Summary
여기서, 우리는 1) 연방 멸종 위기에 처한 마이애미 블루 나비(Cyclargus thomasi bethunebakeri)의실험실 포로 전파에 대한 프로토콜을 제시하고, 2) 미숙한 발달 시간 및 애벌레 스타디아의 수와 같은 기본적인 생활 역사 정보를 평가. 두 방법 모두 다른 ex situ 보존 프로그램과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다.
Abstract
위험에 처한 나비에 대한 ex situ 모범 사례에 대한 지식을 개선하는 것은 성공적인 보존 및 복구 프로그램 결과를 생성하는 데 중요합니다. 이러한 포로 집단에 대한 연구는 또한 대상 taxa의 행동, 생활 역사 및 생태에 대한 주요 정보 격차를 해결하기 위해 귀중한 데이터를 산출 할 수 있습니다. 우리는 다른 위험에 처한 나비 ex situ 프로그램, 특히 가족 Lycaenidae에 있는 모형으로 사용될 수 있는 연방 멸종 위기에 처한 Cyclargus 토마시 bethunebakeri의 포로 전파를 위한 프로토콜을 기술합니다. 우리는 또한 다른 lepidoptera의실험실 연구 결과를 위해 적응뿐만 아니라 전 시투 방법론을 알리는 데 유용 할 수있는 다양한 수명 기록 메트릭을 기록하기위한 간단하고 간단한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
연구의 성장 목록은 나비 인구에 광범위하고 심각한 글로벌 감소를 나타냅니다1,2,3,4,5. 이것은 위험한 종의 대다수를 포함합니다. 이러한 쇠퇴를 완화하기 위해 고안된 보존 프로그램은 종종 인구 모니터링, 서식지 관리 및 복원, 과학 연구, 포로 전파 및 유기체 전좌6을포함한 다양한 전략을 사용합니다. 미국과 그 영토 내에서만 총 30개의 나비 택시가 멸종 위기 종법(ESA)에 따라 멸종 위기에 처해 있으며, 이 중 21개는 초안 또는 최종 복구 계획을 승인했습니다. 이러한 taxa의 경우, 확인 된 복구 전략의 절반 이상은 포로 전파 또는 포로 전파를 평가해야한다고 상태를권장7. 나비에 대한 전 의 situ 보존 노력의 사용은 최근 몇 년 동안 상당히 성장하고있다8,9,복구 노력을 돕기 위해 중요한 도구가 될 수있는 잠재력을 가지고10. 수많은 기관, 단체 및 기관은 현재 적어도 11 ESA 상장 나비 택시 (즉, 사이클라거스 토마시 bethunebakeri, 유피 드리아스 편집기노, 유피 드리아스 editha 테일러리, 헤라클리드 아리스토데무스, 헤스페리아 다코테, 리카이데스 멜리사 사무엘리스, 오아시스마 포웨시에크, 피르구스 라구나에, 스페리에리아 제렌 히폴리타등 여러 위험 에 위험 세금(예: 캘로프드리스 아이루스, 유트리아스 페리아스 페리아스) 유마에우스 아탈라)11. 강력하고 성공적인 노력의 수에도 불구하고, 아이디어, 데이터, 효과적인 방법론 및 결과의 교환과 관련된 보존 실무자 들 간의 프로그램 전반에 걸쳐 정기적 인 의사 소통이 부족합니다. 이러한 지식 공유는 노력의 중복을 최소화하고 전반적인 모범 사례를 개선하며 보존 에 미치는 영향을 향상시키는 데 도움이 되기 때문에 필수적입니다. 몇몇 게시 된 머리 시작, 포로 사육, 사육, 또는 축산 프로토콜은 위험에 처한 나비 taxa에 쉽게 사용할 수 있습니다, 종종 충분한 이야기 세부 사항 및 / 또는 그림이 부족한 사람들. 이들은 종종 제한된 단계별 지침 및 동반 된 이미지와 함께 주로 요약 세부 사항을 제공하므로복제가어렵거나 다른 taxa에 적용하기 어렵고12,13,14,15. 사용 가능한 프로토콜의 대부분은 어떤 식으로든 제한됩니다 : 그들은 회색 문헌에 만 존재, 또는 세부 사항의 다양한 수준에 존재, 출판 의 나이, 또는 심포지엄 절차의 구성 요소 부분으로, 기관 / 원더 보고서, 또는 사내 매뉴얼16,17,18,19,20,21,22,23,24.
대부분의 보존 프로그램의 경우, 포로 전파는 주로 재도입, 보강(즉, 증강) 및 도입25,26을포함하는 보존 전좌를 지원하기 위해 수행된다. 이러한 활동은 나열된 종, 아종 또는 인구의 멸종을 방지하기 위해 전체 복구 전략의 구성 요소로 전략적으로 구현하기위한 것입니다. 그러나 이러한 ex situ 프로그램이 제공할 수 있는 몇 가지 다른 잠재적 역할 중 하나라는 점에 유의해야 합니다. 이들은 또한 보험 (즉, refugia) 인구를 유지, 임시 유기체 구조, 복구 관련 연구 및 / 또는 훈련을 지원하고, 보존 관련 교육 및 인식 노력을 촉진 포함 할 수있다27,28. ex situ 프로그램이 단일 정의된 목표가 있는지 또는 여러 가지 목표를 혼합했는지여부에 관계없이 보존 실무자는 가능한 경우 주요 정보 격차를 채우기 위해 데이터 수집 기회를 극대화해야 합니다. 이것은 특히 중요 한 때문에 위험에 노출 된 taxa의 대부분은 일반적으로 제대로 공부 하기 전에 상당한 야생 인구 감소. 그 결과 초점 분류의 다양한 행동, 생태학적 또는 삶의 역사 측면에 대한 향상된 지식이 효과적인 종 보존 및 관리를 발전시키는 데 도움이 될 수 있다29.
