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Immunology and Infection

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est un agent pathogène nosocomial majeur de plus en plus pertinent pour la santé humaine et la maladie, en particulier dans le cadre d’infections chroniques des plaies chez les patients diabétiques et hospitalisés. Il est urgent de mettre au point des modèles d’infection chronique pour aider à l’étude de la pathogénie des plaies et au développement de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie l’inoculation retardée 24 heures après la blessure excisional pleine épaisseur. L’infection de la matrice provisoire de blessure présente à ce moment-là prédise le dégagement ou la diffusion rapide de l’infection et établit plutôt l’infection chronique durant 7-10 jours sans avoir besoin d’implantation de matériaux étrangers ou de suppression immunitaire. Ce protocole imite un cours temporel typique de l’infection postopératoire chez l’homme. L’utilisation d’une souche luminescente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permet l’évaluation quotidienne quantitative de la charge bactérienne pour des infections de blessure de P. aeruginosa. Ce nouveau modèle peut être un outil utile dans l’étude de la pathogénie bactérienne et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques de plaie de P. aeruginosa.

Introduction

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Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est une bactérie en forme de tige Gram-négative avec une pertinence croissante pour la santé humaine et la maladie. Il est responsable de la morbidité et de la mortalité étendues dans les arrangements nosocomiaux, particulièrement impliquant des infections de blessure dans les patients immunocompromis1,2. L’émergence de souches multirésistantes de cet agent pathogène a donné une impulsion supplémentaire pour l’investigation sur les facteurs contribuant à la virulence de P. aeruginosa, les mécanismes de la résistance aux antibiotiques De P. aeruginosa, et de nouvelles méthodes pour la prévention et le traitement de cette infection mortelle3. En tant que tel, le besoin de modèles animaux de l’infection chronique des plaies comme outils pour étudier ces questions de recherche n’a jamais été aussi grand.

Malheureusement, de nombreux modèles animaux de l’infection à P. aeruginosa ont tendance à simuler une infection aigue avec une résolution rapide de l’infection ou un déclin rapide dû à la septicémie4,5, qui ne simule pas adéquatement la nature souvent chronique de ces infections. Pour remédier à cet inconvénient, certains modèles utilisent l’implantation de corps étrangers tels que les perles d’agar, les implants en silicone, ou les gels d’alginate6,7,8. D’autres modèles utilisent des souris qui sont immunocompromised en raison de l’âge avancé, l’obésité, ou le diabète, ou par des moyens pharmacologiques tels que la neutropénie induite par cyclophophosphamide9,10,11,12. Cependant, l’utilisation de matériaux étrangers ou d’hôtes immunodéprimés modifie probablement le processus inflammatoire local, ce qui rend difficile d’acquérir une compréhension de la physiopathologie impliquée dans les infections chroniques des plaies chez les hôtes avec un système immunitaire autrement normal.

Nous avons développé un modèle chronique de P. aeruginosa infection de blessure chez les souris qui implique l’inoculation retardée avec des bactéries après blessure excisional. L’inoculation retardée permet des expériences évaluant la charge bactérienne s’étendant jusqu’à au moins 7 jours. Ce modèle ouvre de nouvelles possibilités d’étudier à la fois la pathogénie et les nouveaux traitements des infections chroniques de P. aeruginosa.

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Protocol

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stanford.

1. Préparation et croissance des bactéries

  1. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux avec des précautions BSL-2 selon le comité institutionnel de biosécurité du chercheur et les lignes directrices du comité d’utilisation des animaux. Faites toutes les étapes décrites ici impliquant P. aeruginosa, y compris l’inoculation de souris, dans un coffret de biosécurité.
  2. La souche luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa est disponible dans notre laboratoire sur demande. Streak PAO1, stocké sous forme de stock de glycérol congelé, sur l’agar Lysogeny Broth (LB). Pour la souche luminescente PAO1:lux, l’agar LB doit contenir des antibiotiques sélectifs (100 'g/mL carbenicilline et 12,5 'g/mL kanamycin). Cultivez à 37 oC pendant la nuit dans un incubateur bactérien.
  3. Choisissez une colonie isolée et poussez pendant la nuit à 37 oC dans un milieu lb de 3 ml, pH 7,4. Pour les souches luminescentes, le bouillon doit contenir 100 og/mL de carbenicilline. Cultivez dans des conditions aérobies tremblantes.

