المنتظم عبر البرامج وبين ممارسي الحفاظ على البيئة بما في ذلك تبادل الأفكار والبيانات والمنهجيات الفعالة والنتائج. وهذا التبادل المعرفي ضروري لأنه يساعد على التقليل إلى أدنى حد من ازدواجية الجهود، ويحسن أفضل الممارسات عموما، ويعزز أثر الحفظ. وقليل ونُشر في بروتوكولات البدء في الرؤوس، أو تربية الأسر، أو تربية الماشية، أو تربية الفراشات، وهي متاحة بسهولة لضريبة الفراشة المعرضة للخطر، وتلك التي تفتقر في كثير من الأحيان إلى التفاصيل السردية الكافية و/أو الرسوم التوضيحية. هذه غالبا ما توفر في الغالب تفاصيل موجزة مع تعليمات خطوة بخطوة محدودة والصور المصاحبة، مما يجعل النسخ المتماثل تحديا أو تطبيق على الضرائب الأخرى من الصعب تقييم12،13،14،15. العديد من البروتوكولات المتاحة محدودة بطريقة ما: فهي موجودة فقط في الأدب الرمادي ، أو في مستويات متفاوتة من التفاصيل ، أو عمر النشر ، أو كأجزاء مكون في وقائع الندوة ، أو تقارير الوكالة / التمويل ، أو الأدلة الداخلية16،17،18،19،20،21،22،23،24.
بالنسبة لمعظم برامج الحفظ ، يتم الانتشار الأسير في المقام الأول لدعم نقل الحفظ ، والذي يشمل إعادة الإدخال والتعزيز (أي التعزيز) ، والمقدمة25،26. والغرض من هذه الأنشطة هو تنفيذها استراتيجيا ً كعنصر من عناصر استراتيجية الإنعاش الشاملة من أجل المساعدة على منع انقراض نوع أو نوع فرعي أو مجموعات مدرجة في القائمة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا هو واحد من عدة أدوار محتملة أخرى قد تخدمها مثل هذه البرامج خارج الموقع. وقد تشمل هذه التدابير أيضاً الحفاظ على تأمين (أي ريفوجيا) للسكان، وإنقاذ مؤقت للكائنات الحية، ودعم البحوث و/أو التدريب المتصلة بالإنعاش، وتعزيز جهود التثقيف والتوعية المتصلة بالحفاظ على البيئة27و28. وبغض النظر عما إذا كان للبرامج خارج الموقع هدف واحد محدد أو مزيج من عدة أهداف، ينبغي للممارسين في مجال الحفظ أن يزيدوا إلى أقصى حد من فرص جمع البيانات من أجل سد الثغرات الرئيسية في المعلومات عندما يكون ذلك ممكناً. ويكتسي هذا الأمر أهمية خاصة لأن الغالبية العظمى من الفئات الخاضعة للخطر لم تُدرس عموماً دراسة سيئة قبل حدوث انخفاضات كبيرة في عدد السكان البرية. يمكن أن تساعد المعرفة المعززة الناتجة المكتسبة على مختلف الجوانب السلوكية أو الإيكولوجية أو تاريخ الحياة من التصنيف البؤري للمساعدة في النهوض بالحفاظ على الأنواع وإدارتها بشكل فعال29.
هنا ، ونحن نصف بالتفصيل بروتوكول نشر الأسير التي تم تطويرها لفراشة ميامي الزرقاء المهددة بالانقراض اتحاديا(Cyclargus thomasi bethunebakeri)(الشكل التكميلي 1) كجزء من برنامج أكبر للحفاظ على البيئة والاسترداد. في هذه الحالة، يخدم برنامج الانتشار الأسير ثلاثة أدوار محددة محددة: 1) مجموعة تأمين في حالة فقدان السكان البرية الحالية، 2) مجموعة بحثية مصممة لملء الفجوات المعرفية البيئية وتاريخ الحياة المحددة التي قد تساعد في إثراء الانتعاش و / أو الإدارة، و 3) لإنتاج كائنات قابلة للحياة لنقل الحفظ إلى مواقع ضمن النطاق التاريخي للتصنيف. وقد تم فحص البروتوكول الناتج عن ذلك وثبت بشكل جيد، بعد أن تم استخدامه وتحسينه لأكثر من عقد من الزمان. وبالتالي، نشعر أن التقنيات والمنهجيات الموصوفة تمثل نموذجًا قابلًا للتطبيق يمكن تطبيقه أو تكييفه بسهولة لبرامج الفراشة الأخرى المعرضة للخطر، ولا سيما تلك التي تنطوي على Lycaenidae أو الضريبة ذات الصلة. وفي حين أننا لا نقترح أن البروتوكول الموصوف أعلى من غيره، فإننا نرى أن هناك فرصاً لتطبيق بعض الأساليب على نطاق أوسع للمساعدة في تعزيز الإنتاجية أو الرعاية أو الكفاءة. هذا صحيح بشكل خاص حيث يتم الكثير من تربية لدينا في ظل ظروف مختبرية داخلية مع مساحة محدودة ، على غرار برامج الحفظ التي تنطوي على Euphydryas edititha taylori وSperyeria zerene hippolyta17،23. العديد من البروتوكولات الأخرى غالبا ما تستخدم مواد بوعاء لتربية اليرقات أو اليرقات، والتي يمكن أن تؤدي في بعض الأحيان إلى زيادة التعقيدات المتعلقة بمكافحة الحيوانات المفترسة، والسيطرة البيئية (أي الرطوبة، ودرجة الحرارة)، ورصد الماشية، وجمع البيانات، وقضايا الآفات النباتية، والفضاء على سبيل المثال لا الحصر21،22. وأخيراً، يحدد البروتوكول المعروض أساليب تربية الأسرى. العديد من برامج الحفاظ على الفراشة المعرضة للخطر الأخرى تنطوي على بدء أو تربية الأسير مع البروتوكولات التمثيلية التي تعكس تلك الاختلافات. في حين أن في كثير من الأحيان طفيفة، ونحن نرى أن هذا يساعد على توسيع مجموعة القائمة من المعلومات المتاحة لبرامج أخرى لمراجعة. وهذا أمر بالغ الأهمية، لأن معظم البرامج خارج الموقع تمثل جهودارائدة للمساعدة في تيسير استعادة التاكسي النادر الذي كثيرا ما يكون غير مدروس. يمكن أن تكون البروتوكولات المتاحة بمثابة نقطة انطلاق ممتازة للمساعدة في توفير رؤية قيمة ، والحد من ازدواجية الجهود ، وتعزيز الابتكار. بسبب "التنوع الواسع بين المجالات المتنوعة لسلوكيات الفراشة ، وسمات تاريخ الحياة ، والمتطلبات البيئية إلى جانب الاختلافات الملحوظة في كثير من الأحيان في مرافق البرنامج ، والميزانيات ، وخبرة الممارسين" وغيرها من الاختلافات المتأصلة ، فإن الاعتماد على منهجية واحدة ، حتى بالنسبة للتصنيف الوثيق الصلة ، غالبًا ما يكون محددًا وغير مبرر30. إن المرونة في تحسين أو تطوير بروتوكولات جديدة تتلاءم مع احتياجات فئات أو برامج محددة أمر ضروري للنجاح، ولذلك ينبغي التأكيد عليه. نحن بالإضافة إلى ذلك وصف التقنيات المختبرية لجمع المقاييس على تطوير الكائنات الحية في ظل ظروف أسيرة بما في ذلك عدد من instars اليرقات، ومدة مراحل التنمية الفردية، والوقت الكلي للتنمية، وطول اليرقات والجراء. هذه التقنيات لها قابلية تطبيق واسعة لدراسات تاريخ الحياة Lepidoptera التي يمكن استخدامها لصقل بروتوكولات الموقع أو إعلام البيانات الميدانية.