여기서, 우리는 연방 멸종 위기에 처한 마이애미 블루 나비(Cyclargus thomasi bethunebakeri)를위해 개발 된 포로 전파 프로토콜을 자세히 설명합니다(보충 그림 1)더 큰 보존 및 복구 프로그램의 일환으로. 이 경우, 포로 전파 프로그램은 세 가지 특정 식별 된 역할을 제공합니다: 1) 기존 야생 인구를 잃어야 보험 인구, 2) 복구 및 / 또는 관리를 알리는 데 도움이 될 수있는 식별 된 생태 및 생활 역사 지식 격차를 채우기 위해 설계된 연구 인구, 3) 분류의 역사적 범위 내에서 사이트로 보존을위한 실행 가능한 유기체를 생산합니다. 그 결과 프로토콜은 10년 이상 활용되고 개선되어 검증되고 입증되었습니다. 따라서, 우리는 설명된 기술 및 방법론이 다른 전 현장에 위험에 처한 나비 프로그램, 특히 Lycaenidae 또는 관련 세금과 관련된 프로그램에 적용하거나 쉽게 적응할 수 있는 실행 가능한 모델을 나타낸다고 생각합니다. 설명된 프로토콜이 다른 프로토콜보다 우수하다고 제안하지는 않지만 생산성, 관리 또는 효율성을 향상시키는 데 도움이 되는 몇 가지 방법을 보다 광범위하게 적용할 수 있는 기회가 있다고 생각합니다. 이것은 우리의 번식의 대부분이 유피 드리아스 editha 테일러리 와 Speryeria zerene 히폴리타17,23을포함하는 보존 프로그램과 유사한 제한된 공간과 실내 실험실 조건에서 수행되기 때문에 특히 사실이다. 수많은 다른 프로토콜은 종종 육식 동물 제어, 환경 제어 (즉, 습도, 온도), 가축 모니터링, 데이터 수집, 식물 해충 문제 및 몇 가지 이름을 공간과 관련된 증가 복잡성으로 이어질 수있는 oviposition 또는 애벌레 사육을위한 화분 물질을활용, 21,22. 마지막으로, 제시된 프로토콜은 포로 사육 방법을 간략하게 설명합니다. 위험에 처한 다른 많은 나비 보존 프로그램은 이러한 차이를 반영하는 대표적인 프로토콜을 통해 머리 시작 또는 포로 사육을 포함합니다. 종종 사소한, 우리는이 다른 프로그램이 검토 할 수있는 사용 가능한 정보의 기존 풀을 확대하는 데 도움이 있다고 생각합니다. 대부분의 ex situ 프로그램은 희귀하고 종종 제대로 연구되지 않은 taxa의 복구를 촉진하는 데 도움이되는 선구적인 노력을 나타내기 때문에 이것은 중요합니다. 사용 가능한 프로토콜은 귀중한 통찰력을 제공하고, 노력의 중복을 줄이며, 혁신을 촉진하는 데 도움이 되는 훌륭한 출발점이 될 수 있습니다. "나비 행동의 광범위한 상호 다양성, 삶의 역사 특성, 생태 학적 요구 사항 프로그램 시설, 예산, 실무자 전문 지식의 종종 현저한 차이와 결합" 및 기타 고유의 차이로 인해, 심지어 밀접하게 관련된 taxa에 대한 단일 방법론에 의존, 종종 제한하고 부당한30. 특정 taxa 또는 프로그램의 요구에 맞는 새로운 프로토콜을 구체화하거나 개발할 수 있는 유연성은 성공에 필수적이므로 강조해야 합니다. 우리는 또한 애벌레 instars의 수, 개별 발달 단계의 기간, 총 발달 시간 및 애벌레와 pupal 길이를 포함하여 포로 조건 하에서 유기체 발달에 대한 메트릭을 수집하기위한 실험실 기술을 설명합니다. 이러한 기술은 ex situ 프로토콜을 구체화하거나 현장 데이터를 알리는 데 사용할 수 있는 Lepidoptera의 수명 역사 연구에 대한 광범위한 적용 가능성을 가지고 있습니다.
Protocol
1. 성공적인 성인 구애 및 짝짓기 확보
- 성공적인 에로션에 이어, 온도 제어 온실에 위치한 안전한 워크인, 스크리니드 비행 케이지에 실행 가능한 성인 나비를 풀어 놓습니다(보충 그림 2).
참고 : 특정 개인의 식별이 유전 라인, 재고 기원, 또는 유기체 수명, 행동과 관련된 특정 데이터 수집을 위해 원하는 경우 성인은 영구 잉크 마커와 날개의 복부 표면에 표시 할 수 있습니다, 등.- 정확한 케이지 치수는 다를 수 있지만, 수용 된 성인 나비의 밀도를 지원하고 인간이 자유롭게 서서 회전 할 수있는 공간을 제공하는 데 필요한 적절한 꿀 식물 재료를 수용 할 수있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
- 온도 조절 을 넘어, 온실이 악천후 (예 : 폭우, 바람)로부터 보호와 함께 봉쇄의 두 번째 층을 제공 할 수 있도록 안전해야합니다.
- 화분에 심은 꿀 식물 재료를 들어 올리면 케이지 의 내부 상단에서 가장 높은 꽃까지 30cm 이하의 공간이 없습니다(보조 그림 2). 이를 통해 사용 가능한 꿀 자원에 대한 최적의 액세스를 제공하고 충분한 성인 농어를 제공하며 불필요한 비행 활동을 최소화합니다.
- 비행 케이지에 화분에 심은 호스트 식물 하나를 놓습니다. 이렇게 하면 짝을 이은 쌍을 놓치더라도 낳은 계란을 수집할 수 있습니다.
- 일관된 공기 흐름을 제공합니다. 이것은 구애 활동과 짝짓기 성공을 향상시킵니다. 온실 환경에서는 송풍기와 고정 마운트 순환 팬이 환기 및 공기 이동을 향상시키는 데 가장 적합합니다. 박스 나 책상 선풍기와 같은 작은 휴대용 환기도 사용할 수 있습니다.