2. Préparation de la procédure

  1. Demandez à tout le personnel effectuant la chirurgie de porter une robe propre/manteau de laboratoire, un masque de visage, un filet de cheveux, et des gants.
  2. Autoclave tous les outils chirurgicaux, y compris les ciseaux et les forceps. Utilisez une technique aseptique pour stériliser les outils entre les animaux.
  3. Nettoyez la table chirurgicale avec de l’éthanol et préparez un champ chirurgical propre.

3. Enlèvement de cheveux

  1. Anesthésiez les souris C57BL/6J de 8 à 12 semaines à l’aide d’isoflurane de 1 % à 3 %. Les enquêteurs devraient suivre les directives du personnel vétérinaire de leur établissement pour l’anesthésie lors de l’utilisation de l’isoflurane.
    1. Commencez l’anesthésie en livrant 1% - 3% isoflurane et ajuster le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction.
    2. Pincez l’orteil de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie. Lorsque la souris ne réagit plus à la stimulation, retirez-la de la chambre d’induction et placez-la sur le banc chirurgical avec son nez dans le cône de nez isoflurane.
    3. Appliquer un lubrifiant oculaire sur les deux yeux.
  2. Peser la souris pour obtenir un poids de base avant la procédure.
  3. Placez la souris en position couchée. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.
  4. Raser la zone dorsale de la souris à l’aide d’un rasage électrique. Le rasage devrait se produire à un endroit différent de celui de la station chirurgicale pour prévenir la contamination des cheveux de la plaie.
  5. Appliquer une fine couche de lotion d’épilation. Laisser la lotion s’asseoir pendant 20 à 60 s. Enlever les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifiée dans de l’eau chaude. Après l’épilation, procéder à la procédure de blessure excisional.

4. Chirurgie excisional de blessure d’épaisseur complète

  1. Injecter de la buprénorphine à libération soutenue 0,6 à 1 mg/kg sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 25 G à la mi-dorsale de la souris. La buprénorphine à libération lente soulage la douleur sur 48 à 72 h.
  2. Désinfecter le site chirurgical. Essuyez la surface dorsale à l’œil d’un tampon stérile de bêtadine. Essuyez l’excès de bêtadine à l’œil d’un tampon d’alcool stérile. Ceci doit être exécuté 3 fois (en alternance entre la bêtadine et l’alcool), écouvillonnant en se déplaçant du centre d’une manière circulaire au bord. Laisser sécher la zone.
  3. Créez un drapé entourant le site chirurgical à l’aide de gaze stérile ou d’une pellicule d’accrochage en plastique.
  4. Étirer la peau tendue caudally. Utilisez un poinçon stérile de biopsie de la peau de 6 mm de diamètre pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsal gauche. Répéter sur l’épiderme dorsal droit.
  5. Utilisez des forceps pour tenter la peau du centre de la zone de la plaie décrite à gauche. Excisez les couches épidermiques et cutanées à l’aide de ciseaux. Répétez sur la zone de la plaie décrite à droite pour créer des blessures excisionales symétriques.
  6. Laver les plaies avec 50 l de salin stérile. Laissez sécher le site chirurgical et la peau environnante. Ensuite, couvrez les plaies et dorsum avec un pansement de film transparent.
  7. Placez la souris dans une cage propre. Maison 1 animal par cage.
  8. Placez la cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que la souris se réveille.
  9. Lors de l’exécution de la chirurgie ci-dessus sur plusieurs animaux, utilisez un stérilisateur de perles chaudes pour nettoyer tous les instruments chirurgicaux entre les animaux.
  10. Laisser 24 h pour les souris de récupérer de la procédure chirurgicale et pour la formation d’une matrice de plaie provisoire sur les plaies avant de procéder à l’inoculation avec des bactéries.