Protocol
1. تأمين التودد الناجح للبالغين والتزاوج
- بعد نجاح eclosion ، إطلاق الفراشات البالغة القابلة للحياة في قفص طيران آمن ، والدخول ، وفرزه يقع في دفيئة يتم التحكم فيها درجة حرارة(الشكل التكميلي 2).
ملاحظة: يمكن وضع علامة على البالغين على السطح البطني للأجنحة مع علامات الحبر الدائمة إذا كان تحديد أفراد معينين مطلوبًا لفصل الخطوط الوراثية ، أو أصل المخزون ، أو لجمع بيانات محددة تتعلق بطول عمر الكائن الحي ، والسلوك ، الخ.- في حين أن أبعاد القفص الدقيق يمكن أن تختلف، تأكد من أن هناك مساحة واسعة لاستيعاب المواد النباتية الرحيق كافية اللازمة لدعم كثافة الفراشات الكبار يسكن وتوفير مساحة للإنسان للوقوف بحرية ومحور حولها.
- أبعد من تنظيم درجة الحرارة، وضمان أن الدفيئة آمنة بحيث يمكن أن توفر طبقة ثانية من الاحتواء جنبا إلى جنب مع الحماية من الطقس العاصف (مثل الأمطار الغزيرة والرياح).
- رفع مادة نبات الرحيق بوعاء بحيث لا يوجد أكثر من 30 سم من الفضاء من أعلى الجزء الداخلي من القفص إلى أعلى الزهور تزهر(الشكل التكميلي 2). وهذا يوفر الوصول الأمثل إلى موارد الرحيق المتاحة، ويوفر جثم الكبار وافرة، ويقلل من نشاط الطيران الدخيل.
- ضع نبتة مضيفة واحدة في قفص الطيران. وهذا يضمن أنه حتى لو غاب زوج تزاوج أي البيض الناتجة وضعت يمكن جمعها.
- توفير تدفق الهواء متسقة. وهذا يعزز نشاط المغازلة ونجاح التزاوج. في بيئة الدفيئة ، يتم استخدام المنافيخ ومراوح دوران التحميل الثابتة بشكل أفضل للمساعدة في تعزيز التهوية وحركة الهواء. كما يمكن استخدام التهوية المحمولة الأصغر، مثل مراوح الصناديق أو المكاتب.
- الحفاظ على درجة حرارة الدفيئة الداخلية بين 27 درجة مئوية و 32 درجة مئوية لتعزيز النشاط الأمثل للبالغين ونجاح التزاوج. يتم مراقبة درجة الحرارة داخل القفص باستخدام ميزان حرارة رصد الذاكرة القابلة للتتبع.
- ضباب قفص الطيران فحص بانتظام (مرة واحدة تقريبا كل 2 ساعة) مع الماء باستخدام مضخة يدوية، بخاخ خزان من البلاستيك، أو خرطوم الحديقة.
- جمع بلطف أزواج التزاوج الفردية من قفص الطيران فحص باستخدام 50 درام واضحة البلاستيك المفاجئة غطاء قارورة(جدول المواد)،ووضع واحد إلى اثنين من أزواج لكل قارورة، والنقل إلى غرفة تربية داخلية أو مختبر(الشكل التكميلي 3).
2. تعظيم إنتاج البيض
- تجميع غرفة oviposition.
- اتخاذ 12 أوقية كأس ورقة بيضاء عادية واستخدام سكين فائدة شفرة المفاجئة، وجعل اثنين من التخفيضات الأفقية على كل جانب من الكأس عبر من بعضها البعض. يجب أن يكون كل قطع حوالي 1 سم تحت الحافة.
- قطع مسحة قطنية واحدة إلى نصفين وأدخل نهاية قضيب كل في القصتين الأفقيتين على كل جانب من كوب الورق بحيث يمتد جزء مسحة القطن حوالي 2 سم نحو الجزء الداخلي من الكأس.
- باستخدام سكين فائدة شفرة المفاجئة، وجعل اثنين من التخفيضات "X" في الجزء السفلي من كوب الورق. يجب أن يكون طول كل قطع قطري حوالي 1 سم.
- تأخذ كوب من البلاستيك 9 أوقية وملء الجزء السفلي مع ما يقرب من 2 سم من مياه الصنبور.
- ضع قطعًا طازجًا ، بطول 15 سم تقريبًا ، من نمو نبات مضيف اليرقات في كوب الورق عن طريق إدخال الجذع من خلال أحد التخفيضات "X" في الجزء السفلي. دفع الجذعية من خلال قطع بحيث ما يقرب من 4-5 سم تبرز من أسفل.
- ضع كوب الورق مع المواد المضيفة في كوب من البلاستيك، وضمان أن الجذعية النباتية في الماء.
- ملء حقنة فرعية Q 1 مل (0.45 مم × 16 مم) مع مشروب رياضي بنكهة وتشبع كل من مسحات القطن في كوب الورق. هذه بمثابة الزهور الاصطناعية.
