Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

نحن نصف بروتوكول التطعيم المتأخر لتوليد التهابات الجروح المزمنة في الفئران ذات الكفاءة المناعية.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)هو أحد مسببات الأمراض الرئيسية nosocomial ذات الصلة المتزايدة لصحة الإنسان والمرض, لا سيما في وضع التهابات الجروح المزمنة في مرضى السكري والمستشفيات. هناك حاجة ملحة لنماذج العدوى المزمنة للمساعدة في التحقيق في مسببات الجروح وتطوير علاجات جديدة ضد هذا العامل الممرض. هنا ، نصف بروتوكول يستخدم التطعيم المتأخر بعد 24 ساعة من جرح الاستئصال الكامل السماكة. عدوى مصفوفة الجرح المؤقت الحالي في هذا الوقت إما إحباط التطهير السريع أو نشر العدوى وبدلا من ذلك يؤسس العدوى المزمنة تستمر 7-10 أيام دون الحاجة إلى زرع مواد أجنبية أو قمع المناعة. يحاكي هذا البروتوكول مسارًا زمنيًا نموذجيًا للعدوى بعد الجراحة في البشر. استخدام سلالة P. aeruginosa الإنارة (PAO1:lux) يسمح للتقييم الكمي اليومي للعبء البكتيري لالتهابات الجروح P. aeruginosa. قد يكون هذا النموذج الجديد أداة مفيدة في التحقيق في الإمراض البكتيري وتطوير علاجات جديدة لالتهابات الجروح P. aeruginosa المزمنة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)هي بكتيريا على شكل قضيب سلبي الغرام مع زيادة صلتها بصحة الإنسان والمرض. وهي مسؤولة عن المراضة والوفيات واسعة النطاق في البيئات nosocomial، ولا سيما التي تنطوي على التهابات الجروح في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة1،2. وقد وفرت ظهور سلالات مقاومة للأدوية المتعددة من هذا العامل الممرض المزيد من الزخم للتحقيق في العوامل التي تسهم في فوعة P. aeruginosa ، وآليات مقاومة المضادات الحيوية P. aeruginosa ، وأساليب جديدة للوقاية والعلاج من هذه العدوى القاتلة3. وعلى هذا النحو، فإن الحاجة إلى نماذج الحيوانات من عدوى الجروح المزمنة كأدوات للتحقيق في هذه الأسئلة البحثية لم تكن أكبر من أي وقت مضى.

لسوء الحظ ، تميل العديد من النماذج الحيوانية من عدوى P. aeruginosa إلى محاكاة العدوى الحادة مع دقة سريعة للعدوى أو الانخفاض السريع بسبب الإنتان4،5، والذي لا يحاكي بشكل كاف الطبيعة المزمنة في كثير من الأحيان لهذه العدوى. لمعالجة هذا العيب ، تستخدم بعض النماذج زرع الأجسام الغريبة مثل حبات الأغار ، أو غرسات السيليكون ، أو هلام الجينات6،7،8. تستخدم نماذج أخرى الفئران التي لا تنقصها المناعة بسبب التقدم في العمر أو السمنة أو مرض السكري ، أو من خلال وسائل دوائية مثل العدلات الناجمة عن السيكلوفوسفاميد9،10،11،12. ومع ذلك ، إما أن استخدام المواد الأجنبية أو المضيفين المحصنين يغير على الأرجح العملية الالتهابية المحلية ، مما يجعل من الصعب فهم الفيزيولوجيا المرضية المشاركة في التهابات الجروح المزمنة في المضيفين الذين يعانون من جهاز مناعي طبيعي.

لقد طورنا نموذجًا مزمنًا لعدوى الجروح P. aeruginosa في الفئران التي تنطوي على تأخير التلقيح مع البكتيريا بعد جرح الختان. يسمح التطعيم المتأخر بإجراء تجارب لتقييم العبء البكتيري الذي يمتد إلى 7 أيام على الأقل. هذا النموذج يفتح فرصا جديدة للتحقيق في كل من الإمراض والعلاجات الجديدة للالتهابات المزمنة P. aeruginosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة ستانفورد.