5. Inoculation avec P. aeruginosa

  1. Diluer la culture PAO1:lux de nuit à OD600 - 0,05 dans 75 mL de support LB contenant 100 'g/mL de carbenicilline et de développer les bactéries jusqu’à ce que la culture est en phase exponentielle précoce (OD600 - 0,3). Cela devrait prendre environ 2 à 3 h.
  2. Diluer PAO1:lux dans PBS à une concentration de (7,5 à 2,5) x 102 CFU/mL. Assurez-vous de préparer l’inoculum excédentaire pour assurer un volume suffisant et pour permettre le placage après l’expérience. Si vous transportez entre les installations (c.-à-d. du laboratoire au vivarium), utilisez un double confinement dans une boîte à contre-preuves de fuites clairement marquée Biohazard.
  3. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les souris à l’aide d’équipement de protection individuelle approuvé dans un coffret de sécurité biologique approuvé par le niveau de biosécurité animale 2 (ABSL-2). L’équipement réutilisable tel que la balance de pesage doit être recouvert d’un soudure pour éviter la contamination.
  4. Anesthésier à l’aide de 3% isoflurane comme décrit ci-dessus. Pesez la souris et enregistrez le poids. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.
  5. Si le pansement transparent de la souris s’est éteint pendant la nuit, retirez soigneusement toute croûte résultante et mettez sur un nouveau pansement.
  6. Utilisez une seringue de bouchon de sécurité de 500 l à tubercule 27 G pour injecter 40 l de la suspension PAO1:lux à travers le pansement transparent dans chaque plaie. Différentes souris devraient être utilisées pour les contrôles des plaies non inoculés/PBS afin d’éviter la contamination croisée du côté contralatéral.
  7. Placez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’elle se réveille. Toutes les souris doivent être logées individuellement dans des cages séparées afin d’éviter la contamination croisée.
  8. Fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés de nourriture sur le plancher de la cage.
  9. Utilisez l’inoculum restant pour strier une plaque d’agar LB. Compter les colonies pour confirmer le nombre de bactéries administrées.

6. Imagerie in vivo des plaies infectées

  1. Suivez les protocoles de confinement BSL-2 pour le transport des souris à et depuis l’instrument d’imagerie, y compris l’utilisation d’un conteneur secondaire. Veillez à ne pas transférer ou laisser tomber une litière animale pendant le transfert de la souris à la chambre d’induction ou à l’instrument d’imagerie.
  2. Induire l’anesthésie de la souris avec l’isoflurane inhalé de 1% à 3% dans une chambre d’induction comme décrit à l’étape 3.1.
  3. Une fois que la souris est anesthésié, placez-la en position couchée dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie optique avec le nez dans le cône nasal isoflurane.
  4. Ouvrez le logiciel.
  5. Les paramètres d’acquisition varient en fonction du nombre d’animaux photographiés simultanément et de l’intensité de la bioluminescence. Les paramètres de base à définir comprennent le temps d’exposition, le binning, f/stop et le champ de vision (FOV). Nos paramètres de démarrage par défaut sont le temps d’exposition 30 secondes, binning faible (2), f/ arrêt 1.2, et FOV 25. Ajustez ces paramètres au besoin en fonction des besoins du chercheur.
  6. Analyser les données de luminescence à l’aide d’un programme d’imagerie (voir Tableau des matériaux). Luminescence sera représenté comme une image pseudo-couleur superposée sur une photographie couleur des souris.
    1. Créer une région d’intérêt (ROI) sur le site de la plaie et mesurer le flux moyen (photons/seconde) détecté. Notez que les données peuvent également être signalées comme rayonnement (photons/seconde/cm2/steradian), mais tant que la distance de la plate-forme d’imagerie de la caméra reste constante entre l’imagerie, le flux est suffisant.
    2. Mesurer l’arrière-plan en créant un retour sur investissement à une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie. Soustrayez le nombre d’arrière-plan des photons/seconde.
    3. Exporter les données vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
  7. Effectuer l’imagerie comme décrit ci-dessus aussi souvent que tous les jours pour suivre la progression de l’infection.

