Summary
Här presenterar vi protokoll för 1) laboratoriet fångenskap förökning av federalt hotade Miami blå fjäril(Cyclargus thomasi bethunebakeri), och 2) bedöma grundläggande livshistoria information såsom omogen utvecklingstid och antal larv stadia. Båda metoderna kan anpassas för användning med andra ex situ bevarande program.
Abstract
Att förbättra kunskapen om bästa praxis för utsatta fjärilar är viktigt för att generera framgångsrika bevarande- och återhämtningsprogramresultat. Forskning om sådana fångenskap populationer kan också ge värdefulla data för att ta itu med viktiga informationsluckor om beteende, livshistoria och ekologi av målet taxa. Vi beskriver ett protokoll för fångenskap förökning av federalt hotade Cyclargus thomasi bethunebakeri som kan användas som en modell för andra i riskzonen fjäril ex situ program, särskilt de i familjen Lycaenidae. Vi ger vidare ett enkelt och enkelt protokoll för registrering av olika mått i livshistoria som kan vara användbara för att informera ex situ-metoder samt anpassas för laboratoriestudier av andra lepidoptera.
Introduction
En växande lista över studier visar utbredda och allvarliga globala nedgångar i fjärilpopulationer1,2,3,4,5. Detta inkluderar de allra flesta riskarter. Bevarande program som syftar till att mildra sådana nedgångar använder ofta en blandning av strategier, inklusive befolkningsövervakning, livsmiljö förvaltning och restaurering, vetenskaplig forskning, fångenskap förökning, och organism flyttning6. Enbart inom USA och dess territorier anges totalt 30 fjärilstaxa enligt lagen om utrotningshotade arter (ESA) som antingen hotad eller hotad, och 21 av dessa har godkänt utkast eller slutliga återhämtningsplaner. För sådana taxa rekommenderar mer än hälften av de identifierade återhämtningsstrategierna att förökning av fångar eller uppger att förökning av fångenskap bör bedömas7. Användningen av ex situ bevarande insatser för fjärilar har ökat avsevärt under de senaste åren8,9, och har potential att vara ett kritiskt verktyg för att stödja återhämtninginsatser10. Många institutioner, organisationer och byråer är för närvarande involverade i ex situ insatser för minst 11 ESA-noterade fjäril taxa (dvs. Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, och Speryeria zerene hippolyta) och flera andra i riskzonen taxa (t.ex. Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, och Eumaeus atala)11. Trots antalet robusta och framgångsrika insatser, det finns fortfarande en brist på regelbunden kommunikation mellan program och mellan bevarande utövare som involverar utbyte av idéer, data, effektiva metoder och resultat. Sådan kunskapsdelning är viktigt eftersom det bidrar till att minimera dubblering av ansträngning, förbättrar övergripande bästa praxis, och förbättrar bevarande effekt. Få publicerade head-starting, fångenskap uppfödning, avel eller djurhållning protokoll är lätt tillgängliga för i riskzonen fjäril taxa, och de som ofta saknar tillräcklig berättelse detalj och / eller illustrationer. Dessa ger ofta mestadels sammanfattande detaljer med begränsade steg-för-steg-instruktioner och medföljande bilder, vilket gör replikering utmanande eller tillämpning till andra taxa svårt att bedöma12,13,14,15. Många av de tillgängliga protokollen är begränsade på något sätt: de finns endast i den grå litteraturen, eller i varierande detaljnivå, publikationsålder, eller som komponenter i symposiets förfaranden, byrå/finansiärrapporter, eller interna manualer16,17,18,19,20,21,22,23,24.
För de flesta bevarande program, fångenskap förökning utförs främst för att stödja bevarande flyttning, som omfattar återinförande, förstärkning (dvs. augmentation), och införande25,26. Sådan verksamhet är avsedd att genomföras strategiskt som en del av den övergripande återhämtningsstrategin för att förhindra utrotning av en förtecknad art, underart eller populationer. Det bör dock noteras att detta är en av flera andra potentiella roller som sådana ex situ program kan tjäna. Dessa kan också omfatta upprätthållande av en försäkring (dvs. refugia) befolkning, tillfällig organism räddning, stödja återhämtningsrelaterad forskning och / eller utbildning, och främja bevarande-relaterade utbildnings-och upplysningsinsatser27,28. Oavsett om ex situ program har ett enda definierat mål eller en blandning av flera, bevarande utövare bör maximera möjligheterna till datainsamling för att fylla i viktiga informationsluckor när det är möjligt. Detta är särskilt viktigt eftersom den stora majoriteten av risktaxa i allmänhet har studerats dåligt före betydande vilda befolkningsnedgångar. Den resulterande förbättrad kunskap som erhållits på olika beteendemässiga, ekologiska eller livshistoria aspekter av fokaltaxon kan bidra till att främja effektiv art bevarande och förvaltning29.