- 최적의 성인 활동과 짝짓기 성공을 촉진하기 위해 27 °C와 32 °C 사이의 내부 온실 온도를 유지하십시오. 케이지 내부의 온도는 추적 가능한 메모리 모니터링 온도계를 사용하여 모니터링됩니다.
- 핸드 펌프, 플라스틱 탱크 분무기 또는 정원 호스를 사용하여 물로 정기적으로 (약 2 시간마다 한 번) 상영 비행 케이지를 안개.
- 50 드램 클리어 플라스틱 스냅 캡바이알(표)을사용하여 스크리닝된 비행 케이지에서 개별 짝짓기 쌍을 부드럽게 수집하고, 바이알당 1~2쌍을 배치하고, 실내 사육실 또는 실험실로 이송한다(부가세도3).
2. 계란 생산 극대화
- oviposition 챔버를 조립합니다.
- 12 온스 일반 흰색 종이 컵을 가지고 스냅 블레이드 유틸리티 나이프를 사용하여, 서로 건너 컵의 양쪽에 두 개의 수평 컷을합니다. 각 절단은 림 아래 약 1cm이어야 합니다.
- 단일 면봉을 반으로 자르고 종이 컵의 양쪽에 있는 두 개의 수평 컷에 각각의 막대 끝을 삽입하여 면봉 부분이 컵 내부쪽으로 약 2cm 확장되도록 합니다.
- 스냅 블레이드 유틸리티 나이프를 사용하여 종이 컵 바닥에 두 개의 "X"컷을 만듭니다. 각 대각선 절단길이는 약 1cm여야 합니다.
- 9 온스 플라스틱 컵을 가지고 약 2cm의 수돗물로 바닥을 채웁니다.
- 바닥에 "X" 컷 중 하나를 통해 줄기를 삽입하여 종이 컵에 말기 애벌레 숙주 식물의 생육의 신선한 절단, 약 15cm 길이를 놓는다. 줄기를 잘라서 약 4-5cm가 바닥밖으로 튀어나오도록 합니다.
- 종이 컵에 숙주 재료가 있는 종이 컵을 플라스틱 컵에 넣고 식물 줄기가 물에 있는지 확인합니다.
- 1 ml의 서브 Q 주사기 (0.45mm x 16mm)를 풍미가 있는 스포츠 음료로 채우고 종이 컵에 면봉을 모두 포화시다. 이들은 인공 꽃으로 작동합니다.
참고 : 멜론과 과일 펀치 맛 스포츠 음료는 최고의 꿀 대안을 제공합니다. - 각 짝짓기 쌍이 분리되면, 조립된 컵 구성(즉, oviposition chamber)에 2-3그라비드 암컷을 놓는다.
- 컵을 검은 얇은 명주 그물 (약 15cm x 15cm)의 컷 사각형 조각으로 덮고 뚜껑 주위에 고무 밴드로 고정하십시오(추가 그림 4). 블랙 튤은 컵에 대한 최상의 가시성과 때때로 얇은 명주 그물에 놓일 수있는 계란을 쉽게 식별 할 수 있습니다.
- 성인 나비 활동과 배란을 자극합니다.
- 40W 백열전구를 하우징하는 알루미늄 반사판으로 8.5 인치 (21.59 cm) 클램프 라이트 아래 약 19cm 의 실험실 벤치 또는 테이블에 각 oviposition 챔버를 놓습니다(보충 그림 5).
참고: 백열등은 성인의 활동과 배반을 자극하는 데 필요한 복사열을 제공합니다. - 조명에 인접한 추적 가능한 메모리 모니터링 온도계를 배치하고 온도 센서를 실행하여 클램프 조명 바로 아래에 있는 oviposition 챔버 위에 놓습니다.
참고: 목표 온도 범위는 27.5°C-29°C 사이입니다. - 배치된 총 배반 챔버 수에 따라 필요에 따라 추가 클램프 라이트를 추가합니다.
- 클램프 조명을 프로그래밍 가능한 15Amp 24h 실내 플러그인 기계식 타이머에 두 개의 콘센트(30분 의 시간 간격으로 프로그래밍 가능)에 연결합니다.
- 타이머를 설정하여 30분 간격으로 클램프 라이트를 켜십시오(즉, 30분, 30분 끄기의 반복 사이클).
참고: 이 가벼운 주기는 성인 나비 활동과 짧은 어두운 휴식 기간 뒤에 oviposition을 자극하는 조명의 반복 가능한 기간을 제공하여 계란 생산을 극대화하는 데 도움이됩니다. - 각 컵의 면봉을 서브 Q 주사기를 통해 맛있는 스포츠 음료로 새로 고치고, 필요에 따라 약 2-3시간마다 플라스틱 스프레이 병을 사용하여 물로 정기적으로 미스트하세요.
참고 : 이것은 나비가 원하는대로 자유롭게 공급 할 수 있도록 적절한 인공 꿀과 수분을 제공합니다. 그것은 따라서 생활, 개화 식물 재료 쉽게 활용 될 수 없는 실험실 조건에서 성인 장 수 와 oviposition 생산성을 향상. - 컵을 정기적으로 모니터링하고 필요에 따라 호스트 식물을 신선한 절단으로 교체하십시오.
- 계란이 부화하기 시작하거나 계란의 밀도가 높아지면 암컷을 신선한 숙주와 함께 새 컵으로 옮기고 신생아와 함께 유충 프로토콜을 시작합니다.
- 40W 백열전구를 하우징하는 알루미늄 반사판으로 8.5 인치 (21.59 cm) 클램프 라이트 아래 약 19cm 의 실험실 벤치 또는 테이블에 각 oviposition 챔버를 놓습니다(보충 그림 5).
3. 애벌레 관리 및 유지 보수
- 2.3-2.6단계를 반복하여 유충용 컵을 조립합니다.