7. Gestion postopératoire

  1. Surveillez les souris selon les lignes directrices fixées par le protocole IACUC du chercheur. Nous surveillons toutes les souris tous les jours pendant les 4 premiers jours, puis tous les deux jours jusqu’à la fin de l’expérience. Peser les souris une fois par jour pendant les 4 premiers jours après la chirurgie dans un BSC. Injecter 250 l de chlorure de sodium de 0,9 % sous-cutané les jours 1 et 2 après l’infection.
  2. Vérifiez les signes de douleur/détresse chez les souris, y compris la posture voûtée, le pelage débraillé, la léthargie, la difficulté à respirer, la grimace faciale et la perte de poids.
  3. Si les animaux présentent des signes de détérioration de leur santé, consultez un vétérinaire. Toute souris qui semble montrer des signes d’aggravation de la douleur / détresse et une perte de poids de 20% ou plus devrait être euthanasié.

8. Excision de blessure

  1. À la fin de l’expérience, sacrifiez les souris en utilisant l’inhalation de CO2, suivie d’une luxation cervicale. Disposer de la carcasse de l’animal selon les protocoles ABSL-2 de l’institution.
  2. Lits de plaie d’accise utilisant des ciseaux stériles et des forceps dans un BSC. Placez chaque lit de blessure dans 1 ml de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 ml. Émincer le tissu de la plaie avec des ciseaux. Toutes les plaies doivent être traitées comme ASBL-2, même si elles ne sont pas considérées comme infectées.
  3. Incuber sur un shaker à 300 tr/min pendant 2 h à 4 oC. Vortex chaque tube pour 10 s et diluer en série les effluents bactériens dans PBS. Plaquer les effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour énumérer la charge bactérienne.
  4. Considérez les plaies infectées si le signal luminescent dans la plaie est au-dessus de la luminescence de fond et plus de bactéries sont détectées dans l’effluent de blessure que dans les blessures inoculées avec PBS comme contrôle.

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Representative Results

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À l’aide d’une souche luminescente de PAO1 avec un plasmide codant le système de journaliste luxABCDE (PAO1:lux), nous avons effectué des blessures excisionales sur des souris, inoculé ces blessures avec p. aeruginosa planctonique 24 h plus tard, et mesuré la charge bactérienne au fil du temps(Figure 1 et Figure 2). Une image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne une luminescence détectable (figure 3A). L’infection a atteint un sommet au troisième jour après l’inoculation et a persisté 7 jours après l’inoculation en fonction de la bioluminescence et du nombre de colonies(figure 3B-C). Grâce à ce modèle, nous sommes en mesure de générer de façon fiable des plaies d’une durée de 7 à 10 ays en fonction de la souche des bactéries et du fond de la souris. La culture des bactéries isolées de la plaie a montré que l’UFC/blessure quantifiée était corrélée avec la luminescence détectée (figure 3D). Enfin, en dépit de l’infection démontrable et quantifiable de P. aeruginosa, les souris ont survécu pendant au moins 7 jours. Bien qu’il y ait eu une perte de poids rapide initiale immédiatement après l’infection, les injections salines et la nutrition supplémentaire ont entraîné la restauration du poids (Figure 3E). Enfin, nous avons calculé la dose d’inoculation à laquelle 50% des plaies seraient infectées durablement par PAO1. La valeur ic50 calculée était de 7,7 x 102 CFU/mL. Des doses supérieures à 104 CFU/mL ont entraîné un taux d’infection de 100 %(figure 3F). Ces résultats ont été adaptés à partir de données publiées précédemment13.