Här beskriver vi i detalj den fångenskap förökning protokoll som utvecklades för federalt hotade Miami blå fjäril(Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Kompletterande Figur 1) som en del av en större bevarande och återvinning program. I detta fall tjänar captive förökningsprogrammet tre specifika identifierade roller: 1) en försäkringspopulation om den befintliga vilda befolkningen går förlorad, 2) en forskningspopulation som är utformad för att fylla i identifierade ekologiska och livshistoria kunskapsluckor som kan bidra till att informera återhämtning och / eller förvaltning, och 3) att producera livskraftiga organismer för bevarande flyttning till platser inom taxon historiska intervallet. Det resulterande protokollet har väl kontrollerats och bevisats, efter att ha utnyttjats och förbättrats i över ett decennium. Följaktligen anser vi att de beskrivna teknikerna och metoderna representerar en livskraftig modell som kan tillämpas på eller lätt anpassas för andra ex-situ at-risk fjäril program, särskilt de som involverar Lycaenidae eller relaterade taxa. Även om vi inte föreslår att det beskrivna protokollet är överlägset andra, anser vi att det finns möjligheter att tillämpa några av metoderna mer allmänt för att bidra till att öka produktiviteten, vården eller effektiviteten. Detta gäller särskilt eftersom mycket av vår avel sker under inomhus laboratorieförhållanden med begränsat utrymme, liknande bevarande program med Euphydryas editha taylori och Speryeria zerene hippolyta17,23. Många andra protokoll använder ofta krukväxt material för oviposition eller larvuppfödning, vilket ibland kan leda till ökade komplexiteter relaterade till rovdjurskontroll, miljökontroll (dvs. luftfuktighet, temperatur), djurövervakning, datainsamling, växtskadedjursproblem och utrymme för att nämna några21,22. Slutligen beskrivs i det presenterade protokollet metoderna för uppfödning i fångenskap. Många andra i riskzonen fjäril bevarande program innebär head-start eller fångenskap uppfödning med representativa protokoll som återspeglar dessa skillnader. Även ofta mindre, känner vi att detta bidrar till att bredda den befintliga poolen av tillgänglig information för andra program att granska. Detta är kritiskt, eftersom de flesta ex situ program representerar banbrytande insatser för att underlätta återvinning av sällsynta och ofta dåligt studerade taxa. Tillgängliga protokoll kan fungera som en utmärkt utgångspunkt för att ge värdefull insikt, minska dubbelarbete och främja innovation. På grund av "den omfattande interspecifika mångfalden av fjäril beteenden, egenskaper livhistoria, och ekologiska krav i kombination med ofta markanta skillnader i programanläggningar, budgetar, utövare expertis" och andra inneboende skillnader, beroende av en enda metod, även för närbesläktade taxa, är ofta begränsande och omotiverade30. Flexibilitet att förfina eller utveckla nya protokoll anpassade till behoven hos specifika taxa eller program är avgörande för framgång och bör därför betonas. Vi beskriver dessutom laboratorietekniker för insamling av mått på organismutveckling under fångenskapsförhållanden, inklusive antalet larvinstars, varaktigheten av enskilda utvecklingsstadier, total utvecklingstid och larv- och pupallängd. Dessa tekniker har bred tillämplighet för studier av livshistoria av Lepidoptera som kan användas för att förfina ex situ protokoll eller informera fältdata.
Protocol
1. Säkra framgångsrika uppvaktning och parning av vuxna
- Efter lyckad eclosion, släpp livskraftiga vuxna fjärilar i en säker, walk-in, screenad flygbur som ligger i ett temperaturkontrollerat växthus(Kompletterande figur 2).
OBS: Vuxna kan märkas på vingarnas ventrala yta med permanenta bläckmarkörer om identifiering av specifika individer önskas för separation av genetiska linjer, lagerursprung eller för specifik datainsamling relaterad till organismlivslängd, beteende, Etc.- Medan de exakta burdimensionerna kan variera, se till att det finns gott om utrymme för att rymma tillräckligt nektar växtmaterial som krävs för att stödja tätheten av inrymt vuxna fjärilar och ge utrymme för en människa att fritt stå och pivot runt.
- Bortom temperaturreglering, se till att växthuset är säkert så att det kan ge ett andra lager av inneslutning tillsammans med skydd mot dåligt väder (t.ex. kraftigt regn, vind).
- Höj krukväxtväxtmaterial för krukväxt så att det inte finns mer än 30 cm utrymme från burens inre topp till de högst blommande blommorna (Kompletterande figur 2). Detta ger optimal tillgång till tillgängliga nektarresurser, erbjuder gott om vuxna sittpinnar och minimerar utomjordisk flygaktivitet.
- Placera en krukväxt i flygburen. Detta säkerställer att även om ett parat par missas kan alla resulterande ägg som läggs samlas in.
- Ge konsekvent luftflöde. Detta förbättrar uppvaktning verksamhet och parning framgång. I ett växthus inställning, fläktar och fasta montera cirkulationsfläktar används bäst för att förbättra ventilation och luftrörelse. Mindre bärbar ventilation, såsom box- eller skrivbordsfläktar, kan också användas.
- Upprätthålla den inre växthustemperaturen mellan 27 °C och 32 °C för att främja optimal vuxenaktivitet och parningsframgång. Temperaturen inuti buren övervakas med hjälp av en spårbar minnesövervakning termometer.