- 계란이 부화하기 시작하면, 계란과 신생아 애벌레와 호스트 식물 재료를 새로 조립 된 컵으로 이동, 식물 줄기가 물에 있고 잎이 인접한 신선한 호스트 절단을 터치 되도록 하단에 두 번째 "X"를 통해 줄기를 배치.
- 유충이 젊을 때 (신생아-2 instar), 호스트 식물 재료의 신선도 및 곰팡이 또는 과도한 frass의 존재에 대한 애벌레 컵을 매일 확인합니다.
참고 : 애벌레가 어려서 신선한 숙주 재료의 취급 및 / 또는 불필요한 낭비로 인해 유기체 손상을 입을 수 있으므로 호스트 재료를 매일 제거하는 것은 권장되지 않습니다. - 숙주 재료가 시들거나 그렇지 않으면 좋지 않은 상태인 경우, 기존 단풍을 만지고 애벌레가 스스로 새 숙주로 이동할 수 있도록 신선한 숙주 재료를 컵에 다시 자르는 경우.
- 애벌레가3rd instar에 도달하면 종이 컵을 교체하고 매일 신선한 숙주 재료를 추가하십시오.
- 작은 낙타 머리 수채화 페인트 브러시를 사용하여 애벌레를 이전 숙주 재료 또는 컵 표면에서 새 컵의 신선한 숙주 재료로 부드럽게 옮긴다.
- 오래된 호스트 재료를 빈 직사각형 플라스틱 식품 저장 용기에 넣습니다.
- 매일 3.5-3.7단계를 반복하고 유충이 있는 모든 컵이 처리될 때까지 반복합니다.
- 완료되면, 식품 저장 용기에 식물 폐기물 의 상단에 신선한 호스트 재료의 소량을 추가하고 느슨하게 상단에 뚜껑을 배치합니다.
참고: 이는 유충이 공장 폐기물 위에 있는 새로운 호스트 재료로 크롤링되어 다음날 제거될 수 있기 때문에 매일 처리하는 동안 애벌레가 간과되는 경우에 대비한 안전 장치 역할을 합니다. - 최적의 애벌레 활동 과 개발을 위해 25 °C-28 °C 사이의 실험실 온도에서 컵을 유지하십시오(추가 그림 6).
참고: 실내 조건에서 최적의 사육 온도에 도달하려면 40W 백열전구가 있는 알루미늄 반사판이 있는 클램프 조명 아래에 컵을 놓아야 하는 경우가 많습니다. 그런 다음 추적 가능한 메모리 모니터링 온도계와 최적의 사육 조건에 맞게 조정된 광 높이를 사용하여 온도를 능동적으로 모니터링할 수 있습니다.
4. 퍼프 챔버 건설
- 골판지 롤 한 개를 3.8cm x 3.8cm 정사각형크기로 자른다.
- 2 온스 투명 플라스틱 부분 컵에 한 사각형을 놓습니다.
- 컵을 투명한 플라스틱 컵 트레이에놓습니다(보조 그림 7).
5. 사춘기용 애벌레 준비
- 매일 식민지 처리 하는 동안 pupate 준비가 성숙한 애벌레를 식별 합니다.
참고 : 이러한 애벌레는 균일 한 무딘 녹색 - 갈색을 켜고, 자신의 갈매기를 잃고, 종종 호스트를 방황합니다. - 작은 낙타 머리 수채화 페인트 브러시 또는 집게와 함께 각 성숙한 애벌레를 부드럽게 제거하고 각 강아지 챔버에 하나를 배치합니다.
- 퍼프 챔버에 투명 플라스틱 뚜껑을 단단히 끼웁습니다.
- 5.1-5.3단계를 반복하여 모든 애벌레가 필요에 따라 새로운 플라스틱 트레이를 첨가하여 퍼페션 챔버로 옮겨질 때까지 반복한다(보충도 8).
6. 번데기 유지
- pupation chambers의 각 트레이에 대해 첫 번째 pupation 날짜와 필요한 기타 관련 정보 (예 : 유전 선, 실험 시험 등)를 기록하십시오.
- 날짜별로 트레이를 정리하고 실험실 내의 안전한 장소에 배치합니다(추가그림 8).
- 성인 용 외장용 트레이를 매일 모니터링하십시오.
참고: 온도와 같은 실험실 조건은 개발 시간에 큰 영향을 미칩니다. - 성인 에클로전(전형적으로 첫 번째 번지로부터 10일 이내),개별 구출실에서 뚜껑을 제거하고 트레이를 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm 접이식 메쉬 팝업 케이지에 놓습니다(보충그림 9).
참고 : 골판지 사각형의 홈 내에 단단히 부착 된 pupae는 성공적인 성인 외장(보충 그림 10)을용이하게합니다. - 후속 포로 생성에 대해 1.1 단계에서 전체 프로토콜을 반복합니다.
7. 미숙단계의 개발시간 및 스타디아수평가
- 해부 현미경 아래에 단일 유충을 놓습니다. 작은 낙타 머리 수채화 페인트 브러시를 사용하여 유기체의 부상을 피하기 위해 유충을 조심스럽게 움직이고 격리하십시오.
- 무독성 발광 페인트(재료의 표)에페인트 브러시의 단일 머리를 찍어 조심스럽게 애벌레의 뒷면 (dorsum)에 페인트의 작은 방울을 넣어. 유충의 배경색과 패턴색상에서 눈에 띄는 페인트색을사용한다(보조도 11). 애벌레의 머리에 페인트를 배치하지 않도록해야합니다.
- 페인트가 건조되면(약 30s 정도), 각 개별 유충을 신선한 말단 숙주 물질의 약 1-3개의 작은 잎을 포함하는 2 온스의 투명 플라스틱 부분 컵에 놓고 컵과 뚜껑에 고유 식별자를적는다(보충 도 12).
- 매일 각 애벌레를 주의 깊게 확인하십시오. 잎을 제거하고 흰색 표면에 놓습니다. 컵을 검사하고 뚜껑을 열고 해부 현미경으로 잎을 검사하여 애벌레 외유(주조 스킨) 및/또는 머리 캡슐이 있는지 검사합니다.