ملاحظة: البطيخ والفاكهة لكمة النكهة المشروبات الرياضية توفير أفضل بديل الرحيق. - مرة واحدة كل زوج التزاوج يفصل، مكان 2-3 الإناث gravid في تكوين كأس تجميعها (أي، غرفة oviposition).
- تغطية الكأس مع قطع جزء مربع من تول أسود (حوالي 15 سم × 15 سم) وتأمينه مع شريط مطاطي حول الغطاء(الشكل التكميلي 4). التول الأسود يوفر أفضل رؤية في الكأس وسهولة التعرف على أي بيض التي قد تكون وضعت في بعض الأحيان على تول.
- تحفيز نشاط الفراشة الكبار وoviposition.
- ضع كل غرفة من غرف المشبك على مقعد مختبر أو طاولة حوالي 19 سم تحت ضوء المشبك 8.5 بوصة (21.59 سم) مع عاكس الألومنيوم الذي يضم لمبة متوهجة بقيمة 40 واط(الشكل التكميلي 5).
ملاحظة: يوفر الضوء المتوهج الحرارة المشعة اللازمة لتحفيز نشاط البالغين وoviposition. - ضع ميزان حرارة مراقبة الذاكرة القابل للتتبع بجوار الأضواء وتشغيل مستشعر درجة الحرارة بحيث يرتكز على أعلى غرفة oviposition تقع مباشرة تحت ضوء المشبك.
ملاحظة: يتراوح نطاق درجة الحرارة المستهدفبين 27.5 درجة مئوية إلى 29 درجة مئوية. - إضافة أضواء المشبك التكميلية حسب الضرورة اعتمادا على العدد الإجمالي للغرف ovipositional المنتشرة.
- قم بتوصيل أضواء المشبك بجهاز ضبط برمجة 15 أمبير 24 ساعة في جهاز ضبط الوقت الميكانيكي الداخلي مع منفذين (قابل للبرمجة في فترات زمنية مدتها 30 دقيقة).
- تعيين مؤقت لتشغيل ضوء المشبك لمدة 30 دقيقة فاصلة (أي دورة قابلة للتكرار من 30 دقيقة على، 30 دقيقة قبالة).
ملاحظة: تساعد دورة الضوء هذه على زيادة إنتاج البيض إلى أقصى حد من خلال توفير فترات إضاءة قابلة للتكرار لتحفيز نشاط الفراشة البالغة وراحة الظهر تليها فترات راحة قصيرة داكنة. - تحديث مسحات القطن في كل كوب مع النكهة الرياضة الشراب عن طريق المحاقن الفرعية Q والضباب بانتظام مع الماء باستخدام زجاجة رذاذ البلاستيك تقريبا كل 2-3 ساعة أو حسب الحاجة.
ملاحظة: يوفر هذا الرحيق الاصطناعي الكافي والرطوبة لتمكين الفراشات من التغذية المجانية حسب الرغبة. وبالتالي فإنه يعزز كل من طول العمر الكبار وإنتاجية oviposition في ظل ظروف مختبرية حيث المعيشة، تزهر المواد النباتية لا يمكن استخدامها بسهولة. - مراقبة الكؤوس بانتظام واستبدال النبات المضيف مع قصاصات جديدة حسب الضرورة.
- عندما تبدأ البويضات في الفقس أو تصبح كثافة البيض عالية ، قم بنقل الأنثى (الإناث) إلى كوب جديد مع مضيف طازج وابدأ بروتوكول اليرقات مع حديثي الولادة.
- ضع كل غرفة من غرف المشبك على مقعد مختبر أو طاولة حوالي 19 سم تحت ضوء المشبك 8.5 بوصة (21.59 سم) مع عاكس الألومنيوم الذي يضم لمبة متوهجة بقيمة 40 واط(الشكل التكميلي 5).
3. رعاية وصيانة اليرقات
- كرر الخطوات 2.3-2.6 لتجميع أكواب لليرقات.
- عندما يبدأ البيض في الفقس ، حرك المواد النباتية المضيفة مع البيض ويرقات حديثي الولادة في كوب تم تجميعه حديثًا ، ووضع الجذع من خلال "X" الثاني في الجزء السفلي مما يضمن أن جذع النبات في الماء ويترك لمس قطع المضيف الطازج المجاور.
- عندما تكون اليرقات صغيرة (الوليد-2 instar) ، تحقق من أكواب اليرقات يوميًا للتحقق من نضارة المواد النباتية المضيفة ووجود العفن أو الفراس المفرط.
ملاحظة: لا ينصح بالإزالة اليومية للمواد المضيفة عندما تكون اليرقات صغيرة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى إصابة الكائن الحي بسبب المناولة و / أو النفايات غير الضرورية للمواد المضيفة الطازجة. - إذا ذبول تذبل المواد المضيفة أو في حالة سيئة ، ضع قطعًا آخر من المواد المضيفة الطازجة في كوب بحيث يتم لمس أوراق الشجر الموجودة والسماح لليرقات بالانتقال إلى المضيف الجديد بمفردها.
- بمجرد وصول اليرقات إلى 3rd instar ، استبدل كوب الورق وأضف مواد مضيفة طازجة يوميًا.
- استخدام فرشاة طلاء الشعر الشعر الجمل الصغيرة لتتحرك بلطف اليرقات من المواد المضيفة القديمة أو سطح الكأس إلى المواد المضيفة الطازجة في الكأس الجديد.
- ضع المواد المضيفة القديمة في حاوية تخزين مواد بلاستيكية مستطيلة فارغة.
- كرر الخطوات 3.5-3.7 يوميًا وحتى تتم معالجة جميع الأكواب مع اليرقات.
- عند الانتهاء، إضافة كمية صغيرة من المواد المضيفة الطازجة على رأس النفايات النباتية في حاوية تخزين المواد الغذائية ووضع غطاء فضفاضة على القمة.
ملاحظة: هذا بمثابة ضمان في حالة التغاضي عن أي يرقات أثناء المعالجة اليومية لأنها سوف تزحف على المواد المضيفة الجديدة فوق نفايات المصنع ويمكن إزالتها في اليوم التالي. - الحفاظ على أكواب تحت درجة حرارة المختبر بين 25 درجة مئوية-28 درجة مئوية للنشاط اليرقات الأمثل والتنمية(الشكل التكميلي 6).