- Dimma den avskärmade flygburen regelbundet (cirka en gång varannan gång) med vatten med hjälp av en handpump, plasttankspruta eller trädgårdsslang.
- Samla försiktigt in enskilda parningspar från den avskärmade flygburen med en 50 dram klar plast snäpplock injektionsflaskor(Table of Materials),placera en till två par per injektionsflaskor, och transportera till ett inomhusuppfödningsrum eller laboratorium(kompletterande figur 3).
2. Maximera äggproduktionen
- Montera ovipositionkammare.
- Ta en 12 uns vanligt vitt papper kopp och med hjälp av en snap blad verktyg kniv, gör två horisontella nedskärningar på varje sida av koppen mittemot varandra. Varje snitt bör vara ca 1 cm under fälgen.
- Skär en enda bomullspinne på mitten och sätt in stångänden av varje i de två horisontella snitten på varje sida av papperskoppen så att bomullspinnedelen sträcker sig ca 2 cm mot koppens inre.
- Med hjälp av en snap blad verktyg kniv, gör två "X" skär i botten av papperskoppen. Varje diagonalt snitt bör vara ca 1 cm lång.
- Ta en 9 ounce plastkopp och fyll botten med ca 2 cm kranvatten.
- Placera en ny skärning, cirka 15 cm lång, av terminal larv värd växttillväxt i pappersmuggen genom att sätta in stammen genom en av "X" nedskärningar i botten. Tryck stammen genom snittet så att cirka 4-5 cm sticker ut botten.
- Placera pappersmuggen med värdmaterial i plastkoppen, se till att växtstammen är i vatten.
- Fyll en 1 ml sub-Q spruta (0,45 mm x 16 mm) med en smaksatt sportdryck och mätta både bomull svabbprover i papperskoppen. Dessa fungerar som konstgjorda blommor.
Obs: Melon och frukt punch smaksatt sportdryck ger det bästa nektar alternativet. - När varje parningspar separerar, placera 2-3 gravidhonor i den monterade koppkonfigurationen (dvs. ovipositionkammaren).
- Täck koppen med ett skärfyrkantigt fragment av svart tyll (ca 15 cm x 15 cm) och fäst den med ett gummiband runt locket (Kompletterande figur 4). Svart tyll ger den bästa insynen i koppen och enkel identifiering av alla ägg som ibland kan läggas på tyllen.
- Stimulera vuxen fjäril aktivitet och oviposition.
- Placera varje ovipositionkammare på en laboratoriebänk eller bord cirka 19 cm under en 8,5 tums klämma ljus med en aluminium reflektor rymmer en 40 W glödlampa (Kompletterande figur 5).
OBS: Glödlampan ger den strålande värme som krävs för att stimulera vuxenaktivitet och oviposition. - Placera en spårbar minnesövervakningstermometer intill lamporna och kör temperatursensorn så att den vilar ovanpå en ovipositionkammare som ligger direkt under ett klämljus.
OBS: Måltemperaturområdet är mellan 27,5 °C-29 °C. - Tillsätt extra klämlampor efter behov beroende på det totala antalet ovipositionella kammare utplacerade.
- Anslut klämljus i en programmerbar 15 Amp 24 h inomhus plug-in mekanisk timer med två uttag (programmerbara i 30 min tidsinställda intervall).
- Ställ in timer för att tända klämlampan i 30 minuters intervall (dvs. en repeterbar cykel på 30 min på, 30 min rabatt).
OBS: Denna ljuscykel hjälper till att maximera äggproduktionen genom att ge repeterbara perioder av belysning för att stimulera vuxen fjärilaktivitet och oviposition följt av korta mörka viloperioder. - Uppdatera bomullspinnarna i varje kopp med smaksatt sportdryck via sprutan under Q och dimma regelbundet med vatten med hjälp av en plastsprayflaska ungefär var 2-3 h eller efter behov.
OBS: Detta ger tillräcklig konstgjord nektar och fukt för att fjärilarna ska kunna frigöra foder efter behov. Det förbättrar därmed både vuxen livslängd och oviposition produktivitet under laboratorieförhållanden där levande, blommande växtmaterial inte lätt kan utnyttjas. - Övervaka koppar regelbundet och byt ut värdanläggningen med färska sticklingar efter behov.
- När äggen börjar kläckas eller tätheten av ägg blir hög, flytta honan (s) till en ny kopp med färsk värd och börja larver protokoll med nyfödda.
- Placera varje ovipositionkammare på en laboratoriebänk eller bord cirka 19 cm under en 8,5 tums klämma ljus med en aluminium reflektor rymmer en 40 W glödlampa (Kompletterande figur 5).
3. Larvalskötsel och underhåll
- Upprepa steg 2.3-2.6 för att montera koppar för larver.
- När ägg börjar kläckas, flytta värdväxtmaterial med ägg och nyfödda larver i en nymonterad kopp, placera stammen genom det andra "X" i botten och se till att växtstammen är i vatten och bladen vidrör intilliggande färsk värdskärning.
- När larver är unga (nyfödda-2 instar), kontrollera larv koppar dagligen för friskhet värd växtmaterial och förekomst av mögel eller överdriven fraser.