- 애벌레 외유가 발견되면 컵에서 제거하고 해당 컵 번호와 날짜가 표시된 미세 원심 분리튜브에 놓습니다 (아래 단계 8.1-8.6 참조).
- 각 몰트 후 애벌레를 다시 칠하고 몰트 날짜를 기록합니다.
- 디지털 캘리퍼스를 사용하여 매일 각 유충의 총 체어 길이(머리에서 마지막 복부 세그먼트까지)를 측정합니다. 세 가지 측정을 하고 날짜 및 시간과 함께 세 가지 의 평균을 기록합니다. 초기 인스타 애벌레의 경우 정확한 측정을 위해 측정 할 때 돋보기 또는 해부 범위를 사용해야합니다.
- 유충을 해당 플라스틱 부분 컵으로 되돌려 보입니다.
- 필요에 따라 신선한 호스트 재료를 추가하고 모든 frass 및 오래된 호스트 파편을 제거합니다. 컵에 곰팡이가 발견되면 폐기하고 새 컵을 사용하십시오. 새 컵에 올바른 고유 식별자 번호를 적는다.
- 모든 애벌레가 최종 별에 도달하고 준비 단계를 시작할 때까지 7.5-7.9 단계를 반복합니다. 애벌레가 먹이를 중단하면 균일 한 무딘 녹색 - 갈색 색상을 켜고, 갈매기를 잃고, 종종 호스트를 방황, 그들을 방해 최소화.
- 작은 골판지 를 컵에 놓습니다(4.1단계 참조).
- 각 애벌레가 완전히 사춘기되면 위의 7.8 단계에서와 같이 총 길이를 측정하고 사춘기 날짜를 기록하십시오. 이것은 각 개인의 마지막 몰트가 될 것입니다.
- 매일 번데어를 확인하고 각 결과 성인 나비의 eclosion 날짜와 성별을 기록합니다.
- 디지털 캘리퍼스를 사용하여 각 나비의 날개 코드 길이를 측정합니다. 나비는 측정을 위해 집게로 부드럽게 보유 할 수 있습니다. 나비가 너무 활동적하여 쉽게 측정할 수 없는 경우, 일시적으로 30초 이하의 냉장고에 놓고 다시 시도하십시오.
8. 애벌레 외유 수집
- 애벌레 엑수비아가 관찰되면 미세 원심 분리튜브에 글리세린 0.2 μl을 채웁니다. 뚜껑 의 상단과 측면에 애벌레 번호, 몰트 날짜 및 헤드 캡슐 (H.C.)을 레이블을 지정합니다.
참고 : 일부 lepidopteran 애벌레의 애벌레는 정기적으로 자신의 외주를 소비하지만 머리 캡슐은 남아 있어야합니다. - 애벌레 엑수비아와 관련 헤드 캡슐을 투명한 플라스틱 부분 컵 뚜껑에 넣고 에탄올 몇 방울을 넣습니다.
- 명확한 플라스틱 부분 컵 뚜껑에 배치하고 그것에 에탄올의 몇 방울을 넣어 해부 현미경에서 애벌레 외비아를 검사합니다. 애벌레 헤드 캡슐이 이미 라우비아에서 분리된 경우, 뾰족한 곤충 집게 끝에 글리세린 한 방울을 떨어뜨리고 머리 캡슐을 글리세린에 부드럽게 만집니다. 헤드 캡슐을 관련 미세 원심 분리튜브에 놓습니다.
- 머리 캡슐이 여전히 애벌레 외유에 부착되어 있는 경우, 뾰족한 집게와 곤충 핀을 사용하여 애벌레 외유로부터 머리 캡슐을 분리합니다.
- 일단 분리되면, 머리 캡슐을 데리러 글리세린 기술을 사용합니다. 에탄올이 너무 많으면 작은 종이 타월을 사용하여 일부를 제거할 수 있지만 실수로 헤드 캡슐을 제거하지 않도록주의하십시오.
- 헤드 캡슐을 글리세린이 채워진 바이알에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.
Representative Results
2003년 2월부터 2010년 12월까지, 그리고 2016년 11월부터 현재까지 51,052마리의 생존 가능한 유기체를 성공적으로 생산하는 데 이 프로토콜이 사용되었습니다. 2018년 6월부터 2019년 6월까지 의 전체 포로 인구 생산성에 대한 1년 요약 스냅샷을 바탕으로 13세대에 걸쳐 매월 782.00±118.93의 생물을 나타내는 총 10,166개의 생존 생물이 생산되었습니다. 유사하게, 실험실 조건 하에서 여성당 평균 총 계란 생산량은 114.00±26.12(n=12)31이었다. 그 결과 상당한 유기체 생산성은 유피드리아스 에디타 테일러리, 스페이리아 제린 히폴리타, 리카이데스 멜리사사무엘리스(24)와 함께 미국에서 가장 큰 전직 활동 중 하나로 평가된다. 이 생산성의 일부는 나비가 지속적으로 우울하다는 사실에 기인 할 수있다, 포로에 약 한 세대를 생산 4-6 주. 다른 보존 사육 프로그램의 대부분은 일형 또는 비화산인 taxa를 포함합니다. 그럼에도 불구하고, Speyeria spp.와 같은 극단적으로 fecund taxa를 관련시키는 프로그램에도 불구하고, 연간 기준으로 보존 전좌를 위해 생성된 생존 가능한 유기체의 총 수는 거의 몇 천32를초과하지 않습니다. 따라서, 우리의 포로 인구는 최고의 실험실 사육 및 축산 관행을 개선하는 데 중요한 수많은 주요 데이터 격차에 대한 감독 연구 및 광범위한 데이터 수집을 가능하게했다(그림 1)뿐만 아니라 복구 및 관리 결정을 알리는 데 도움이.