ملاحظة: للوصول إلى درجات حرارة التربية المثلى في ظل ظروف داخلية، غالباً ما يكون من الضروري وضع أكواب تحت أضواء المشبك مع عاكسات الألومنيوم التي تحتوي على مصابيح متوهجة 40 واط. ويمكن بعد ذلك رصد درجات الحرارة بنشاط باستخدام ميزان حرارة رصد الذاكرة القابلة للتتبع وضبط ارتفاع الضوء للوصول إلى ظروف التربية المثلى.
4. بناء غرفة pupation
- قطع لفة ورقة مموج وجه واحد في المربعات متساوية الحجم 3.8 سم × 3.8 سم.
- وضع مربع واحد في 2 أوقية كوب جزء من البلاستيك واضحة.
- ضع الكأس على صينية كوب بلاستيكية واضحة(الشكل التكميلي 7).
5. إعداد اليرقات للجرو
- تحديد اليرقات الناضجة على استعداد للخوخ أثناء معالجة المستعمرة اليومية.
ملاحظة: هذه اليرقات سوف تتحول موحدة مملة مخضر البني، وتفقد الشيفرونات بهم، وغالبا ما يهيمون على وجوههم قبالة المضيف. - إزالة بلطف كل يرقة ناضجة مع الشعر الجمل الصغيرة فرشاة الطلاء أو ملقط ضع واحد في كل غرفة الجراء.
- التقط بإحكام الغطاء البلاستيكي الواضح على غرفة الجراء.
- كرر الخطوات 5.1-5.3 حتى يتم نقل جميع اليرقات الجاهزة للخوخ إلى غرف الجراء مضيفا صواني بلاستيكية جديدة حسب الضرورة(الشكل التكميلي 8).
6. الحفاظ على الخواب
- لكل صينية من غرف pupation ، سجل تاريخ الجراء الأولى وأي معلومات أخرى ذات صلة مطلوبة (أي الخط الوراثي ، والتجربة التجريبية ، وما إلى ذلك).
- تنظيم الصواني حسب التاريخ والمكان في مكان آمن داخل المختبر(الشكل التكميلي 8).
- مراقبة الصواني يوميا لeclosion الكبار.
ملاحظة: ستؤثر الظروف المختبرية مثل درجة الحرارة بقوة على وقت التطوير. - قبل eclosion الكبار (عادة في غضون 10 أيام من pupation الأولى)، وإزالة الأغطية من غرف pupation الفردية ووضع علبة في 34.29 سم × 34.29 سم × 60.96 شبكة قابلة للطي المنبثقة قفص التربية(الشكل التكميلي 9).
ملاحظة: Pupae تعلق بشكل آمن داخل الأخاج من المربعات ورقة المموج تسهيل eclosion الكبار الناجحة(الشكل التكميلي 10). - كرر البروتوكول بأكمله من الخطوة 1.1 للجيل الأسير اللاحق.
7. تقييم وقت التنمية من المراحل غير الناضجة وعدد stadia
- ضع يرقة واحدة تحت مجهر تشريح. استخدام الشعر الجمل الصغيرة فرشاة الطلاء الألوان المائية لنقل بعناية وعزل اليرقات لتجنب إصابة الكائن الحي.
- تراجع شعرة واحدة من فرشاة الطلاء في الطلاء مضيئة غير سامة(جدول المواد)،ووضع بعناية قطرة واحدة صغيرة من الطلاء على الظهر (دورسوم) من اليرقة. استخدام لون الطلاء التي تبرز من لون الخلفية ولون نمط اليرقة(الشكل التكميلي 11). تأكد من تجنب وضع الطلاء على رأس اليرقة.
- بمجرد أن يجف الطلاء (حوالي 30 s أو نحو ذلك) ، ضع كل يرقة فردية في كوب جزء من البلاستيك 2 أوقية يحتوي على ما يقرب من 1-3 أوراق صغيرة من مواد مضيفة طرفية جديدة واكتب معرفًا فريدًا على الكأس والغطاء(الشكل التكميلي 12).
- تحقق بعناية كل يرقة يوميا. إزالة الأوراق وتعيينها على سطح أبيض. فحص كوب، غطاء واضح، وفحص الأوراق تحت المجهر تشريح لوجود exuviae اليرقات (جلود الزهر) و / أو كبسولات الرأس.
- إذا تم العثور على إكسوفيا اليرقات، إزالته من الكأس ووضعه في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة وصفت مع رقم الكأس المقابلة والتاريخ (انظر الخطوات 8.1-8.6 أدناه).
- إعادة طلاء يرقات بعد كل التمر المنصهر وتسجيل التمر المنصهر.
- قياس طول الجسم الإجمالي (الرأس إلى الجزء الأخير من البطن) لكل يرقة يوميا باستخدام الفرجار الرقمية. خذ ثلاثة قياسات وسجل متوسط الثلاثة ، جنبا إلى جنب مع التاريخ والوقت. بالنسبة لليرقات الإننجمية المبكرة ، يجب استخدام عدسة مكبرة أو نطاق تشريح عند القياس لضمان قياسات دقيقة.
- عودة يرقة إلى كوب الجزء البلاستيكي المقابلة لها.
- إضافة مواد مضيف ة جديدة حسب الحاجة وإزالة جميع frass والحطام المضيف القديم. إذا تم العثور على العفن في الكأس، والتخلص من واستخدام كوب جديد. اكتب رقم المعرّف الفريد الصحيح على الكأس الجديد.
- كرر الخطوات 7.5-7.9 حتى تصل جميع اليرقات إلى نجمها النهائي وتبدأ المرحلة الإعدادية. عندما تتوقف اليرقات عن التغذية ، قم بتشغيل لون بني مخضر ممل موحد ، وتفقد شيفروناتها ، وغالباً ما تتجول خارج المضيف ، وتقلل من إزعاجها.
- ضع قطعة صغيرة من الورق المموج في الكأس (انظر الخطوة 4.1).
- مرة واحدة وقد خَرْخَة كل يرقة بالكامل، قياس طولها الإجمالي كما في الخطوة 7.8 أعلاه وتسجيل تاريخ الجراء. وسيكون هذا هو النضر النهائي لكل فرد.
- تحقق من pupae يوميا وسجل تاريخ eclosion والجنس من كل فراشة الكبار الناتجة.