OBS: Dagligt avlägsnande av värdmaterial rekommenderas inte när larver är unga eftersom detta kan resultera i organismskada på grund av hantering och/eller onödigt avfall av färskt värdmaterial. - Om värdmaterial vissnat eller i på annat sätt dåligt skick, placera en annan skärning av färskt värdmaterial i koppen så att det vidrör befintligt bladverk och tillåter larver att flytta till den nya värden på egen hand.
- När larver når den3: e instar, ersätta pappersmugg och tillsätt färskt värdmaterial dagligen.
- Använd en liten kamel hår akvarell pensel för att försiktigt flytta larverna från det gamla värdmaterialet eller koppytan till färskt värdmaterial i den nya koppen.
- Placera det gamla värdmaterialet i en tom rektangulär förvaringsbehållare av plast.
- Upprepa steg 3.5-3.7 dagligen och tills alla koppar med larver har bearbetats.
- När du är klar, tillsätt en liten mängd färskt värdmaterial ovanpå växtavfallet i förvaringsbehållaren för livsmedel och placera löst ett lock ovanpå.
OBS: Detta fungerar som ett skydd om några larver förbises under daglig bearbetning eftersom de kommer att krypa på det nya värdmaterialet ovanpå växtavfallet och kan tas bort nästa dag. - Håll koppar under laboratorietemperatur mellan 25 °C-28 °C för optimal larvaktivitet och utveckling (Kompletterande figur 6).
OBS: För att nå optimala uppfödningstemperaturer under inomhusförhållanden är det ofta nödvändigt att placera koppar under klämljus med aluminiumreflektorer som rymmer 40 W glödlampor. Temperaturer kan sedan aktivt övervakas med hjälp av en spårbar minnesövervakning termometer och ljushöjden justeras för att nå optimala uppfödningsförhållanden.
4. Konstruera pupationskammaren
- Skär en enkel ansikte korrugerad papper rulle i lika storlek 3,8 cm x 3,8 cm rutor.
- Placera en kvadrat i en 2 ounce klar plast portion kopp.
- Placera koppen på en klar plastmugg(Kompletterande figur 7).
5. Förbereda larver för puppation
- Identifiera mogna larver redo att fasas ut under daglig kolonibearbetning.
OBS: Sådana larver kommer att vända en enhetlig matt grönbrun, förlora sina sparrar, och ofta vandra av värden. - Ta försiktigt bort varje mogen larv med en liten kamel hår akvarell pensel eller pincett och placera en i varje valpbildning kammare.
- Fäst det klara plastlocket ordentligt på valpkammaren.
- Upprepa steg 5.1-5.3 tills alla larver som är redo att fasa supat har överförts till pupationskammare som lägger till nya plastbrickor efter behov(kompletterande figur 8).
6. Upprätthålla pupae
- För varje bricka med pupationskammare, registrera datumet för första upphöjelse och all annan bestående information som behövs (dvs. genetisk linje, experimentell studie osv.).
- Organisera brickor efter datum och placera på en säker plats i laboratoriet (Kompletterande figur 8).
- Övervaka brickor dagligen för vuxen eclosion.
OBS: Laboratorieförhållanden som temperatur kommer starkt att påverka utvecklingstiden. - Innan vuxen eclosion (vanligtvis inom 10 dagar efter första valpbildning), ta bort locken från enskilda puppationskammare och placera brickan i en 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm hopfällbar mesh pop-up uppfödningbur(Kompletterande figur 9).
OBS: Pupae säkert fäst inom spåren av korrugerade pappersrutor underlätta framgångsrik vuxen eclosion(Kompletterande figur 10). - Upprepa hela protokollet från steg 1.1 för den efterföljande fången generationen.
7. Bedömning av utvecklingstiden för omogna stadier och antalet
- Placera en enda larva under ett dissekerande mikroskop. Använd en liten kamel hår akvarell pensel för att noggrant flytta och isolera larver för att undvika skador på organismen.
- Doppa ett enda hår av penseln i giftfri ljusfärg(Table of Materials),och försiktigt sätta en liten droppe färg på baksidan (dorsum) av larven. Använd en färgfärg som sticker ut från larvens bakgrundsfärg och mönsterfärg (Kompletterande figur 11). Var noga med att undvika att placera färg på huvudet på larven.
- När färgen torkar (ca 30 s eller så), placera varje enskild larva i sin egen 2 uns klar plast portion kopp som innehåller cirka 1-3 små blad av färskt terminal värdmaterial och skriva en unik identifierare på koppen och locket (Kompletterande figur 12).
- Kontrollera noggrant varje larv dagligen. Ta bort löv och ställ in på vit yta. Inspektera kopp, klart lock och undersöka löv under ett dissekerande mikroskop för förekomst av larv exuviae (gjutna skinn) och/eller huvudkapslar.
- Om en larv exuvia hittas, ta bort den från koppen och placera den i ett mikrocentrifugrör märkt med motsvarande koppnummer och datum (se steg 8.1-8.6. nedan).
- Måla om larver efter varje smält och spela in smältdatum.