1. إعداد ونمو البكتيريا

  1. إجراء جميع الأعمال مع P. aeruginosa والحيوانات مع احتياطات BSL-2 لكل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية للباحث والمبادئ التوجيهية للجنة استخدام الحيوانات. القيام بجميع الخطوات الموضحة هنا التي تنطوي على P. aeruginosa، بما في ذلك تلقيح الماوس ، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  2. وPAO1 الإنارة: سلالة لوكس من P. aeruginosa يتوفر من مختبرنا حسب الطلب. Streak PAO1، المخزنة كمخزون الجلسرين المجمدة، على ليسوجيني مرق (LB) أغار. بالنسبة لسلالة PAO1: لوكس التجويفية، يجب أن يحتوي LB agar على مضادات حيوية انتقائية (100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و12.5 ميكروغرام/مل كاناليسين). تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة البكتيرية.
  3. اختيار مستعمرة معزولة وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 3 مل LB المتوسطة، درجة الحموضة 7.4. بالنسبة للسلالات المضيئة ، يجب أن يحتوي المرق على 100 ميكروغرام / مل كاربنيسيلين. تنمو تحت اهتزاز، والظروف الهوائية.

2- إعداد الإجراءات

  1. احمل جميع الموظفين الذين يقومون بالجراحة على ارتداء معطف نظيف من الثوب/ المختبر، وقناع الوجه، وصافي الشعر، والقفازات.
  2. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك مقص وملقط. استخدام تقنية معقمة لتعقيم الأدوات بين الحيوانات.
  3. تنظيف الجدول الجراحي مع الإيثانول وإعداد حقل جراحي نظيف.

3. إزالة الشعر

  1. تم تطفل الفئران C57BL/6J التي تبلغ من العمر 8 إلى 12 أسبوعًا باستخدام 1٪ -3٪ من الإيفوبلوران. يجب على المحققين اتباع إرشادات الموظفين البيطريين في مؤسستهم للتخدير عند استخدام الإيسوفلوران.
    1. ابدأ التخدير عن طريق تسليم 1٪ -3٪ من الإيزوفلوران وضبط معدل تدفق الأكسجين إلى 1.5 لتر / دقيقة. ضع الماوس في غرفة الحث.
    2. قرصة إصبع القدم الماوس لتقييم عمق التخدير. عندما لا يستجيب الفأر للتحفيز، قم بإزالته من غرفة الحث ووضعه على مقاعد البدلاء الجراحية مع أنفه في مخروط الأنف الإيولوفوران.
    3. تطبيق مواد التشحيم العين على كلتا العينين.
  2. وزن الماوس للحصول على وزن خط الأساس قبل الإجراء.
  3. وضع الماوس في موقف عرضة. حقن الماوس تحت الجلد مع المعقمة قبل تسخينها 0.9٪ كلوريد الصوديوم، 250 ميكرولتر في كل جناح لما مجموعه 500 ميكرولتر.
  4. اعمل على إزالة الرُكُل من الفأرة باستخدام آلة التكلل. يجب أن تحدث الحلاقة في موقع مختلف عن المحطة الجراحية لمنع تلوث الشعر من الجرح.
  5. تطبيق طبقة رقيقة من غسول إزالة الشعر. دع الغسول يُترك لمدة 20-60 s. قم بإزالة الشعر والغسول الزائد مع الشاش المبلل بالماء الدافئ. بعد إزالة الشعر، انتقل إلى إجراء جرح الختان.