Figure 1
Figure 1 : Schéma tique représentant le modèle excisional d’infection de plaie pleine épaisseur avec l’inoculation retardée avec Le P. aeruginosabioluminescent. Streak PAO1:lux le jour -2. Sélectionnez une colonie le jour -1 et poussez toute la nuit dans du bouillon LB. Effectuer la chirurgie des plaies excisionales le jour -1. Le jour 0, inoculer avec PAO1:lux en injectant dans le lit de la plaie à travers le pansement transparent. Effectuer la formation image de bioluminescence après l’inoculation. Répétez l’imagerie aussi souvent que tous les jours jusqu’au jour 7 à 10. Le jour 7-10, sacrifiez les animaux et récoltez les blessures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de la chirurgie des plaies excisionnales. Après l’épilation et la stérilisation de la peau avec de l’alcool et de la bétadine, utilisez un poinçon de biopsie de 6 mm pour faire une incision initiale à travers l’épiderme de la dorsum gauche et droite. Utilisez des ciseaux et des forceps pour enlever les couches cutanées et épidermiques. Laver avec PBS. Couvrir d’un pansement clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L’infection des plaies de P. aeruginosa peut être détectée pendant 7 jours d’infection. (A) Image représentative d’une souris infectée par PAO1:lux avec superpose de bioluminescence sur les plaies excisionales. (B) Signal luminescent reflétant la charge bactérienne des plaies. N - 6 blessures. Inoculation: 105 CFU/mL PAO1. (C) Analyse linéaire de régression du signal luminescent in vivo et du CFU bactérien des plaies PAO1:lux-infectées, recueillies 4 à 7 jours après l’inoculation avec 105 CFU/mL pour permettre une gamme de charges bactériennes. (D) Charge bactérienne dans CFU/wound au fil du temps chez les souris infectées par 105 CFU/mL PAO1:lux. (E) Changement de poids (par rapport au poids avant la chirurgie d’excision des plaies sur T -1) N - 4 souris/groupe. Représentés sont des parcelles de boîte pour 5-95 percentile. Les statistiques sont corrigées par L’ANOVA bidirectionnelle avec sidak comparaison multiple. (F) Analyse non linéaire de régression du taux d’infection de blessure employé pour calculer l’IC50 pour PAO1 trois jours après l’inoculation. Tous les graphiques sont représentatifs des expériences n'3. Ce chiffre a été modifié à partir de Sweere et al. 201913. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Nous avons développé un nouveau modèle retardé d’infection de blessure de P. aeruginosa d’inoculation. La stratégie de retarder l’inoculation avec des bactéries jusqu’à 24 h après la blessure excisional permet l’évaluation des infections de blessure sur une période d’une semaine. En utilisant une souche luminescente de P. aeruginosa, il est possible de suivre la progression de l’infection tout au long du cours de l’infection. Le cours plus long de l’infection par rapport à d’autres modèles d’infection de P. aeruginosa permettra de nouvelles occasions d’étudier les interactions hôte-pathogène et les thérapies nouvelles ciblant des infections de blessure de P. aeruginosa. Par exemple, nous avons déjà utilisé ce modèle pour démontrer le rôle du bactériophage Pf dans la stimulation d’une réponse immunitaire antivirale qui permet à P. aeruginosa d’échapper au système immunitaire hôte14.

L’inclusion de 24 heures de temps de récupération entre la chirurgie de blessure excisional et l’inoculation bactérienne est une étape critique dans ce modèle d’infection de blessure. Il permet aux animaux de se remettre de la chirurgie de la plaie avant d’être infectés, ce qui joue probablement un rôle dans leur capacité à survivre pendant au moins 7 jours. En outre, il soutient la formation d’une matrice de plaie provisoire avant l’inoculation, qui, en combinaison avec le pansement transparent du film, fournit un environnement propice à la formation de biofilms. Nous avons effectué une série d’expériences exploratoires au cours du développement de ce modèle en examinant différentes quantités de temps entre la blessure et l’inoculation. Dans notre expérience, l’inoculation immédiate après la blessure a souvent comme conséquence le sepsis et la mort. Inversement, l’inoculation à 48 heures et des points de temps plus tard a mené aux niveaux inacceptables d’hétérogénéité entre les souris et entre les blessures sur la même souris. Comme le montre la figure 3A, il peut encore y avoir un certain degré d’hétérogénéité prévue dans la charge bactérienne des plaies infectées, même avec l’inoculation retardée de 24 h. Une façon de compenser cela est d’utiliser plusieurs animaux dans chaque expérience.

Un aspect unique de ce protocole est l’excision de deux blessures indépendamment plutôt que de plier la peau vers le bas de la ligne médiane et de poinçonnage à travers pour créer deux blessures bilatérales, comme c’est le cas dans certains autres modèles de plaie. Nous avons constaté que cette méthode de pliage était également efficace pour produire des blessures symétriques avec des marges propres. Cependant, les souris traitées de cette manière sont typiquement devenues septiques rapidement après l’inoculation bactérienne et sont mortes. Nous croyons que c’est peut-être parce que cette méthode de pliage supprime le carnosus panniculus dermique - une fine couche de muscle sous-jacente à la peau des souris qui n’est pas présente chez l’homme. Nous spéculons que cette barrière peut aider à empêcher la dissémination bactérienne.