- قياس طول وتر الجناح من كل فراشة باستخدام الفرجار الرقمية. يمكن عقد الفراشات بلطف مع ملقط للقياس. إذا كانت الفراشة نشطة للغاية بحيث لا يمكن قياسها بسهولة ، ضعها مؤقتًا في الثلاجة لمدة 30 ثانية أو أقل وحاول مرة أخرى.
8. جمع اليرقات exuviae
- عندما لوحظ اإكسوفيا اليرقات، ملء أنبوب الطرد المركزي الدقيقة مع 0.2 ميكرولتر من الجلسرين. قم بتسمية الجزء العلوي من الغطاء والجانب مع رقم اليرقة وتاريخ الذوبان وكبسولة الرأس (H.C.).
ملاحظة: يرقات بعض يرقات lepidopteran تستهلك بانتظام exuviae ولكن يجب أن تبقى كبسولة الرأس. - ضع اليرقات وكبسولة الرأس المرتبطة بها في غطاء كوب من البلاستيك ووضع بضع قطرات من الإيثانول فيه.
- فحص exuvia اليرقات تحت المجهر تشريح عن طريق وضعه في غطاء كوب جزء من البلاستيك واضحة ووضع بضع قطرات من الإيثانول على ذلك. إذا تم فصل كبسولة رأس اليرقات بالفعل عن الإكسوفيا ، ضع قطرة من الجلسرين على طرف ملقط الحشرات المدببة والمس بلطف كبسولة الرأس إلى الجلسرين. ضع كبسولة الرأس في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المرتبط.
- إذا كانت كبسولة الرأس لا تزال متصلة بإكسوفيا اليرقات ، فاستخدم ملقطًا مدببًا ودبوس حشرة لفصل كبسولة الرأس عن exuvia larval.
- بمجرد فصله، استخدم تقنية الجلسرين لالتقاط كبسولة الرأس. إذا كان هناك الكثير من الإيثانول، يمكنك استخدام منشفة ورقية صغيرة لإزالة بعض، ولكن يجب الحرص على عدم إزالة كبسولة الرأس عن طريق الخطأ.
- ضع كبسولة الرأس في قارورة مملوءة بالجلسرين وأغلق الغطاء بإحكام.
Representative Results
وعلى مدى مبادرتين منفصلتين للحفظ تستهدفان استعادة Cyclargus thomasi bethunebakeri من شباط/فبراير 2003 إلى كانون الأول/ديسمبر 2010 ومن تشرين الثاني/نوفمبر 2016 إلى الوقت الحاضر، استُخدم هذا البروتوكول لإنتاج ما يزيد على 052 51 كائناً قابلاً للحياة بنجاح. واستناداً إلى اللقطة الموجزة التي استمرت عاماً واحداً لإجمالي إنتاجية السكان الأسرى في الفترة من يونيو 2018 إلى يونيو 2019، تم إنتاج ما مجموعه 10,166 كائناً قابلاً للحياة، وهو ما يمثل 782.00 ± 118.93 كائناً شهرياً على مدى 13 جيلاً. وبالمثل، كان متوسط إجمالي إنتاج البيض لكل أنثى في ظل الظروف المختبرية 114.00 ± 26.12 (ن = 12)31. الإنتاجية الكائنات الحية الناتجة كبيرة صفوف هذا البرنامج بين أكبر هذه الجهود خارج الموقع في الولايات المتحدة, جنبا إلى جنب مع تلك من Euphydryas edititha taylori, سبيريا zerene hippolyta, وLycaeides ميليسا صامليس24. ويمكن أن يعزى جزء من هذه الإنتاجية إلى حقيقة أن الفراشة هي باستمرار الحضن، وإنتاج جيل واحد تقريبا كل 4-6 أسابيع في الأسر. غالبية برامج التربية الأخرى الحفظ تنطوي على الtaxa التي هي univoltine أو bivoltine. ومع ذلك ، حتى بالنسبة للبرامج التي تنطوي على الوجداد للغاية الوجداك ة مثل Speyeria spp.، فإن العدد الإجمالي للكائنات الحية القابلة للحياة المنتجة للحفظ نقل على أساس سنوي نادرا ما يتجاوز بضعة آلاف32. وبناء على ذلك، تمكن سكاننا الأسرى من إجراء بحوث موجهة وجمع بيانات واسعة النطاق بشأن العديد من الثغرات الرئيسية في البيانات الهامة لتحسين أفضل ممارسات التربية وتربية المختبرات(الشكل 1)فضلا عن المساعدة في اتخاذ قرارات التعافي والإدارة.
كان متوسط إجمالي وقت النمو من يرقة حديثي الولادة إلى البالغين 28.63 يومًا(الجدول 1). كان لدى غالبية اليرقات أربعة مولات(الشكل 2، الشكل 3)، على الرغم من أن اثنتين كان لديها خمسة نمولت ، وواحدة لديها ستة نمولت. كان المتوسط العام لطول جميع نجوم اليرقات 5.97 مم ، وكانت اليرقات أكبر في مرحلتي الحياة الرابعة والإعدادية(الجدول 1). عندما تشمل فقط المتغيرات مع أكثر من 30 الملاحظات، قضى أقصر وقت في المراحل الأولى instar وprepupal، وقضى أطول كما pupae(الجدول 1، الشكل 2). وعادة ما تتطور الإناث بشكل أسرع في جميع المراحل غير الناضجة مقارنة بالذكور، على الرغم من أن هذا لم يكن له تأثير كبير (p = 0.625). أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام RStudio الإصدار 1.1.463 (R Core Team 2016)33. وكان متوسط طول وتر جناح الكبار 12.64 ملم(الجدول 2)،وكان هناك فرق كبير بين الجنسين (p = 0.047). تم تشغيل اختبار t على الوجهين لتقييم الفرق في وتر الجناح بين الجنسين. أظهر نموذج الانحدار الخطي والانحدار التدريجي لمتوسط طول كل مرحلة من مراحل الحياة أن طول الجرو كان أفضل منبئ بطول وتر الجناح البالغ(الجدول 3، الجدول 4). وأظهرت نماذج الانحدار لوقت التنمية أن عدد الأيام التي قضاها في instars الثاني والرابع والعدد الإجمالي للأيام كانت أفضل المنبئين لطول وتر الجناح الكبار ، ولكن فقط عدد الأيام في instar الرابعة كانت كبيرة(الجدول 5، الجدول 6). لأن المتغيرات كانت مستمرة، تم تشغيل نموذجين الانحدار الخطي لوقت التنمية من كل مرحلة الحياة، فضلا عن طول كل مرحلة الحياة، مع طول وتر الجناح الكبار كمتغير التابعة. تم تشغيل الانحدارات خطوة بخطوة على كلا النموذجين الانحدار لتحديد أفضل المنبئين من طول وتر الجناح الكبار.