4. كامل سمك جراحة الجرح الاستئصالي

  1. حقن الإفراج المستمر buprenorphine 0.6-1 ملغ / كجم تحت الجلد باستخدام إبرة 25 G في المنطقة منتصف الظهر من الماوس. الإفراج البطيء buprenorphine يوفر تخفيف الألم أكثر من 48-72 ساعة.
  2. تطهير موقع الجراحة. مسح السطح الظهري بمسحة بيتادين معقمة. مسح بيتادين الزائدة مع مسحة الكحول معقمة. وينبغي أن يؤدي هذا 3 مرات (بالتناوب بين البيتادين والكحول)، مسح عن طريق الانتقال من المركز بطريقة دائرية إلى الحافة. السماح للمنطقة لتجف الهواء.
  3. إنشاء ستارة المحيطة موقع الجراحية باستخدام الشاش المعقم أو البلاستيك التشبث التفاف.
  4. تمتد الجلد مشدود caudally. استخدم لكمة خزعة جلدية معقمة قطرها 6 مم لإجراء شق أولي من خلال البشرة الظهرية اليسرى. كرر على البشرة الظهرية اليمنى.
  5. استخدام ملقط لخيمة الجلد من وسط منطقة الجرح المبينة اليسار. استئصال طبقات البشرة والجلد باستخدام مقص. كرر على منطقة الجرح الموضحة على اليمين لخلق جروح استئصالية متناظرة.
  6. غسل الجروح مع 50 ميكرولتر من المالحة المعقمة. السماح لموقع الجراحة والجلد المحيط بها لتجفيف الهواء. ثم، قم بتغطية الجروح والظهر مع خلع الملابس فيلم شفافة.
  7. وضع الماوس مرة أخرى في قفص نظيف. منزل 1 الحيوان لكل قفص.
  8. ضع القفص على وسادة تدفئة وراقب حتى يستيقظ الماوس.
  9. عند إجراء الجراحة المذكورة أعلاه على العديد من الحيوانات، استخدم معقم من المنبّه الساخن لتنظيف جميع الأدوات الجراحية بين الحيوانات.
  10. السماح 24 ساعة للفئران للتعافي من العملية الجراحية وتشكيل مصفوفة الجرح المؤقت على الجروح قبل الشروع في تلقيح مع البكتيريا.

5. التلقيح مع P. aeruginosa

  1. تمييع بين عشية وضحاها PAO1: ثقافة لوكس إلى OD600 = 0.05 في 75 مل من الوسائط LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل كاربنيسيلين وتنمو البكتيريا حتى الثقافة في مرحلة أسية مبكرة (OD600 ☆ 0.3). وينبغي أن يستغرق هذا ما يقرب من 2-3 ساعة.
  2. تمييع PAO1: لوكس في برنامج تلفزيوني إلى تركيز (7.5 ± 2.5) × 102 CFU / mL. تأكد من إعداد التطعيم الزائد لضمان حجم كاف والسماح للطلاء بعد التجربة. إذا كان النقل بين المرافق (أي من المختبر إلى vivarium) ، استخدم الاحتواء المزدوج في مربع إثبات التسرب الذي تم وضع علامة عليه بوضوح المخاطر البيولوجية.
  3. تنفيذ جميع الأعمال مع P. aeruginosa والفئران باستخدام معدات الحماية الشخصية المعتمدة في مستوى السلامة البيولوجية الحيوانية 2 (ABSL-2) وافق مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). وينبغي تغطية المعدات القابلة لإعادة استخدامها مثل مقياس الوزن بغلاف التشبث لمنع التلوث.
  4. تم تطفل هايستيز باستخدام 3٪ isoflurane كما هو موضح أعلاه. وزن الماوس وتسجيل الوزن. حقن الماوس تحت الجلد مع المعقمة قبل تسخينها 0.9٪ كلوريد الصوديوم، 250 ميكرولتر في كل جناح لما مجموعه 500 ميكرولتر.
  5. إذا كان لون المنضوّر الشفاف للفأر قد خرج بين عشية وضحاها، فقم بإزالة أي جرب ناتج بعناية ووضع ضمادة جديدة.
  6. استخدام 500 μL الدرنة 27 G حقنة غطاء السلامة لحقن 40 ميكرولتر من تعليق PAO1: لوكس من خلال خلع الملابس فيلم شفافة في كل جرح. وينبغي استخدام فئران مختلفة لضوابط الجروح غير المنهومة/برنامج تلفزيوني من أجل منع التلوث المتبادل من الجانب المقابل.
  7. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه على وسادة التدفئة ومراقبة حتى يستيقظ. يجب وضع جميع الفئران بشكل فردي في أقفاص منفصلة لمنع التلوث المتبادل.
  8. توفير عجينة مكملات غذائية عالية السعرات الحرارية تقع بين كريات الطعام على أرضية القفص.
  9. استخدام التطعيم المتبقية لسلسلة لوحة أغار LB. عد المستعمرات لتأكيد عدد البكتيريا تدار.