- Mät den totala kroppslängden (huvud till sista buksegmentet) för varje larv dagligen med hjälp av digitala bromsok. Ta tre mätningar och registrera genomsnittet av de tre, tillsammans med datum och tid. För tidiga instarlarver bör ett förstoringsglas eller dissekerande räckvidd användas vid mätning för att säkerställa korrekta mätningar.
- Returnera larven till motsvarande plast portion kopp.
- Lägg till färskt värdmaterial efter behov och ta bort alla frass och gamla värdskräp. Om mögel finns i koppen, avyttra och använda en ny kopp. Skriv rätt unikt identifieringsnummer på den nya koppen.
- Upprepa steg 7.5-7.9 tills alla larver når sin sista instar och påbörja prepupalstadiet. När larver upphör att mata, vrid en enhetlig matt grönbrun färg, förlora sina sparrar, och ofta vandra av värden, minimera störande dem.
- Placera en liten bit korrugerad papper i koppen (se steg 4.1).
- När varje larva har helt pupated, mäta sin totala längd som i steg 7,8 ovan och registrera datum för pupation. Detta kommer att vara den sista smält av varje individ.
- Kontrollera pupae dagligen och registrera eclosion datum och kön för varje resulterande vuxen fjäril.
- Mät vingackordlängden på varje fjäril med hjälp av digitala bromsok. Fjärilar kan försiktigt hållas med pincett för mätning. Om fjärilen är för aktiv för att enkelt mäta, tillfälligt placera den i kylskåp för 30 s eller mindre och försök igen.
8. Samla larv exuviae
- När en larv exuvia observeras, fyll ett mikrocentrifugrör med 0,2 μl glycerin. Märk lockets ovansida och sidan med larven-numret, datum för smält och huvudkapsel (H.C.).
OBS: Larverna av vissa lepidopteran larver regelbundet konsumerar sin exuviae men huvudet kapseln bör förbli. - Placera larv exuvia och tillhörande huvud kapsel i en klar plast del kopp lock och sätta ett par droppar etanol i den.
- Undersök larv exuvia under ett dissekerande mikroskop genom att placera den i en klar plast del kopp lock och sätta några droppar etanol på den. Om larvhuvudkapseln redan är skild från exuvia, placera en droppe glycerin på spetsen av spetsiga entomologiska pincett och rör försiktigt huvudkapseln till glycerinen. Placera huvudkapseln i det tillhörande mikrocentrifugröret.
- Om huvudkapseln fortfarande är fäst vid larvexuvia, använd spetsiga pincett och en insektsnål för att separera huvudkapseln från larvexuvia.
- När den är separerad, använd glycerintekniken för att plocka upp huvudkapseln. Om det finns för mycket etanol, kan du använda en liten pappershandduk för att ta bort några, men var noga med att inte av misstag ta bort huvudet kapseln.
- Placera huvudkapseln i en märkt glycerinfylld injektionsflaskan och stäng locket ordentligt.
Representative Results
Under loppet av två separata bevarandeinitiativ som var inriktade på återvinning av Cyclargus Thomasi bethunebakeri från februari 2003 till december 2010 och från november 2016 till nutid användes detta protokoll för att framgångsrikt producera ett överskott på 51 052 livskraftiga organismer. Baserat på den ettåriga sammanfattningen av den totala produktiviteten i fångenskap från juni 2018 till juni 2019 producerades totalt 10 166 livskraftiga organismer, vilket motsvarar 782,00 ± 118,93 organismer per månad över 13 generationer. På samma sätt var den totala äggproduktionen per hona under laboratorieförhållanden 114,00 ± 26,12 (n = 12)31. Den resulterande betydande organism produktivitet rankas detta program bland de största sådana ex situ insatser i USA, tillsammans med euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, och Lycaeides melissa samuelis24. En del av denna produktivitet kan hänföras till det faktum att fjärilen kontinuerligt ruvade, producerar en generation ungefär var 4-6 veckor i fångenskap. Majoriteten av andra bevarande avelsprogram innebär taxa som är univoltin e eller bivoltin. Icke desto mindre, även för program som omfattar extremt fecund taxa såsom Speyeria spp., det totala antalet livskraftiga organismer som produceras för bevarande flyttning på årsbasis sällan överstiger några tusen32. Följaktligen har vår fångenskap befolkningen möjliggjort riktad forskning och omfattande datainsamling om många viktiga dataluckor viktigt att förbättra bästa laboratorieavel och djurhållning praxis(figur 1)samt bidra till att informera återhämtning och förvaltningsbeslut.