الشكل التكميلي 1: عينات مثبتة من الكبار Cyclargus thomasi bethunebackeri. (أ)ذكر بالغ، دورسال (يسار)، بطني (يمين). (ب)أنثى بالغة، دورسال (يسار)، بطني (يمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: قفص الطيران المنفّش الموجود في دفيئة للحرارة التي يتم التحكم فيها. (A)الداخلية يظهر بوعاء نباتات الرحيق الكبار وواحد بوعاء نبات اليرقات المضيفة. (B)رفوف معدنية يساعد على رفع نباتات الرحيق بوعاء بحيث لا يوجد أكثر من 30 سم من الفضاء من أعلى الداخلية من القفص إلى أعلى الزهور تزهر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: إجراءات جمع أزواج البالغين في كوبولا. (أ)زوج التزاوج من الكبار Cyclargus thomasi bethunebakeri داخل قفص الطيران فرزها (أنثى، يمين وذكور، يسار). (ب)أزواج التزاوج التي تم جمعها من قفص الطيران في قوارير الغطاء المفاجئة وجلبت إلى المختبر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 4: إجراء تجميع غرفة oviposition. (أ)اثنين من نظام كوب مع المواد المضيف ة الطرفية ومسحات القطن. (B)حقنة فرعية قطر 1 مل (0.45 مم × 16 مم) مع مشروب رياضي منكهة تشبع مسحات القطن في كوب الورق. (ج)أكواب السكن الإناث gravid المضمون مع تول أسود. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 5: الإعداد المختبري لتعظيم إنتاج البيض. (أ)غرف Oviposition وضعت على مقعد المختبر تحت ضوء المشبك مع لمبة 40 W متوهجة. (ب)يتم وضع ميزان حرارة رصد الذاكرة القابلة للتتبع بجوار الأضواء مع مستشعر درجة الحرارة يستريح فوق غرفة oviposition تقع مباشرة تحت ضوء المشبك. (C)حقنة فرعية 1 مل وكوب صغير يحمل مشروبًا رياضيًا منكهة يوضع بجوار غرف oviposition لتسهيل إنعاش مسحات القطن بانتظام على مدار اليوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 6: الإعداد المختبري لرعاية اليرقات وصيانتها. (أ)نظام كأسين مع كل تحتوي على المواد الطازجة المضيف ة الطرفية واليرقات. (B)يتم الحفاظ على درجة الحرارة في الكؤوس بين 25 درجة مئوية-28 درجة مئوية لنشاط اليرقات الأمثل والتنمية من قبل أضواء المشبك العلوي مع المصابيح المتوهجة 40 W. (C)يتم استخدام ميزان حرارة رصد الذاكرة القابلة للتتبع مع مستشعر درجة الحرارة الموضوع مباشرة في كوب لمراقبة درجة الحرارة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 7: غرف الجراء المعدة. (أ)أكواب جزء من البلاستيك الفردية الموجودة على صواني كوب من البلاستيك واضحة. (ب)يتم وضع مربع ورقة المموج في كل كوب جزء من البلاستيك. (C)سيتم وضع يرقة ناضجة واحدة في كل كوب جزء من البلاستيك المعدة لpupate. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 8: إعداد اليرقات للخوخ وصيانة الجراء. (أ)يرقة ناضجة جاهزة للخون على الورق المموج. بل هو موحد مملة مخضر البني وفقدت أي chevrons. (ب)غرف الجراء جاهزة لاستقبال اليرقات الناضجة المجاورة للأكواب مع اليرقات المغذية. جميع غرف pupation مع الأغطية اليرقات البيت التي تستعد لpupate. (ج)غرف الجراء مع الخوخ. (د)بنوك غرف الجراء مع الخوخا المنظمة حسب التاريخ وصيانتها في ظل الظروف المختبرية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 9: قفص ظهور المختبر. (أ)شبكة قابلة للطي المنبثقة المنبثقة قفص يضم غرف pupation المحتلة. (ب)تتم إزالة أغطية جميع غرف pupation لتسهيل eclosion الكبار الناجحة. (C)سيتم إطلاق جميع الفراشات البالغة الناتجة عن ذلك في قفص الطيران الذي تم فحصه لتأمين الجماع الناجح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 10: فراشة الذكور الكبار بنجاح من الجرو على مربع ورقة المموج. (أ)الكبار المنال من الخوخ. (ب)الكبار إزالتها تماما من غلاف الخوخا. (ج)الكبار في وضع لتوسيع أجنحتها. (د)الكبار توسيع أجنحتها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 11: اليرقة الانستارية الخامسة التي تحمل طلاء مضيئ غير سام. (أ)يتم وضع قطرة صغيرة من الطلاء الأحمر المتناقضة ، غير السامة المضيئة على دورسوم باستخدام فرشاة الطلاء لوضع علامة بنجاح على اليرقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 12: إعداد التربية لدراسة تاريخ الحياة. (أ)وصفت بشكل فريد 2 أوقية أكواب جزء من البلاستيك واضحة. (ب)يتم عزل يرقة واحدة في كل كوب. (ج)يتم تتبع جميع اليرقات بشكل فردي من خلال جميع مراحل النمو من حديثي الولادة إلى الفراشة البالغة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 1: عدد الأزواج المسجلة في كوبولا على أساس درجة الحرارة (درجة مئوية) داخل قفص الطيران المشي في فحص يقع في الدفيئة التي تسيطر عليها درجة الحرارة. تم تسجيل درجة الحرارة في غضون أول دقيقتين من حدث الاقتران الناجح (n = 411). واستخدمت البيانات الناتجة للمساعدة في تحسين الظروف البيئية الخاضعة للرقابة من أجل تحقيق أقصى قدر من النجاح في التزاوج وفي نهاية المطاف تحقيق إنتاجية عامة للانتشار في الأسر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: متوسط وقت التطوير (عدد الأيام) لكل مرحلة حياة غير ناضجة. (أ)أشرطة إظهار متوسط كل مجموعة، وأشرطة الخطأ تمثل قيم الانحراف المعياري العلوي والسفلي لكل مجموعة. (ب)القضبان الزرقاء الداكنة تمثل الإناث، والأزرق الفاتح يمثل الذكور. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كبسولات الرأس التي تم جمعها من #25 الفردية باستخدام بروتوكول تاريخ الحياة. تم تصوير كبسولات الرأس من قبل جوناثان بريمر باستخدام نظام المونتاج التلقائي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مرحلة الحياة | متوسط طول الجسم (مم) | Std. خطأ (طول) | متوسط وقت التطوير (عدد الأيام) | Std. خطأ (ديف. الوقت) |
| إنستار الأول | 1.69478261 (n = 23) | 0.02152643 | 2.90625 (عدد = 32) | 0.08229783 |
| إنستار الثاني | 2.77248958 (n = 32) | 0.04302826 | 3.375 (عدد = 32) | 0.16649857 |
| إنستار الثالث | 5.45751042 (n = 32) | 0.12120829 | 3.5 (ن = 32) | 0.20080483 |
| إنستار الرابع | 10.2369688 (n = 32) | 0.23653991 | 3.875 (عدد = 32) | 0.18917265 |
| إنستار الخامس | 8.7625 (n =2) | 2.6125 | 1.5 (ن = 2) | 0.5 |
| إنستار السادس | 10.2666667 (n =1) | Na | 3 (ن = 1) | Na |
| ما قبل الجرو | 11.0858333 (n = 24) | 0.23948251 | 2.9375 (عدد = 32) | 0.21504641 |
| بوبا | 9.0316129 (n = 31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n = 38) | 0.3272288 |
الجدول 1: متوسط طول كل مرحلة من مراحل الحياة ووقت تطورها. تم تضمين خطأ قياسي لكل متغير وحجم العينة بين قوسين.