6. في التصوير الحي للجروح المصابة

  1. اتبع بروتوكولات احتواء BSL-2 لنقل الفئران من وإلى أداة التصوير، بما في ذلك استخدام حاوية ثانوية. يجب الحرص على عدم نقل أو إسقاط أي فراش الحيوان أثناء نقل الماوس إلى غرفة التعريفي أو أداة التصوير.
  2. حث تخدير الماوس مع استنشاق 1٪-3٪ isoflurane في غرفة التعريفي كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  3. بمجرد أن يتم ّ تَسْرّب الفأر، وضعه في موضع ِ عرضة في غرفة التصوير ِ في نظام تصوير بصري مع الأنف في مخروط الأنف الإيفوروران.
  4. افتح البرنامج.
  5. وستختلف بارامترات الاقتناء استنادا إلى عدد الحيوانات التي يتم التصوير فيها في وقت واحد وشدة الإضاءة الحيوية. تتضمن المعلمات الأساسية التي يجب تعيينها وقت التعرض وbinning و f/stop ومجال الرؤية (FOV). إعدادات البدء الافتراضية لدينا هي وقت التعرض 30 ثانية ، وbinning low (2) ، و / وقف 1.2 ، وFOV 25. ضبط هذه الإعدادات حسب الحاجة حسب احتياجات الباحث.
  6. تحليل بيانات التلألؤ باستخدام برنامج التصوير (انظر جدول المواد). سيتم تمثيل الإنارة كصورة ذات لون زائف متراكبة على صورة ملونة للفئران.
    1. إنشاء منطقة ذات أهمية (ROI) في موقع الجرح وقياس متوسط التدفق (الفوتوات/الثانية) المكتشفة. لاحظ أنه يمكن أيضًا الإبلاغ عن البيانات على أنها إشراق (فوتودات/ثانية/سم²/steradian)، ولكن طالما أن مسافة منصة التصوير من الكاميرا تظل ثابتة بين التصوير، فإن التدفق يكفي.
    2. قياس الخلفية من خلال إنشاء عائد استثمار في منطقة عشوائية على منصة التصوير. طرح عدد الخلفية من الفوتونيات / الثانية.
    3. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
  7. أداء التصوير على النحو المبين أعلاه في كثير من الأحيان يوميا لتتبع تطور العدوى.

7- إدارة ما بعد الجراحة

  1. مراقبة الفئران وفقًا للإرشادات التي وضعها بروتوكول IACUC للباحث. نحن نراقب جميع الفئران يوميًا لأول 4 أيام ، ثم كل يومين حتى نهاية التجربة. وزن الفئران مرة واحدة في اليوم لأول 4 أيام بعد الجراحة في BSC. حقن 250 ميكرولتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد في اليومين 1 و 2 بعد العدوى.
  2. تحقق من وجود علامات الألم / الضيق في الفئران ، بما في ذلك الوضع ية ، ومعطف الخمول ، والخمول ، وصعوبة في التنفس ، وغريمالوجه ، وفقدان الوزن.
  3. إذا كانت الحيوانات تظهر علامات على تدهور الصحة، استشر الطبيب البيطري. أي الماوس الذي يبدو أن تظهر علامات تفاقم الألم / الضيق وفقدان الوزن من 20٪ أو أكثر ينبغي أن يكون القتل الرحيم.

8- استئصال الجروح

  1. في نهاية التجربة ، التضحية بالفئران باستخداماستنشاق ثاني أكسيد الكربون ، يليه خلع عنق الرحم. تخلص من جثة الحيوان وفقًا لبروتوكولات ABSL-2 الخاصة بالمؤسسة.
  2. مكوس الجرح باستخدام مقص معقمة وملقط في BSC. ضع كل سرير جرح في 1 مل من PBS المعقم في أنبوب بولي بروبلين 1.5 مل. فرم نسيج الجرح بمقص. يجب التعامل مع جميع الجروح ASBL-2، حتى لو لم تكن تعتبر مصابة.
  3. احتضان على شاكر في 300 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية. دوامة كل أنبوب لمدة 10 s وبالتسلسل تخفيف النفايات السائلة البكتيرية في برنامج تلفزيوني. لوحة النفايات السائلة البكتيرية المخففة على LB أجار لتعداد العبء البكتيري.
  4. النظر في الجروح المصابة إذا كانت إشارة الإنارة في الجرح فوق الإنارة الخلفية ويتم الكشف عن المزيد من البكتيريا في النفايات السائلة الجرح من الجروح التطعيمات مع برنامج تلفزيوني كسيطرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