신생아 유충에서 성인까지의 평균 총 발달 시간은 28.63일이었다(표1). 애벌레의 대다수는 4개의 몰트가 있었습니다(그림 2, 그림 3),비록 2개는 5개의 몰트가 있고, 1개는 6개의 몰트가 있었습니다. 모든 애벌레 인스타의 전체 평균 길이는 5.97 mm였고, 애벌레는 네 번째 및 prepupal 수명 단계에서 가장 큰것이었습니다(표 1). 30개 이상의 관측을 가진 변수만을 포함하는 경우, 가장 짧은 시간은 첫 번째 인스타 및 프루프 스테이지에서 보냈고, 가장 긴 시간은 퍼페로보냈다(표 1, 그림 2). 여성은 일반적으로 남성에 비해 모든 미성숙 단계에서 더 빨리 개발, 이것은 중요 한 효과 아니었지만 (p = 0.625). RStudio 버전 1.1.463(R Core Team 2016)33을사용하여 통계 분석을 수행하였다. 평균 성인 날개 코드 길이는 12.64mm(표2)였으며, 남녀 간에 유의한 차이가 있었다(p=0.047). 양면 t-test는 남녀 간의 날개 코드 차이를 평가하기 위해 실행되었습니다. 각 수명 단계의 평균 길이에 대한 선형 회귀 모델 및 단계별 회귀는 푸팔 길이가 성인 날개 코드 길이에 가장 적합한 예측변수임을보여주었다(표 3, 표 4). 개발 시간 동안의 회귀 모델은 두 번째 및 네 번째 instars에서 보낸 일 수와 총 일수가 성인 날개 코드 길이에 대한 최상의 예측 변수였지만, 4번째 instar에서일 수만 유의한 것으로나타났습니다(표 5, 표 6). 변수가 연속적이기 때문에 각 수명 단계의 개발 시간과 각 수명 단계의 길이에 대해 두 개의 선형 회귀 모델이 실행되었으며 성인 날개 코드 길이가 종속 변수로 간주되었습니다. 단계별 회귀는 성인 날개 코드 길이의 최상의 예측 변수를 결정하기 위해 두 회귀 모델에서 실행되었습니다.
보조 그림 1: 성인 사이클라거스 토마시 베투네바케리의표본을 고정한. (A)성인 남성, 등도 (왼쪽), 복부 (오른쪽). (B)성인 여성, 등도 (왼쪽), 복부 (오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 2: 온도 제어 온실에 보관 된 스크리니드 비행 케이지. (A)내부는 화분에 심은 성인 꿀 식물과 단일 화분 애벌레 호스트 식물을 보여줍니다. (B)금속 선반은 화분에 심은 꿀을 높이는 데 도움이되어 케이지의 내부 상단에서 가장 높은 꽃까지 30cm 이하의 공간이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 코풀라에서 성인 쌍을 수집하는 절차. (A)성인 사이클라거스 토마시 베투네바키의 짝짓기 쌍이 스크린 비행 케이지 안에 (여성, 오른쪽 및 남성, 왼쪽). (B)스냅 캡 바이알에 비행 케이지에서 수집 된 짝짓기 쌍은 실험실로 가져왔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 4: oviposition 챔버를 조립하는 절차. (A)단자 호스트 소재와 면봉이 있는 2컵 시스템. (B)A 1ml 서브 Q 주사기 (0.45 mm x 16mm) 맛 스포츠 음료와 함께 종이 컵에 면봉을 포화. (C)컵 하우징 그레이비드 암컷은 검은 색 얇은 명주 그물로 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 5: 계란 생산을 극대화하기 위한 실험실 설정. (A)40W 백열 전구가있는 클램프 조명 아래 실험실 벤치에 놓인 Oviposition 챔버. (B)추적 가능한 메모리 모니터링 온도계는 클램프 조명 바로 아래에 위치한 oviposition 챔버 위에 온도 센서가 있는 조명 에 인접하여 배치됩니다. (C)1ml 의 서브 큐 주사기와 작은 비커를 들고 모란챔버 옆에 배치된 맛스포츠 음료를 보관하여 하루 종일 정기적으로 면봉을 상쾌하게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 6: 애벌레 관리 및 유지 보수를 위한 실험실 설치. (A)신선한 단말 숙주 재료와 애벌레를 각각 함유한 2개의 컵 시스템. (B)컵내 온도는 25°C-28°C 사이에서 유지되어 40W 백열전구가 있는 오버헤드 클램프 조명에 의한 최적의 애벌레 활성 및 개발을 위해. (C)컵에 직접 배치된 온도 센서가 있는 추적 가능한 메모리 모니터링 온도계를 사용하여 온도를 모니터링합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 7: 준비된 퍼프 챔버. (A)투명 플라스틱 컵 트레이에 보관 된 개별 플라스틱 부분 컵. (B)각 플라스틱 부분 컵에 골판지 사각형이 배치됩니다. (C)단일 성숙한 애벌레는 각각 의 제조 된 플라스틱 부분 컵에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 8: 사춘기 및 pupal 유지 보수를 위한 애벌레를 준비. (A)골판지에 대두 준비 성숙한 애벌레. 그것은 균일 한 무딘 녹색 - 갈색이며, 어떤 갈매기를 잃었다. (B)먹이 애벌레와 컵에 인접한 성숙한 애벌레를받을 준비가 된 pupation 챔버. 뚜껑이있는 모든 pupation 챔버는 사춘기를 준비하고있는 애벌레를 집. (C)번데기와 함께 퍼프 챔버. (D)사춘기가 있는 방의 은행은 날짜별로 정리되고 실험실 조건하에서 유지된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 9: 실험실 출현 케이지. (A)점유 된 퍼프 챔버를 수용 접을 수있는 메쉬 팝업 양육 케이지. (B)성공적인 성인 외화를 용이하게하기 위해 모든 pupation 챔버의 뚜껑이 제거됩니다. (C)모든 결과 가능한 성인 나비는 성공적인 교합을 확보하기 위해 스크리너드 비행 케이지에 출시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 10: 골판지 사각형에 강아지에서 성공적으로 eclosing 성인 남성 나비. (A)성인이 번데기에서 닫는다. (B)성인이 푸팔 케이스에서 완전히 제거했습니다. (C)성인은 날개를 확장 할 수 있습니다. (D)성인이 날개를 펼친다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 11: 다섯 번째 instar 애벌레는 무독성 발광 페인트로 표시. (A)대조되는 적색, 무독성 발광 페인트의 작은 방울이 성공적으로 애벌레를 표시하기 위해 페인트 브러시를 사용하여 dorsum에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 12: 생활 역사 연구를 위한 양육 설정. (A)2 온스 투명 플라스틱 부분 컵만 으로 도는 독특한 라벨. (B)각 컵에 하나의 애벌레가 분리됩니다. (C)모든 애벌레는 신생아에서 성인 나비에 이르기까지 모든 발달 단계를 통해 개별적으로 추적됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 온도 제어 온실에 보관된 워크인 스크리너드 비행 케이지 내의 온도(°C)를 기준으로 코풀라에서 기록된 쌍 수입니다. 온도는 성공적인 페어링 이벤트(n=411)의 처음 2분 내에 기록되었다. 결과 데이터는 결합 성공과 궁극적으로 전반적인 포로 전파 생산성을 극대화하기 위해 제어된 환경 조건을 개선하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 각 미숙한 수명 단계의 평균 개발 시간(일 수)입니다. (A)막대는 각 그룹의 평균을 표시하고, 오류 막대는 각 그룹에 대한 상하 표준 편차 값을 나타냅니다. (B)진한 파란색 막대는 암컷을 나타내고 연한 파란색은 수컷을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생명 력 프로토콜을 사용 하 여 개별 #25 수집 된 머리 캡슐. 헤드 캡슐은 자동 몽타주 시스템을 사용하여 조나단 브레머에 의해 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 라이프 스테이지 | 평균 본체 길이(mm) | Std. 오류(길이) | 평균 개발 시간(일 수) | Std. 오류 (개발 시간) |