Medelvärdet för total utvecklingstid från nyfödda larv till vuxen var 28,63 dagar(tabell 1). Majoriteten av larverna hade fyra molts (figur 2, figur 3), även om två hade fem molts, och en hade sex molts. Den totala medellängden för alla larvinstars var 5,97 mm, och larverna var störst i de fjärde och prepupal livsstadierna (Tabell 1). När endast variabler med mer än 30 observationer, den kortaste tiden spenderades i de första instar och prepupal stadier, och den längsta spenderades som pupae(tabell 1, figur 2). Honor utvecklades vanligtvis snabbare i alla omogna stadier jämfört med män, även om detta inte var en betydande effekt (p = 0,625). Statistiska analyser utfördes med RStudio Version 1.1.463 (R Core Team 2016)33. Den genomsnittliga vuxna vingackordlängden var 12,64 mm (Tabell 2), och det fanns en betydande skillnad mellan könen (p = 0,047). Det dubbelsidiga t-testet kördes för att utvärdera vingackordsskillnaden mellan könen. Linjär regressionsmodell och stegvis regression för genomsnittlig längd av varje livsskede visade att pupallängd var den bästa prediktorför vuxna vingackordlängd (Tabell 3, Tabell 4). Regressionsmodeller för utvecklingstid visade att antalet dagar som tillbringas i den andra och fjärde instars och det totala antalet dagar var de bästa prediktorerna för vuxna vinge ackord längd, men endast antalet dagar i fjärde instar var betydande (Tabell 5, Tabell 6). Eftersom variablerna var kontinuerliga, två linjära regressionmodeller kördes för utvecklingstiden för varje livarrangerar, as well as längden av varje liv arrangerar, med vuxen påskyndar ackordlängd som den beroende variabeln. Stegvis regressioner kördes på båda regressionsmodellerna för att bestämma de bästa prediktorerna för vuxna vingackordlängd.
Kompletterande figur 1: Fästa exemplar av vuxna Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A)Vuxen man, dorsala (vänster), ventral (höger). (B)Vuxen hona, dorsala (vänster), ventral (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: Skärmad flygbur inrymt i temperaturstyrt växthus. (A)Interiör en växt med krukväxter och en enda krukväxt. (B)Metallhyllor hjälper till att höja krukväxter nektar växter så att det inte finns mer än 30 cm utrymme från den inre toppen av buren till de högsta blommande blommor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Förfarande för insamling av vuxna par i copula. (A)Parning par vuxna Cyclargus Thomasi bethunebakeri inuti den avskärmade flygburen (kvinna, höger och manlig, vänster). (B)Parningspar som samlats in från flygburen i snapcapflaskor och förs in i laboratoriet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: Förfarande för montering av ovipositionskammare. (A)Två koppsystem med terminalvärdmaterial och bomullspinnar. (B)En 1 ml sub-Q spruta (0,45 mm x 16 mm) med smaksatt sportdryck mätta bomull svabbprover i papperskoppen. (C)Koppar bostäder gravid honor säkrade med svart tyll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 5: Laboratorieinställning för att maximera äggproduktionen. (A)Oviposition kammare placeras på en laboratoriebänk under en klämma ljus med en 40 W glödlampa. (B)En spårbar minnesövervakningstermometer placeras intill lamporna med temperatursensorn vilande ovanpå en ovipositionskammare som ligger direkt under en klämlampa. (C)En 1 ml sub-Q spruta och liten bägare håller smaksatt sportdryck placeras intill oviposition kamrarna för att underlätta uppfriskande bomull svabbprover regelbundet hela dagen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 6: Laboratorieinställning för larvskötsel och underhåll. (A)Två koppsystem med var och en innehåller färskt terminalvärdmaterial och larver. (B)Temperaturen i kopparna bibehålls mellan 25 °C-28 °C för optimal larvaktivitet och utveckling genom takklämljus med 40 W glödlampor. (C)En spårbar minnesövervakningstermometer med temperatursensorn placerad direkt i en kopp används för att övervaka temperaturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 7: Beredda pupationskammare. (A)Enskilda plastportionkoppar inrymda på de klara plastmuggarna. (B)En wellpappruta placeras i varje plastportionkopp. (C)En enda mogen larv kommer att placeras i varje beredd plast portion kopp för att fasa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 8: Förbereda larver för puppation och pupal underhåll. (A)Mogen larv redo att fasa på wellpapp. Det är en enhetlig tråkig grönbrun och har förlorat några sparrar. (B)Puppingskammare redo att ta emot mogna larver intill koppar med matningav larver. Alla pupationkammare med lockhuslarver som förbereder sig för att fasa ut. (C)Pupation kammare med puppae. D)Banker av pupationskammare med pupae som anordnas efter datum och upprätthålls under laboratorieförhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 9: Laboratorieuppkomstbur. A)En hopfällbar näthopningsbur som rymmer de ockuperade pupationkamrarna. (B)Locken för alla pupationskammare avlägsnas för att underlätta framgångsrik vuxeneclosion. (C)Alla resulterande livskraftiga vuxna fjärilar kommer att släppas ut i den avskärmade flygburen för att säkra framgångsrik koulation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 10: Vuxen manlig fjäril som framgångsrikt avsäger sig puppa på en korrugerad papperskvadrat. (A)Vuxen som avsäger sig pupa. (B)Vuxen helt bort från pupalhöljet. (C)Vuxen placerad för att expandera sina vingar. (D)Vuxen som utökar sina vingar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 11: Femte instar larven märkt med giftfri ljusfärg. (A)En liten droppe kontrasterande röd, giftfri ljusfärg placeras på dorsum med hjälp av en pensel för att framgångsrikt markera larven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 12: Uppfödning set-up för livshistoria studie. (A)Unikt märkta 2 uns klar plast portion koppar. (B)En enda larv binds i varje kopp. (C)Alla larver spåras individuellt genom alla utvecklingsstadier från nyfödda till vuxen fjäril. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 1: Antal registrerade par i copula baserat på temperatur (°C) inom en walk-in, screenad flygbur inrymt i ett temperaturkontrollerat växthus. Temperaturen registrerades inom de första 2 min en lyckad parkopplingshändelse (n = 411). De resulterande uppgifterna användes för att förfina de kontrollerade miljöförhållandena för att maximera parningsframgången och slutligen den totala produktivitet för insamling av fångenskap. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Genomsnittlig utvecklingstid (antal dagar) för varje omogen livsfas. (A)Staplar visar medelvärdet för varje grupp, och felfält representerar de övre och nedre standardavvikelsevärdena för varje grupp. (B)Mörkblå barer representerar honor, och ljusblå representerar män. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Huvudkapslar som samlats in från enskilda #25 med hjälp av livshistorikprotokoll. Huvudkapslar fotograferades av Johnathan Bremer med hjälp av ett automontagesystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Livet skede | Genomsnittlig kroppslängd (mm) | Std. Fel (längd) | Genomsnittlig utvecklingstid (num. dagar) | Std. Fel (si.m. tid) |
| Instar I | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2,90625 (n=32) | 0.08229783 |
| Instar II | 2,77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| Instar III | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| Instar IV | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| Instar V | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| Instar VI | 10.2666667 (n=1) | Na | 3 (n=1) | Na |
| Pre-pupa | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2,9375 (n=32) | 0.21504641 |
| Puppa | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
Tabell 1: Genomsnittlig längd och utvecklingstid för varje livsfas. Standardfel som ingår för varje variabel och exempelstorlek inom parentes.
| Livet skede | Genomsnittlig vingackordlängd (mm) | Std. Fel |
| Vuxen | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| Kvinna | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| Manliga | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
Tabell 2: Genomsnittlig förvingning vingackordlängd för vuxna fjärilar. Inkluderar medel för kvinnor, män och alla vuxna (båda könen tillsammans).
| LM Modell 1 | Fel på uppskattningen | t värde | p-värde |
| Avlyssna | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| Genomsnittlig längd andra instar | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| Genomsnittlig längd tredje instar | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| Genomsnittlig längd fjärde instar | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| Genomsnittlig längd pupae | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabell 3: Koefficienter tabell för linjär regression modell (LM Model 1) för att utvärdera förhållandet mellan genomsnittlig längd för varje livsstadium (n > 30 ingår i analys) och vuxna vinge ackord längd. Beroende variabel: vuxen vinge ackord längd (mm).
| Koefficienter | Fel på uppskattningen | t värde | Pr (>|t|) |
| Avlyssna | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| Genomsnittlig längd pupae | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
Tabell 4: Stegvis regression (Stegvis 1). Beroende variabel: vuxen vinge ackord längd (mm).
| LM Modell 2 | Fel på uppskattningen | t värde | p-värde |
| Avlyssna | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Num. dagar första instar | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Num. dagar andra instar | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Num. dagar tredje instar | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Num. dagar fjärde instar | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. dagar före pupae | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| Num. dagar pupae | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| Totalt antal dagar | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabell 5: Koefficienter tabell för linjär regression modell (LM Model 2) för att utvärdera förhållandet mellan utvecklingstid och vuxna vinge ackord längd. Beroende variabel: vuxen vinge ackord längd (mm).
| Koefficienter | Fel på uppskattningen | t värde | p-värde |
| Avlyssna | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Num. dagar andra instar | 0.17974 | -1.809 | 0,0811 • |
| Num. dagar fjärde instar | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| Totalt antal dagar | 0.04184 | -1.787 | 0,0848 • |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05; • p < 0,1 | |||
Tabell 6: Stegvis regression (Stepwise 2) för utvecklingstid. Beroende variabel: vuxen vinge ackord längd (mm).
Discussion
Här illustrerar vi effektiviteten i detta beprövade ex situ bevarande avelsprotokoll för massproduktion av riskfjärilar, och hur det kan anpassas för vetenskaplig forskning för att hjälpa till att ta itu med viktiga beteendemässiga, livshistoria eller ekologiska dataluckor. Ökad förståelse för genomsnittlig total utvecklingstid (ägg till vuxen), genomsnittlig varaktighet i varje livsstadium, och optimal temperatur för parning, till exempel, användes för att förfina protokollet och förbättra den totala programframgången. De allra flesta befintliga protokoll detalj endast organism makery metoder och inte diskutera datainsamling, vetenskaplig forskning, eller användning av sådana resultat för att informera och potentiellt anpassa ex situ metoder.
Detta protokoll kräver daglig organism hållning. Organismhälsa och produktivitet maximeras genom rena uppfödningsförhållanden, brist på överbeläggning av organismer och tillgången på läromedel av hög kvalitet. För det mesta använder vi engångsuppfödning s. material och plastmuggar) och byter vanligtvis ut dem regelbundet, ofta dagligen och återanvänder aldrig materialet. Detta är både kostnadseffektivt och minimerar behovet av mer arbetsintensiv sanitet av material. Vanliga verktyg, såsom entomologiska pincett, akvarell färgborstar och små pop-up flygburar, liksom alla uppfödningsytor såsom bordsskivor och laboratoriebänktoppar saneraderegelbundet med en 5% blekmedelslösning. Det exakta schemat för sanitet är starkt beroende av frekvensen av användning, organismfenologi och andra variabler, och bör skräddarsys för de specifika behoven hos varje ex situ program. Vi tycker dessutom att vitt slaktarpapper är användbart för att täcka alla uppfödningsytor. Det ger ett billigt, lätt driftsättbart rent substrat, och den vita bakgrundsfärgen underlättar observation av alla herrelösa organismer. För daglig djurhållning bör all laboratoriepersonal alltid bära engångshandskar för laboratorieprov för att minimera kontaminering och skydda personalen från eventuell hudirritation till följd av växt- eller organismhantering. Detta är särskilt viktigt om någon laboratoriepersonal har hushållshusdjur som kräver aktuella loppbehandlingar. Även en liten mängd aktiva ingrediensrester kan vara farliga för djur i fångenskap.
Dessutom bör försiktighet iakttas för att minimera organismöverbeläggning. Överbeläggning av larver kan snabbt leda till minskad organismhälsa och till och med kannibalism i vissa taxa, särskilt Lycaenidae. Regelbundet separera larver för att minska antalet i uppfödningbehållare och/eller till och med isolera enskilda larver enligt beskrivningen i livhistorikdelen av protokollet kan vara nödvändigt. De idealiska siffrorna per behållare kan variera avsevärt beroende på de särskilda taxon och olika begränsningar ex situ program såsom tillgänglig budget, laboratorieanläggningar, och totalt antal djurhållningpersonal. Vi rekommenderar också att lämna tillräckligt med utrymme mellan koppar bostäder larver för att minimera potentialen hos organismrörelser mellan behållare. Slutligen, för större fångenskap populationer, rekommenderas det starkt att skilja lager mellan en eller flera laboratorieanläggningar. Denna skyddsstrategi kan bidra till att minimera katastrofal förlust av hela befolkningen på grund av sjukdom eller andra oförutsedda effekter.
Larval värd växtkvalitet och tillgänglighet driver djurproduktion och starkt påverkar både larv utvecklingstakt och övergripande befolkningens hälsa. Icke desto mindre, få publicerade rapporter eller studier belysa denna backstage krav eller diskutera bästa plantskola praxis. Framgångsrik ex situ-programplanering måste stå för lämpliga växtkvantiteter, produktion och underhåll. Eftersom många larver också kräver eller föredrar vissa växtdelar (t.ex. slutlig ny tillväxt, blomknoppar och blomställningar, frukt osv.), effektiv iscensättning för att säkerställa att lämplig växtfenologi krävs.
Ytterligare överväganden inkluderar lämplig demografisk och genetisk förvaltning, och minimering av eventuella negativa effekter av fångenskap. Vi rekommenderar att man tar ut en genetisk förvaltningsplan. Detta kan omfatta strategier för att inkludera infusion av nytt genetiskt material regelbundet, maximera mångfalden och förhindra nära inavel, regelbundet utvärdera viktiga organism fitness variabler, och övervaka genetik på någon nivå för att möjliggöra jämförelse med befintliga populationer och kontrollera fångenskap lager hälsa. Periodisk jämförelse av egenskaperna hos fångenskap individer till individer från grundande tandpopulationer är också motiverat34,35.
Dessa protokoll representerar beprövade bästa praxis. De bör vara till nytta för en mängd olika forskare och bevarande utövare som direkt kan tillämpa eller anpassa våra metoder till sina egna studier och ex situ i riskzonen fjäril eller insekt bevarande och återhämtning program. Det särskilda riktlinjerna för uppfödning av fångenskap är sannolikt mest tillämpligt på program som är inriktade på andra Lycaenidae, relaterade taxa eller taxa av mindre storlek. Icke desto mindre, många komponenter såsom de som innebär att säkra framgångsrik uppvaktning och copulation, vuxen underhåll med konstgjorda nektar, maximera oviposition, och allmän larv vård kan utan tvekan tillämpas mer allmänt eller anpassas till en bredare array taxa. Som tidigare nämnts, medan protokollflexibilitet bör betonas, kan tillgång till andra etablerade metoder bidra till att ge värdefull insikt och en livskraftig utgångspunkt för anpassning och innovation. De metoder som presenteras för att bedöma olika egenskaper livshistoria såsom larv utvecklingstid och antalet larv stadia har utan tvekan bred tillämplighet på andra bevarande avelsprogram och risktaxa. Vi uppmuntrar andra att hjälpa till att åtgärda viktiga ekologiska dataluckor när det är möjligt och att publicera granskade protokoll och programresultat.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från US Fish and Wildlife Service's Conservation Recovery Initiative (F17AP00467) och Disney Conservation Fund. Ytterligare stöd tillhandahölls av Florida Museum of Natural History och Institutionen för entomologi och nematologi vid University of Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
- Thomas, J. A. Butterfly communities under threat. Science. 352 (6296), 216-218 (2016).
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402 (2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67 (2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