باستخدام سلالة الإنارة من PAO1 مع البلازميد ترميز نظام مراسل luxABCDE (PAO1:lux)، قمنا بإجراء جرح الختان على الفئران، وتلقيح هذه الجروح مع العوالق P. aeruginosa 24 ح في وقت لاحق، وقياس العبء البكتيري على مر الزمن(الشكل 1 والشكل 2). صورة تمثيلية تم الحصول عليها باستخدام نظام بصري التصوير يوضح أن هذا النموذج يؤدي إلى التلألؤ يمكن الكشف عنها(الشكل 3A). بلغت العدوى ذروتها في اليوم 3 بعد التطعيم واستمرت 7 أيام بعد التطعيم على أساس كل من الإضاءة الحيوية وعدد المستعمرات(الشكل 3B-C). باستخدام هذا النموذج، ونحن قادرون على توليد الجروح بشكل موثوق دائم 7-10 ays اعتمادا على سلالة من البكتيريا وخلفية الماوس. أظهرت ثقافة البكتيريا المعزولة عن الجرح أن CFU / الجرح الكمي مرتبط بالإنارة المكتشفة(الشكل 3D). وأخيرا، على الرغم من العدوى P. aeruginosa يمكن إثباتها وقابلة للقياس الكمي، بقيت الفئران على قيد الحياة لمدة 7 أيام على الأقل. على الرغم من أن هناك فقدان الوزن السريع الأولي مباشرة بعد العدوى، والحقن المالحة والتغذية التكميلية أدى إلى استعادة الوزن(الشكل 3E). وأخيراً، قمنا بحساب جرعة التلقيح التي يصاب بها 50% من الجروح بشكل مستدام بـ PAO1. كانت قيمة IC50 المحسوبة ~ 7.7 × 102 CFU / mL. جرعات أعلى من 104 CFU/mL أدى إلى معدل العدوى 100٪(الشكل 3F). تم تكييف هذه النتائج من البيانات المنشورة سابقا13.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي يصور نموذج عدوى الجرح كامل السماكة الاستئصالية مع التطعيم المتأخر مع الإضاءة الحيوية P. aeruginosa. المتتالية PAO1: لوكس في اليوم -2. حدد مستعمرة في اليوم -1 وتنمو بين عشية وضحاها في مرق LB. إجراء جراحة الجروح الاستئصالية في اليوم -1. في اليوم 0، تطعيم مع PAO1:لوكس عن طريق الحقن في السرير الجرح من خلال خلع الملابس فيلم شفافة. إجراء التصوير الحيوي بعد التلقيح. كرر التصوير في كثير من الأحيان يوميًا خلال اليوم 7-10. في اليوم 7-10، التضحية بالحيوانات وحصاد الجروح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي لجراحة الجروح الاستئصالية. بعد إزالة الشعر وتعقيم الجلد مع الكحول والبيتادين، استخدم لكمة خزعة 6 مم لإجراء شق أولي من خلال البشرة من الدورة البورسوم اليسرى واليمنى. استخدام مقص وملقط لإزالة طبقات الجلد والبشرة. يغسل مع برنامج تلفزيوني. تغطية مع خلع الملابس واضحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يمكن الكشف عن إصابة الجرح P. aeruginosa من خلال 7 أيام من العدوى. (أ)صورة تمثيلية للفأر المصاب ة PAO1:lux مع تراكب الإضاءة الحيوية على الجروح الاستئصالية. (ب)إشارة الإنارة التي تعكس العبء البكتيري الجرح. N = 6 جروح. التلقيح: 105 CFU/mL PAO1. (C)تحليل الانحدار الخطي في إشارة الإنارة في الجسم الحي وCFU البكتيرية من PAO1: الجروح المصابة لوكس، جمعت 4-7 أيام بعد التلقيح مع 105 CFU/mL للسماح لمجموعة من الأعباء البكتيرية. (D)العبء البكتيري في CFU / الجرح مع مرور الوقت في الفئران المصابة مع 105 CFU /mL PAO1:lux. (E)تغيير الوزن (نسبة إلى الوزن قبل جراحة استئصال الجرح على T = -1) N = 4 فئران / مجموعة. يصور هي boxplots ل5-95 في المئة. الإحصاءات هي في اتجاهين ANOVA تصحيحها مع Sidak مقارنة متعددة. (واو)تحليل الانحدار غير الخطي لمعدل عدوى الجروح المستخدم لحساب IC50 لPAO1 ثلاثة أيام بعد التلقيح. جميع الرسوم البيانية هي ممثلة للتجارب ن ≥ 3. وقد تم تعديل هذا الرقم من Sweere et al. 201913. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لقد وضعنا رواية تأخر التطعيم P. aeruginosa نموذج عدوى الجرح. استراتيجية تأخير التطعيم مع البكتيريا حتى 24 ساعة بعد جرح الختان تمكن من تقييم التهابات الجروح على مدى فترة زمنية 1 أسبوع. باستخدام سلالة الإنارة من P. aeruginosa، فمن الممكن لتتبع تطور العدوى في جميع أنحاء دورة العدوى. وسيتيح المسار الأطول للعدوى مقارنة بنماذج العدوى الأخرى P. aeruginosa فرصًا جديدة لدراسة تفاعلات الممرض المضيف والعلاجات الجديدة التي تستهدف التهابات الجروح P. aeruginosa. على سبيل المثال ، استخدمنا بالفعل هذا النموذج لإثبات دور بكتيريا PF في تحفيز استجابة مناعية مضادة للفيروسات تسمح P. aeruginosa بالتهرب من الجهاز المناعي المضيف14.