Un élément important de ce protocole est l’épilation suffisante du site chirurgical, comme l’excès de cheveux pourrait fournir un nidus pour la superinfection et interfère avec l’adhérence de l’habillage film transparent. Nous avons constaté que le rasage en plus de la crème d’épilation fournit l’épilation optimale avec une irritation minimale de la peau, bien que bien laver la crème avec de l’eau chaude est toujours important.

Un autre facteur intégral est le soutien nutritionnel, l’hydratation et le contrôle de la douleur pendant les premiers jours du cours postchirurgical et d’infection. Pour remédier à cette situation, nous administrons 500 ll de chlorure de sodium sous-cutané de 0,9 % le jour -1 et 0, puis 250 l le jour 1 et 2. Nous fournissons également un supplément de gel liquide multivitaminé et calorique au moment de la chirurgie de blessure excisional. Comme le montre la figure 3E, ces mesures permettent un recouvrement adéquat du poids d’ici le troisième jour. En ce qui concerne l’analgésie, nous avons constaté que la libération soutenue 0.5 mg/kg buprénorphine donnée avant la chirurgie de blessure excisional fournit le contrôle suffisant de douleur pendant 72 h, mais des doses additionnelles peuvent être données si justifiée basée sur des résultats de détresse dans n’importe quelle souris individuelle.

Bien qu’un modèle d’infection de blessure de P. aeruginosa s’étendant à 7-10 jours soit un avantage significatif au-dessus des modèles plus aigus d’infection, ceci peut encore ne pas être suffisant pour répondre à certaines questions de recherche impliquant plus d’infections chroniques. L’une des raisons de cette limitation est que le signal luminescent de la souche PAO1:lux de P. aeruginosa culmine au jour 2-3 (Figure 3B). Après 7 jours, le signal de luciferase peut devenir peu fiable. Pour cette raison, nous quantifions les bactéries en plaquant les effluents des plaies sur les plaques LB et en comptant les UFC afin de confirmer l’infection de chaque plaie à la fin de l’expérience. Un autre inconvénient possible de ce modèle est l’exigence d’un système d’imagerie in vivo, auquel certains laboratoires n’ont peut-être pas accès. Une façon de contourner cet obstacle est d’utiliser des souches bactériennes de type sauvage non luminescente. Cela permet encore au chercheur de tirer parti de ce modèle d’infection chronique et, comme indiqué ci-dessus, les bacs de soins de la bactérie peuvent être quantifiés à la fin de l’expérience.

Nous avons décrit un nouveau modèle de l’infection retardée de blessure de P. aeruginosa d’inoculation qui permet des expériences s’étendant à 7-10 jours. Ce modèle servira d’outil utile pour évaluer l’interaction hôte-pathogène avec P. aeruginosa, ainsi que le développement de nouvelles thérapies. Ce modèle a le potentiel pour de multiples directions futures, y compris l’adaptation pour d’autres agents pathogènes de blessure tels que Staphylococcus aureus,aussi bien que des infections polymicrobiennes comprenant P. aeruginosa combiné s’est combiné avec d’autres agents pathogènes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

Acknowledgments

Le vecteur de construction luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 était un cadeau gracieux de J. Hardy. Des schémas ont été créés avec BioRender.com. Nous remercions le laboratoire de G. Gurtner pour leurs conseils sur le modèle d’infection des plaies. Nous remercions également T. Doyle du Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging pour son expertise technique. Ce travail a été soutenu par des subventions R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, et des subventions de Stanford SPARK, le Falk Medical Research Trust et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à P.L.B. C.R.D a été soutenu par T32AI007502. Une bourse d’études supérieures Gabilan Stanford pour les sciences et l’ingénierie et une bourse d’études supérieures interdisciplinaires Lubert Stryer Bio-X Stanford ont soutenu J.M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17, (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13, (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25, (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85, (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3, (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80, (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21, (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20, (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190, (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202, (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89, (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363, (6434), (2019).
Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure <em>d’aeruginosa</em>
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de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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