| 인스타 I | 1.69478261(n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| 인스타 II | 2.77248958(n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| 인스타 III | 5.45751042(n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| 인스타 IV | 10.2369688(n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| 인스타 V | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| 인스타 VI | 10.26666667 (n=1) | Na | 3 (n=1) | Na |
| 프리 푸파 | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375(n=32) | 0.21504641 |
| 번데기 | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
표 1: 각 수명 단계의 평균 길이 및 개발 시간입니다. 각 변수에 대한 표준 오류와 괄호 안의 샘플 크기가 포함됩니다.
| 라이프 스테이지 | 평균 날개 코드 길이(mm) | Std. 오류 |
| 성인 | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| 여성 | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| 남성 | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
표 2 : 성인 나비를위한 날개 코드 길이를 평균. 여성, 남성 및 모든 성인 (남녀 모두 결합)에 대한 수단을 포함합니다.
| LM 모델 1 | Std. 추정 오차 | t 값 | p 값 |
| 가로채 | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| 평균 길이 두 번째 별 | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| 평균 길이 세 번째 인스타 | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| 평균 길이 네 번째 인스타 | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| 평균 길이 의 pupae | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05. | |||
표 3: 선형 회귀 모델(LM 모델 1)에 대한 계수 표를 사용하여 각 수명 단계의 평균 길이(n > 30)와 성동 코드 길이 간의 관계를 평가합니다. 종속 변수: 성인 날개 코드 길이(mm).
| 계수 | Std. 추정 오차 | t 값 | Pr (>| t|) |
| 가로채 | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| 평균 길이 의 pupae | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
표 4: 단계별 회귀(단계별 1). 종속 변수: 성인 날개 코드 길이(mm).
| LM 모델 2 | Std. 추정 오차 | t 값 | p 값 |
| 가로채 | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Num. 일 첫 번째 별 | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Num. 일 두 번째 별 | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Num. 일 세 번째 인스타 | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Num. 일 네 번째 인스타 | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. 일 사전 pupae | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| 누일피페 | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| 총 숫자 일 수 | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05. | |||
표 5: 선형 회귀 모델(LM 모델 2)에 대한 계수 표를 사용하여 개발 시간과 성인 날개 코드 길이 간의 관계를 평가합니다. 종속 변수: 성인 날개 코드 길이(mm).
| 계수 | Std. 추정 오차 | t 값 | p 값 |
| 가로채 | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Num. 일 두 번째 별 | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| Num. 일 네 번째 인스타 | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| 총 숫자 일 수 | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05; • p & 0.1 | |||
표 6: 개발 시간에 대한 단계별 회귀(단계별 2). 종속 변수: 성인 날개 코드 길이(mm).
Discussion
여기서, 우리는 위험에 처한 나비의 대량 생산을위한이 입증 된 ex situ 보존 사육 프로토콜의 효과와 주요 행동, 삶의 역사 또는 생태 학적 데이터 격차를 해결하는 데 도움이되는 과학적 연구에 어떻게 적응 할 수 있는지 설명합니다. 평균 총 개발 시간(계란에서 성인까지), 각 수명 단계의 평균 지속 시간 및 짝짓기를 위한 최적의 온도에 대한 이해가 증가하여 프로토콜을 개선하고 전반적인 프로그램 성공을 향상시키는 데 사용되었습니다. 기존 프로토콜의 대부분은 유기체 축산 방법만 자세히 설명하고 데이터 수집, 과학적 연구 또는 이러한 결과의 사용에 대해 논의하지 않아 전 시투 방법을 알리고 잠재적으로 적응할 수 있습니다.