إدراج 24 ساعة من وقت الانتعاش بين جراحة الجرح الاستئصالي والتطعيم البكتيري هو خطوة حاسمة في هذا النموذج عدوى الجرح. يسمح للحيوانات بالتعافي من جراحة الجرح قبل الإصابة ، والتي من المرجح أن تلعب دورًا في قدرتها على البقاء على قيد الحياة خلال 7 أيام على الأقل. وعلاوة على ذلك، فإنه يدعم تشكيل مصفوفة الجرح المؤقت قبل التطعيم، والتي، بالاشتراك مع خلع الملابس فيلم شفافة، ويوفر بيئة مواتية لتشكيل بيوفيلم. قمنا بسلسلة من التجارب الاستكشافية أثناء تطوير هذا النموذج بالنظر إلى كميات مختلفة من الوقت بين الجرح والتطعيم. في تجربتنا، التطعيم الفوري بعد الإصابة غالبا ما يؤدي إلى تعفن الدم والموت. وعلى العكس من ذلك، أدى التلقيح في 48 ساعة ونقاط في وقت لاحق إلى مستويات غير مقبولة من عدم التجانس بين الفئران وبين الجروح على نفس الماوس. كما هو واضح في الشكل 3A، لا يزال هناك درجة ما من عدم التجانس المتوقع في الحمل البكتيري للجروح المصابة ، حتى مع التطعيم المتأخر 24-h. طريقة واحدة للتعويض عن هذا هو استخدام الحيوانات متعددة في كل تجربة.

وهناك جانب فريد من هذا البروتوكول هو استئصال اثنين من الجرح بشكل مستقل بدلا من طي الجلد أسفل خط الوسط واللكم من خلال لخلق اثنين من الجروح الثنائية، كما هو الحال في بعض نماذج الجرح الأخرى. وجدنا أن هذه الطريقة للطي كانت فعالة أيضا لإنتاج جروح متناظرة مع هوامش نظيفة. ومع ذلك ، الفئران تعامل بهذه الطريقة عادة ما أصبحت التعفن بسرعة بعد تلقيح البكتيريا وتوفي. ونحن نعتقد أن هذا قد يكون لأن هذه الطريقة للطي يزيل باننيكولوس بانوسوس الجلد - طبقة رقيقة من العضلات الكامنة وراء جلد الفئران التي ليست موجودة في البشر. ونحن نتكهن بأن هذا الحاجز قد يساعد على منع نشر البكتيريا.

عنصر مهم من هذا البروتوكول هو إزالة الشعر كافية من موقع الجراحية، كما الشعر الزائد يمكن أن توفر nidus للعدوى الفائقة ويتعارض مع الالتزام خلع الملابس فيلم شفافة. لقد وجدنا أن الحلاقة بالإضافة إلى كريم إزالة الشعر يوفر إزالة الشعر الأمثل مع الحد الأدنى من تهيج الجلد، على الرغم من غسل شامل قبالة كريم بالماء الدافئ لا يزال مهما.