| مرحلة الحياة | متوسط طول وتر الجناح (مم) | Std. خطأ |
| الكبار | 12.63895 (عدد = 38) | 0.1365516 |
| ذكر | 12.960 (عدد = 13) | 0.1465588 |
| ذكر | 12.472 (عدد = 25) | 0.1863205 |
الجدول 2: متوسط طول وتر الجناح forewing للفراشات الكبار. يشمل وسائل للإناث والذكور وجميع البالغين (كلا الجنسين معا).
| LM النموذجي 1 | Std. خطأ التقدير | قيمة t | ف القيمة |
| اعتراض | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| متوسط طول الثاني instar | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| متوسط طول الثالث instar | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| متوسط طول الرابع instar | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| متوسط طول الخواب | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * ص < 0.05. | |||
الجدول 3: جدول معاملات نموذج الانحدار الخطي (LM Model 1) لتقييم العلاقة بين متوسط طول كل مرحلة من مراحل الحياة (n > 30 المدرجة في التحليل) وطول وتر الجناح الكبار. متغير تابع: طول وتر الجناح الكبار (مم).
| معاملات | Std. خطأ التقدير | قيمة t | العلاقات العامة (>|t|) |
| اعتراض | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| متوسط طول الخواب | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
الجدول 4: الانحدار التدريجي (خطوة 1). متغير تابع: طول وتر الجناح الكبار (مم).
| LM النموذجي 2 | Std. خطأ التقدير | قيمة t | ف القيمة |
| اعتراض | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Num. أيام الأولى instar | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Num. أيام الثانية instar | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Num. أيام الثالثinstar | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Num. أيام الرابعinstar | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. أيام ما قبل pupae | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| نوم. أيام الخواب | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| مجموع الأيام | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * ص < 0.05. | |||
الجدول 5: جدول معاملات نموذج الانحدار الخطي (LM Model 2) لتقييم العلاقة بين وقت التطوير وطول وتر الجناح البالغ. متغير تابع: طول وتر الجناح الكبار (مم).
| معاملات | Std. خطأ التقدير | قيمة t | ف القيمة |
| اعتراض | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Num. أيام الثانية instar | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| Num. أيام الرابعinstar | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| مجموع الأيام | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * ص < 0.05; • p < 0.1 | |||
الجدول 6: الانحدار التدريجي (الخطوة الثانية 2) لوقت التطوير. متغير تابع: طول وتر الجناح الكبار (مم).
Discussion
هنا، نوضح فعالية بروتوكول تربية الحفظ الثابت خارج الموقع للإنتاج الضخم للفراشات المعرضة للخطر، وكيف يمكن تكييفه للبحث العلمي للمساعدة في معالجة الفجوات السلوكية أو الحياتية أو الفجوات البيئية الرئيسية في البيانات. زيادة فهم متوسط إجمالي وقت التنمية (البيض إلى الكبار)، ومتوسط المدة في كل مرحلة من مراحل الحياة، ودرجة الحرارة المثلى للتزاوج، على سبيل المثال، استخدمت للمساعدة في صقل البروتوكول وتعزيز نجاح البرنامج العام. الغالبية العظمى من البروتوكولات القائمة تفاصيل أساليب تربية الكائنات الحية فقط ولا تناقش جمع البيانات، والبحث العلمي، أو استخدام مثل هذه النتائج للمساعدة في إعلام ويحتمل تكييف الأساليب خارج الموقع.
يتطلب هذا البروتوكول تربية الكائنات الحية اليومية. وتتحقق صحة الكائنات الحية وإنتاجيتها إلى أقصى حد من خلال ظروف التربية النظيفة، وعدم اكتظاظ الكائنات الحية، وتوافر مواد نباتية مضيفة عالية الجودة. بالنسبة للجزء الأكبر، ونحن نستخدم لوازم التربية المتاح والحاويات (على سبيل المثال، ورقة وأكواب بلاستيكية)، وعادة ما تحل محلها بانتظام، في كثير من الأحيان يوميا، وأبدا إعادة استخدام المواد. وهذا أمر فعال من حيث التكلفة ويقلل من الحاجة إلى المزيد من الصرف الصحي للمواد كثيفة العمالة. ومع ذلك ، فإن الأدوات الشائعة الاستخدام ، مثل الملقط الانتانية ، وفرش الطلاء بالألوان المائية ، وأقفاص الطيران المنبثقة الصغيرة ، وكذلك جميع أسطح التربية مثل أسطح الطاولة وقمم مقاعد البدلاء المختبرية يتم تعقيمها بانتظام باستخدام محلول التبييض بنسبة 5٪. يعتمد الجدول الزمني الدقيق للصرف الصحي بشكل كبير على تواتر الاستخدام ، وعلم الفينولوجيا الكائن الحي ، والمتغيرات الأخرى ، ويجب أن يكون مصممًا وفقًا للاحتياجات المحددة لكل برنامج خارج الموقع. بالإضافة إلى ذلك نجد أن ورقة الجزار الأبيض مفيد لتغطية جميع أسطح التربية. فهو يوفر ركيزة نظيفة غير مكلفة وسهلة النشر ، وتسهل لون الخلفية البيضاء رؤية أي كائنات حية ضالة. بالنسبة للتربية اليومية ، يجب على جميع موظفي المختبر دائمًا ارتداء قفازات الفحص المختبري التي يمكن التخلص منها لتقليل التلوث وحماية الموظفين من أي تهيج محتمل في الجلد ناتج عن مناولة النبات أو الكائن الحي. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص إذا كان أي من موظفي المختبر لديهم الحيوانات الأليفة المنزلية التي تتطلب علاجات البراغيث الموضعية. حتى كمية صغيرة من بقايا المكونات النشطة يمكن أن تكون خطرة على الماشية الأسيرة.
وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي الحرص على التقليل إلى أدنى حد من اكتظاظ الكائنات الحية. يمكن أن يؤدي اكتظاظ اليرقات بسرعة إلى انخفاض صحة الكائنات الحية وحتى أكل لحوم البشر في بعض التاكسي ، وخاصة Lycaenidae. قد يكون من الضروري فصل اليرقات بانتظام لتقليل الأعداد داخل حاويات التربية و / أو حتى عزل اليرقات الفردية كما هو موضح في جزء تاريخ الحياة من البروتوكول. وقد تختلف الأرقام المثالية لكل حاوية اختلافاً كبيراً استناداً إلى التصنيف الخاص ومختلف قيود البرامج خارج الموقع مثل الميزانية المتاحة، ومرافق المختبرات، والعدد الإجمالي لموظفي تربية الأطفال. وبالمثل نوصي بترك مساحة كافية بين الكؤوس التي تحتوي على يرقات لتقليل احتمال ية حركة الكائنات الحية بين الحاويات. وأخيرا، يوصى بشدة بفصل المخزون بين مرفق مختبري واحد أو أكثر بالنسبة للسكان السجناء الأكبر حجما. ويمكن أن تساعد استراتيجية الصون هذه على التقليل إلى أدنى حد من الخسائر الكارثية لجميع السكان بسبب الأمراض أو الآثار الأخرى غير المتوقعة.
إن جودة النباتات المضيفة لليرقات وتوافرها يدفعان الإنتاج الحيواني ويؤثران بقوة على كل من معدلات تنمية اليرقات وصحة السكان بشكل عام. ومع ذلك، فإن القليل من التقارير أو الدراسات المنشورة تسلط الضوء على هذا الشرط في الكواليس أو تناقش أفضل ممارسات الحضانة. يجب أن يُحسب التخطيط الناجح للبرنامج خارج الموقع كميات كافية من النباتات والإنتاج والصيانة. كما تتطلب العديد من اليرقات أيضا أو تفضل أجزاء نباتية معينة (على سبيل المثال، نمو جديد محطة، براعم الزهور والإزهار، الفاكهة، الخ)، التدريج الفعال لضمان الفينولوجيا النباتية المناسبة مطلوب.
وتشمل الاعتبارات الإضافية الإدارة الديمغرافية والجينية المناسبة، والتقليل إلى أدنى حد من أي آثار سلبية محتملة للأسر. نوصي بوضع خطة للإدارة الوراثية. وقد يشمل ذلك استراتيجيات تشمل ضخ مواد جينية جديدة على أساس منتظم، وتعظيم التنوع ومنع التزاوج الوثيق، وتقييم متغيرات اللياقة البدنية الرئيسية للكائنات الحية دوريا، ورصد علم الوراثة على مستوى ما للتمكين من المقارنة بين السكان الراهنين والتحقق من صحة المخزون الأسير. المقارنة الدورية لخصائص الأفراد الأسرى للأفراد من السكان المؤسسين لها ما يبررها أيضا34،35.
وتمثل هذه البروتوكولات أفضل الممارسات المثبتة. وينبغي أن تكون مفيدة لمجموعة متنوعة من الباحثين والممارسين الحفاظ على البيئة التي يمكن أن تطبق مباشرة أو تكييف أساليبنا لدراساتهم الخاصة والبيئة في الموقع في خطر الفراشة أو الحشرات وبرامج الانتعاش. ومن المرجح أن يكون بروتوكول التربية الأسير المحدد المحدد هو الأكثر انطباقاً على البرامج التي تركز على الليكاينيدا الأخرى، أو الفئات ذات الصلة، أو الفئات الأصغر حجماً. ومع ذلك، يمكن القول إن العديد من المكونات مثل تلك التي تنطوي على تأمين المغازلة الناجحة والجماع، وصيانة البالغين بالرحيق الاصطناعي، وتعظيم السرقة، والرعاية العامة لليرقات يمكن تطبيقها على نطاق أوسع أو تكييفها مع مجموعة أوسع من الtaxa. وكما ذُكر آنفاً، فبينما ينبغي التشديد على مرونة البروتوكول، فإن الوصول إلى منهجيات أخرى راسخة يمكن أن يساعد على توفير رؤية قيمة ونقطة انطلاق قابلة للتطبيق للتكيف والابتكار. يمكن القول إن الأساليب المعروضة لتقييم خصائص تاريخ الحياة المختلفة مثل وقت تطور اليرقات وعدد ملعب اليرقات لها انطباق واسع النطاق على برامج التربية الأخرى للحفاظ على البيئة والتصنيف في خطر. ونشجع الآخرين على المساعدة في معالجة الثغرات الرئيسية في البيانات الإيكولوجية عندما يكون ذلك ممكنا، ونشر البروتوكولات ونتائج البرامج التي تم فحصها.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من مبادرة استعادة الحفاظ على البيئة التابعة لدائرة الأسماك والحياة البرية الأميركية (F17AP00467) وصندوق ديزني للحفاظ على البيئة. وقدم متحف فلوريدا للتاريخ الطبيعي وقسم علم الحشرات وعلم النماة في جامعة فلوريدا دعما إضافيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
- Thomas, J. A.
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402 (2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67 (2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