이 프로토콜은 매일 유기체 축산이 필요합니다. 깨끗한 사육 조건, 과밀화 부족, 고품질 애벌레 숙주 식물 재료의 가용성으로 유기체 의 건강과 생산성이 극대화됩니다. 대부분의 경우 일회용 사육 용품 및 용기(예: 종이 및 플라스틱 컵)를 활용하며 일반적으로 정기적으로, 자주 교체하며, 재료를 재사용하지 않습니다. 이는 비용 효율적이며 노동 집약적인 재료 의 위생에 대한 필요성을 최소화합니다. 그러나 일반적으로 사용되는 도구는 곤충 집게, 수채화 페인트 브러시 및 작은 팝업 비행 케이지뿐만 아니라 탁상 및 실험실 벤치 탑과 같은 모든 사육 표면은 5 % 표백 제를 사용하여 정기적으로 소독됩니다. 위생의 정확한 일정은 사용 빈도, 유기체 phenology 및 기타 변수에 크게 의존하며 각 ex situ 프로그램의 특정 요구에 맞게 조정되어야합니다. 우리는 또한 흰색 정육점 종이 모든 사육 표면을 커버하는 데 유용하다는 것을 발견. 그것은 저렴하고 쉽게 배포 할 수있는 깨끗한 기판을 제공하며, 흰색 배경 색은 길 잃은 유기체의 목격을 용이하게합니다. 매일 축산의 경우, 모든 실험실 직원은 항상 일회용 실험실 시험 장갑을 착용하여 오염을 최소화하고 식물 이나 유기체 취급으로 인한 잠재적 인 피부 자극으로부터 직원을 보호해야합니다. 이것은 어떤 실험실 직원이 국소 벼룩 처리를 요구하는 가정용 애완 동물이 있는 경우에 특히 중요합니다. 소량의 활성 성분 잔류물조차도 포로 가축에게 위험할 수 있습니다.
또한 유기체 과밀을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 유충의 과밀은 신속하게 감소 유기체 건강과 특정 택시, 특히 Lycaenidae에서 식인 풍습으로 이어질 수 있습니다. 정기적으로 유충을 분리하여 사육 용기 내에서 의한 수명을 줄이거나 프로토콜의 수명 기록 부분에 설명된 대로 개별 애벌레를 격리하는 것이 필요할 수 있습니다. 컨테이너당 이상적인 수치는 특정 분류 및 사용 가능한 예산, 실험실 시설 및 총 축산 인력 수와 같은 다양한 ex situ 프로그램 제약 조건에 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 우리는 마찬가지로 용기 사이의 유기체 이동의 가능성을 최소화하기 위해 유충을 하우징 컵 사이에 적절한 공간을 두는 것이 좋습니다. 마지막으로, 더 큰 포로 인구의 경우, 하나 이상의 실험실 시설 사이에 주식을 분리하는 것이 좋습니다. 이 보호 전략은 질병 또는 그밖 예기치 않은 충격 때문에 전체 인구의 치명적인 손실을 최소화하는 것을 도울 수 있습니다.
애벌레 호스트 식물의 품질과 가용성은 가축 생산을 유도하고 애벌레 개발 속도와 전반적인 인구 건강 모두에 큰 영향을 미칩니다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 출판 된 보고서 또는 연구는이 무대 뒤의 요구 사항을 강조하거나 최고의 보육 관행을 논의한다. 성공적인 ex situ 프로그램 계획은 적절한 플랜트 수량, 생산 및 유지 보수를 고려해야 합니다. 많은 애벌레는 또한 특정 식물 부분 (예를 들어, 말단 새로운 성장, 꽃봉오리 및 꽃봉오리, 과일 등)을 요구하거나 선호하기 때문에 적절한 식물 phenology가 필요합니다.
추가 고려 사항은 적절한 인구 통계 및 유전 관리를 포함, 포로의 잠재적 인 부정적인 영향의 최소화. 우리는 유전 관리 계획의 개발을 권장합니다. 여기에는 정기적으로 새로운 유전 물질의 주입을 포함하고, 다양성을 극대화하고, 근친 교배를 방지하고, 주기적으로 주요 유기체 적당 변수를 평가하고, 현존하는 인구에 대한 비교를 가능하게하고 포로 재고 상태를 확인하기 위해 일정 수준에서 유전학을 모니터링하는 전략이 포함될 수 있습니다. 창립 인구에서 개인에 포로 개인의 특성의 정기적 인 비교는 또한 보증34,35.
이러한 프로토콜은 입증된 모범 사례를 나타냅니다. 그(것)들은 직접 적용하거나 그들의 자신의 연구 결과에 우리의 방법을 적응하고 위험에 처한 나비 또는 곤충 보존 및 복구 프로그램을 전 할 수 있는 다양한 연구자 및 보존 실무자에 유익해야 합니다. 특정 설명 된 포로 사육 프로토콜은 다른 Lycaenidae, 관련 taxa 또는 더 작은 크기의 세금에 초점을 맞춘 프로그램에 가장 많이 적용 될 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고, 성공적인 구애와 교합, 인공 꿀을 가진 성인 유지 보수, oviposition 극대화 및 일반적인 애벌레 배려와 관련된 수많은 구성 요소는 틀림없이 더 광범위하게 적용되거나 더 넓은 배열에 적응될 수 있었습니다. 세금의. 앞에서 설명한 것처럼 프로토콜 유연성을 강조해야 하지만 다른 확립된 방법론에 대한 액세스는 가치 있는 통찰력과 적응 및 혁신을 위한 실행 가능한 출발점을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 애벌레 개발 시간 및 애벌레 stadia의 수와 같은 다양한 생활 역사 특성을 평가하기 위해 제시 된 방법은 틀림없이 다른 보존 사육 프로그램 및 위험 세금에 광범위한 적용이 있습니다. 우리는 다른 사람들이 가능한 한 주요 생태 학적 데이터 격차를 해결하고 검증 된 프로토콜및 프로그램 결과를 게시할 것을 권장합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 어류 및 야생 동물 서비스의 보존 복구 이니셔티브 (F17AP00467)와 디즈니 보존 기금의 보조금으로 지원되었습니다. 추가 지원은 플로리다 자연사 박물관과 플로리다 대학의 곤충학 및 신장학과에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
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