وثمة عامل آخر لا يتجزأ هو الدعم الغذائي، والترطيب، والسيطرة على الألم خلال الأيام القليلة الأولى من دورة ما بعد الجراحة والعدوى. لمعالجة هذا، ونحن إدارة 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم تحت الجلد 0.9٪ في اليوم -1 و 0، ثم 250 ميكرولتر في اليوم 1 و 2. نحن أيضا توريد الفيتامينات والسعرات الحرارية السائلة هلام الملحق في وقت جراحة الجرح الاستئصالي. كما هو موضح في الشكل 3E، تسمح هذه التدابير باسترداد الوزن بشكل كاف بحلول اليوم 3. وفيما يتعلق بالمسكنات، وجدنا أن الإفراج المستمر 0.5 ملغ/كغ البوبرينورفين نظراً قبل جراحة الجروح الاستئصالية يوفر السيطرة على الألم كافية لمدة 72 ساعة، ولكن يمكن إعطاء جرعات إضافية إذا كان هناك ما يبرر ذلك استناداً إلى نتائج الشدة في أي فأر الفردية.

على الرغم من أن نموذج عدوى الجرح P. aeruginosa تمتد إلى 7-10 أيام هو ميزة كبيرة على نماذج أكثر حدة من العدوى، وهذا لا يزال قد لا يكون كافيا للإجابة على بعض الأسئلة البحثية التي تنطوي على المزيد من العدوى المزمنة. أحد أسباب هذا القيد هو أن إشارة الإنارة من سلالة PAO1: لوكس من P. aeruginosa قمم في اليوم 2-3(الشكل 3B). بعد ~ 7 أيام إشارة لوسيفراز يمكن أن تصبح غير موثوق بها. لهذا السبب، نقوم بتحديد كمية البكتيريا عن طريق طلاء النفايات السائلة الجرح على لوحات LB وحساب CFUs من أجل تأكيد العدوى من كل جرح في نهاية التجربة. عيب آخر محتمل لهذا النموذج هو شرط لنظام التصوير في الجسم الحي، والتي قد لا يكون لدى بعض المختبرات الوصول إليها. طريقة واحدة للالتفاف على هذه العقبة هو استخدام سلالات البكتيريا البرية غير الإنارة. وهذا لا يزال يسمح للباحث للاستفادة من هذا النموذج العدوى المزمنة، وكما هو مبين أعلاه، يمكن قياس البكتيريا CFUs في نهاية التجربة.

لقد وصفنا نموذجًا جديدًا للتلقيح المتأخر P. aeruginosa عدوى الجرح التي تمكن من إجراء تجارب تمتد إلى 7-10 أيام. هذا النموذج سيكون بمثابة أداة مفيدة لتقييم التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض مع P. aeruginosa، فضلا عن تطوير علاجات جديدة. هذا النموذج لديه القدرة على اتجاهات متعددة في المستقبل، بما في ذلك التكيف لمسببات الأمراض الجروح الأخرى مثل المكورات العنقودية المكورات العنقودية،فضلا عن العدوى المتعددة الميكروبات بما في ذلك P. aeruginosa جنبا إلى جنب مع مسببات الأمراض الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لأصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة للكشف عنها.

Acknowledgments

وكان pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 الإنارة بناء ناقلات هدية كريمة من J. هاردي. تم إنشاء التخطيطات مع BioRender.com. نشكر مختبر (جي غورتنر) على نصائحهم بشأن نموذج عدوى الجروح كما نشكر ت. دويل من مركز ستانفورد للابتكار في التصوير في فيفو على خبرته التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال المنح R21AI133370، R21AI133240، R01AI12492093، والمنح من ستانفورد سبارك، وثقة الأبحاث الطبية فالك ومؤسسة التليف الكيسي (CFF) إلى P.L.B. C.R.D كان مدعوما من قبل T32AI007502. زمالة خريج ة في جامعة غابلان ستانفورد للعلوم والهندسة وزمالة لوبرت ستراير بيو-إكس ستانفورد للدراسات العليا متعددة التخصصات تدعم J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
نموذج التلقيح المتأخر <em>لعدوى الجروح</em> المزمنة الزائفة الجيروجينوسا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter