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Immunology and Infection

क्रोनिक स्यूडोमोनास एरुजिनोसा घाव संक्रमण का एक विलंबित टीका मॉडल

doi: 10.3791/60599 Published: February 20, 2020
* These authors contributed equally

Summary

हम इम्यूनोसक्षम चूहों में पुराने घाव संक्रमण पैदा करने के लिए एक विलंबित टीका प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

स्यूडोमोनास एरुजिनोसा (पी एरुजिनोसा)मानव स्वास्थ्य और रोग के लिए प्रासंगिकता बढ़ाने का एक प्रमुख नोसोकोमियल रोगजनक है, विशेष रूप से मधुमेह और अस्पताल में भर्ती रोगियों में पुराने घाव संक्रमण की स्थापना में। घाव रोगजनककी जांच और इस रोगजनक के खिलाफ नए उपचारों के विकास में सहायता करने के लिए पुराने संक्रमण मॉडलों की तत्काल आवश्यकता है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो पूर्ण मोटाई उत्तेजित घायल होने के 24 घंटे बाद विलंबित टीका का उपयोग करता है। इस समय मौजूद अनंतिम घाव मैट्रिक्स का संक्रमण या तो तेजी से निकासी या संक्रमण के प्रसार को वनील करता है और इसके बजाय विदेशी सामग्रियों या प्रतिरक्षा दमन के प्रत्यारोपण की आवश्यकता के बिना 7-10 दिनों तक चलने वाले पुराने संक्रमण को स्थापित करता है। यह प्रोटोकॉल मनुष्यों में पोस्ट-ऑपरेटिव संक्रमण के एक विशिष्ट अस्थायी पाठ्यक्रम की नकल करता है। एक ल्यूमिनेसेंट पी aeruginosa तनाव (PAO1:lux) का उपयोग पी aeruginosa घाव संक्रमण के लिए जीवाणु बोझ के मात्रात्मक दैनिक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यह उपन्यास मॉडल बैक्टीरियल रोगजनकता की जांच और क्रोनिक पी एरुजिनोसा घाव संक्रमण के लिए नए उपचारों के विकास में एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

Introduction

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स्यूडोमोनास एरुजिनोसा (पी एरुजिनोसा)मानव स्वास्थ्य और रोग के लिए बढ़ती प्रासंगिकता के साथ एक ग्राम-नकारात्मक रॉड के आकार का जीवाणु है। यह नोसोकोमियल सेटिंग्स में व्यापक रुग्णता और मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार है, विशेष रूप से इम्यूनोसमझौता रोगियों में घाव संक्रमणशामिल 1,2। इस रोगजनक के मल्टीड्रग प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव ने पी एरुजिनोसा उग्रता, पी एरुजिनोसा एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र और इस घातक संक्रमण3की रोकथाम और उपचार के लिए नए तरीकों में योगदान करने वाले कारकों की जांच के लिए और प्रोत्साहन प्रदान किया है । जैसे, इन शोध सवालों की जांच के लिए उपकरण के रूप में पुराने घाव संक्रमण के पशु मॉडल के लिए की जरूरत है और अधिक कभी नहीं किया गया है ।

दुर्भाग्य से, पी aeruginosa संक्रमण के कई पशु मॉडल सेप्सिस4,5के कारण संक्रमण या तेजी से गिरावट के तेजी से समाधान के साथ तीव्र संक्रमण का अनुकरण करते हैं, जो इन संक्रमणों की अक्सर पुरानी प्रकृति का पर्याप्त रूप से अनुकरण नहीं करता है। इस खामी को दूर करने के लिए, कुछ मॉडल विदेशी निकायों जैसे आगर मोतियों, सिलिकॉन प्रत्यारोपण, या अल्गिनेट जैल6,7,8के प्रत्यारोपण का उपयोग करते हैं। अन्य मॉडल उन चूहों का उपयोग करते हैं जिन्हें उन्नत उम्र, मोटापा या मधुमेह के कारण या औषधीय साधनों जैसे साइक्लोफोस्फामिमाइड-प्रेरित न्यूट्रोपेनिया9,10,11,12के कारण इम्यूनोसमझौता किया जाता है। हालांकि, या तो विदेशी सामग्री या प्रतिरक्षा समझौता मेजबानों का उपयोग स्थानीय भड़काऊ प्रक्रिया को बदल देता है, जिससे अन्यथा सामान्य प्रतिरक्षा प्रणालियों के साथ मेजबानों में पुराने घाव संक्रमणों में शामिल रोगविज्ञान की समझ हासिल करना मुश्किल हो जाता है।

हमने चूहों में पी aeruginosa घाव संक्रमण का एक पुराना मॉडल विकसित किया है जिसमें एक्सिशनल घायल होने के बाद बैक्टीरिया के साथ देरी से टीका शामिल है। देरी टीका बैक्टीरियल बोझ का आकलन करने वाले प्रयोगों के लिए कम से कम 7 दिनों तक विस्तार करने की अनुमति देता है। यह मॉडल पी एरुजिनोसा क्रोनिक संक्रमणों के रोगजनन और नए उपचारदोनों की जांच के लिए नए अवसरों को खोलता है।

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Protocol

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यहां वर्णित सभी तरीकों को स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. बैक्टीरिया की तैयारी और वृद्धि

  1. शोधकर्ता की संस्थागत जैव सुरक्षा समिति और पशु उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार बीएसएल-2 सावधानियों के साथ पी एरुजिनोसा और जानवरों के साथ सभी कार्य करें। यहां वर्णित सभी कदम ों में माउस टीका सहित पी एरुजिनोसा,एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में वर्णित है।
  2. ल्यूमिनेसेंट PAO1: पी aeruginosa के लक्स तनाव अनुरोध द्वारा हमारी प्रयोगशाला से उपलब्ध है । लकीर PAO1, लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) आगर पर जमे हुए ग्लाइसेरोल स्टॉक के रूप में संग्रहीत। ल्यूमिनेसेंट PAO1: लक्स तनाव के लिए, पौंड आगर में चयनात्मक एंटीबायोटिक्स (१०० μg/mL कार्बेनिकलिन और १२.५ μg/mL kanamycin) होना चाहिए । बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस की दर से बढ़ें।
  3. एक अलग कॉलोनी उठाओ और 3 एमएल पौंड माध्यम, पीएच 7.4 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ता है। ल्यूमिनेसेंट उपभेदों के लिए, शोरबा में 100 μg/mL कार्बेनिकलिन होना चाहिए। मिलाते हुए, एरोबिक स्थितियों के तहत बढ़ें।

2. प्रक्रिया तैयारकरना

  1. सर्जरी करने वाले सभी कर्मियों को साफ गाउन/लैब कोट, फेस मास्क, हेयर नेट और दस्ताने पहनें ।
  2. कैंची और संदंश सहित सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें। जानवरों के बीच उपकरणों को स्टरलाइज करने के लिए एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करें।
  3. सर्जिकल टेबल को इथेनॉल से साफ करें और एक साफ सर्जिकल फील्ड तैयार करें।

3. बाल हटाने

  1. एनेस्थेटाइज़ 8-12 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों का उपयोग कर 1%-3% isoflurane । जांचकर्ताओं को isoflurane का उपयोग करते समय संज्ञाहरण के लिए अपनी संस्था के पशु चिकित्सा स्टाफ दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए ।
    1. 1%-3% आइसोफ्लोरीन देकर एनेस्थीसिया शुरू करें और ऑक्सीजन प्रवाह दर को 1.5 एल/मिन में समायोजित करें। माउस को इंडक्शन चैंबर में रखें।
    2. संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए माउस के अंगूठे को चुटकी लें। जब माउस अब उत्तेजना का जवाब नहीं देता है, तो इसे इंडक्शन चैंबर से हटा दें और इसे आइसोफ्लोरीन नाक शंकु में अपनी नाक के साथ सर्जिकल बेंच पर रखें।
    3. दोनों आंखों पर नेत्र स्नेहक लगाएं।
  2. एक बेसलाइन पूर्व प्रक्रिया वजन प्राप्त करने के लिए माउस वजन।
  3. माउस को प्रवण स्थिति में रखें। माउस को पूर्व-गर्म बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड के साथ काट दें, कुल 500 माइक्रोन के लिए प्रत्येक पार्श्व में 250 माइक्रोन।
  4. एक बिजली शेवर का उपयोग कर माउस के पृष्ठीय क्षेत्र दाढ़ी। घाव के बालों के संदूषण को रोकने के लिए सर्जिकल स्टेशन की तुलना में एक अलग स्थान पर शेविंग होनी चाहिए।
  5. हेयर रिमूवल लोशन की पतली परत लगाएं। लोशन को 20-60 एस के लिए बैठने दें। गर्म पानी में गीला गाज के साथ बालों और अतिरिक्त लोशन को हटा दें। बालों को हटाने के बाद, एक्सीशनल घायल प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ें।

4. पूर्ण मोटाई एक्सीजेशनल घाव सर्जरी

  1. माउस के मध्य पृष्ठीय क्षेत्र में 25 जी सुई का उपयोग करके निरंतर रिलीज बुप्रेनोर्फिन 0.6-1 मिलीग्राम/किलोग्राम का उपयोग करें। धीमी गति से रिलीज buprenorphine 48-72 घंटे से अधिक दर्द से राहत प्रदान करता है।
  2. सर्जिकल साइट को कीटाणुरहित करते हैं। एक बाँझ बीटाडीन झाड़ू के साथ पृष्ठीय सतह पोंछ। एक बाँझ शराब झाड़ू के साथ अतिरिक्त बीटाडीन पोंछ। यह 3 बार किया जाना चाहिए (बीटाडीन और अल्कोहल के बीच बारी), एक परिपत्र तरीके से केंद्र से किनारे पर जाने से swabbing। क्षेत्र को सूखी हवा देने की अनुमति दें।
  3. बाँझ धुंध या प्लास्टिक चिपकने लपेटो का उपयोग कर सर्जिकल साइट के आसपास एक कपड़ा बनाएं।
  4. त्वचा तना हुआ खिंचाव। बाएं पृष्ठीय एपिडर्मिस के माध्यम से प्रारंभिक चीरा बनाने के लिए बाँझ 6-मिमी व्यास त्वचा बायोप्सी पंच का उपयोग करें। सही पृष्ठीय एपिडर्मिस पर दोहराएं।
  5. बाएं उल्लिखित घाव क्षेत्र के केंद्र से त्वचा को तम्बू करने के लिए संदंश का उपयोग करें। कैंची का उपयोग कर एपिडर्मल और डर्मल परतों को आबकारी। सममित घाव ों को बनाने के लिए सही उल्लिखित घाव क्षेत्र पर दोहराएं।
  6. बाँझ खारा के 50 μL के साथ घाव धोएं। सर्जिकल साइट और आसपास की त्वचा को सूखी हवा के लिए अनुमति दें। इसके बाद जख्मों को कवर करें और ट्रांसपेरेंट फिल्म ड्रेसिंग से डोरसम करें।
  7. माउस को वापस एक साफ पिंजरे में रखें। हाउस 1 पशु प्रति पिंजरे।
  8. पिंजरे को एक हीटिंग पैड पर रखें और तब तक मॉनिटर करें जब तक माउस जाग न जाए।
  9. कई जानवरों पर उपरोक्त सर्जरी करते समय, जानवरों के बीच सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ करने के लिए गर्म बीड स्टरलाइज़र का उपयोग करें।
  10. चूहों को शल्य प्रक्रिया से उबरने के लिए और बैक्टीरिया के साथ टीका आगे बढ़ने से पहले घावों पर एक अनंतिम घाव मैट्रिक्स के गठन के लिए 24 घंटे की अनुमति दें।

5. पी aeruginosa के साथ टीका

  1. रातोंरात पतला PAO1: एलक्स संस्कृति को ओडी६०० = ०.०५ पौंड मीडिया के ७५ mL में १०० μg/mL कार्बेनिकलिन युक्त और बैक्टीरिया बढ़ने जब तक संस्कृति जल्दी घातीय चरण में है (ओडी६०० ' ०.३) । यह लगभग 2-3 घंटे ले जाना चाहिए।
  2. पतला PAO1: PBS में लक्स (७.५ ± २.५) x १० CFU/mL की एकाग्रता के लिए । पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने और प्रयोग के बाद चढ़ाना के लिए अनुमति देने के लिए अतिरिक्त इनोकुलम तैयार करना सुनिश्चित करें। यदि सुविधाओं के बीच परिवहन (यानी प्रयोगशाला से विवेरियम तक), एक रिसाव प्रूफ बॉक्स में डबल रोकथाम का उपयोग स्पष्ट रूप से बायोहैजार्ड चिह्नित करें।
  3. एक पशु जैव सुरक्षा स्तर 2 (ABSL-2) अनुमोदित जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में अनुमोदित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग कर पी aeruginosa और चूहों के साथ सभी काम करते हैं । पुनर्योजित उपकरण जैसे वजन पैमाने को संदूषण को रोकने के लिए चिपकने वाली लपेटने के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  4. एनेस्थेटाइज़ ऊपर वर्णित 3% आइसोफ्लोरीन का उपयोग करके। माउस का वजन करें और वजन रिकॉर्ड करें। माउस को पूर्व-गर्म बाँझ 0.9% सोडियम क्लोराइड के साथ काट दें, कुल 500 माइक्रोन के लिए प्रत्येक पार्श्व में 250 माइक्रोन।
  5. यदि माउस की पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग रातोंरात बंद आ गई है, तो किसी भी परिणामी स्कैब को ध्यान से हटा दें और एक नई ड्रेसिंग पर डाल दें।
  6. प्रत्येक घाव में पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के माध्यम से PAO1 के 40 μL इंजेक्ट करने के लिए एक 500 μL कंद 27 जी सुरक्षा टोपी सिरिंज का प्रयोग करें। कॉन्ट्रालेटरल साइड से क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए विभिन्न चूहों का उपयोग गैर-टीका/पीबीएस घाव नियंत्रण के लिए किया जाना चाहिए ।
  7. माउस को एक हीटिंग पैड पर अपने पिंजरे में वापस रखें और तब तक मॉनिटर करें जब तक कि यह जाग न जाए। सभी चूहों को पार संदूषण को रोकने के लिए अलग पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से रखे जाने चाहिए।
  8. पिंजरे के फर्श पर भोजन छर्रों के बीच सैंडविच उच्च कैलोरी पोषण पूरक पेस्ट प्रदान करें।
  9. शेष इनोकुलम का उपयोग एक पौंड आगर प्लेट लकीर के लिए करें। प्रशासित बैक्टीरिया की संख्या की पुष्टि करने के लिए कॉलोनाइजरों की गिनती करें।

6. संक्रमित घावों की वीवो इमेजिंग में

  1. एक माध्यमिक कंटेनर के उपयोग सहित इमेजिंग उपकरण से चूहों के परिवहन के लिए बीएसएल-2 रोकथाम प्रोटोकॉल का पालन करें। माउस के इंडक्शन चैंबर या इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट में माउस के हस्तांतरण के दौरान किसी भी जानवर के बिस्तर को स्थानांतरित या छोड़ने के लिए सावधान रहें।
  2. चरण 3.1 में वर्णित इंडक्शन चैंबर में 1%-3% आइसोफ्लोरीन के साथ माउस के संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
  3. एक बार माउस एनेस्थेटाइज्ड हो जाने के बाद, इसे आइसोफ्लोरीन नाक शंकु में नाक के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम के इमेजिंग कक्ष में प्रवण स्थिति में रखें।
  4. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
  5. अधिग्रहण पैरामीटर एक साथ छवि वाले जानवरों की संख्या और बायोल्यूमिनेसेंस की तीव्रता के आधार पर भिन्न होंगे। निर्धारित करने के लिए बुनियादी मापदंडों में एक्सपोजर समय, बिनिंग, एफ/स्टॉप, और क्षेत्र दृश्य (एफओवी) शामिल हैं । हमारी डिफ़ॉल्ट शुरुआतिंग सेटिंग्स एक्सपोजर समय 30 सेकंड, कम (2), एफ/स्टॉप 1.2 और एफओवी 25 को बिनिंग कर रही हैं। शोधकर्ता की जरूरतों के आधार पर जरूरत के अनुसार इन सेटिंग्स को समायोजित करें।
  6. इमेजिंग प्रोग्राम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस डेटा का विश्लेषण करें। ल्यूमिनेसेंस चूहों की एक रंग तस्वीर पर मढ़ा एक छद्म रंग छवि के रूप में प्रतिनिधित्व किया जाएगा।
    1. घाव स्थल पर ब्याज का क्षेत्र (आरओआई) बनाएं और औसत प्रवाह (फोटॉन/सेकंड) का पता लगाया उपाय करें। ध्यान दें कि डेटा को चमक (फोटॉन/सेकंड/सेमी²/स्टरडियन) के रूप में भी सूचित किया जा सकता है, लेकिन जब तक कैमरे से इमेजिंग प्लेटफॉर्म की दूरी इमेजिंग के बीच स्थिर रहती है, तब तक फ्लक्स पर्याप्त है ।
    2. इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर एक यादृच्छिक क्षेत्र में आरओआई बनाकर पृष्ठभूमि को मापें। फोटॉन/सेकंड की पृष्ठभूमि संख्या घटाएं।
    3. आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
  7. संक्रमण प्रगति को ट्रैक करने के लिए अक्सर के रूप में दैनिक के रूप में ऊपर वर्णित इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।

7. पश्चात प्रबंधन

  1. शोधकर्ता के आईएसयूसी प्रोटोकॉल द्वारा निर्धारित दिशा-निर्देशों के अनुसार चूहों की निगरानी करें । हम पहले 4 दिनों के लिए दैनिक सभी चूहों की निगरानी करते हैं, फिर प्रयोग के अंत तक हर दूसरे दिन। बीएससी में सर्जरी के बाद पहले 4 दिनों के लिए प्रति दिन एक बार चूहों का वजन करें। संक्रमण के बाद के दिनों 1 और 2 पर 0.9% सोडियम क्लोराइड के 250 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  2. चूहों में दर्द/संकट के लक्षणों की जांच करें, जिसमें कूबड़ आसन, स्क्रैफी कोट, सुस्ती, सांस लेने में कठिनाई, चेहरे की मुंहकी सेस और वजन घटाने शामिल हैं ।
  3. यदि जानवर ों के स्वास्थ्य बिगड़ती के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, एक पशुचिकित्सा के साथ परामर्श करें । कोई भी माउस जो दर्द/संकट के बिगड़ते लक्षण ों को दिखाने के लिए प्रकट होता है और 20% या उससे अधिक का वजन कम हो जाता है, उसे इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए ।

8. घाव एक्सीशन

  1. प्रयोग के अंत में, सीओ2 साँस लेने का उपयोग कर चूहों का बलिदान, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद। संस्था के एबीएसएल-2 प्रोटोकॉल के अनुसार पशु शव का निस्तारण करें।
  2. एक बीएससी में बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग कर उत्पाद शुल्क घाव बिस्तर । प्रत्येक घाव बिस्तर को 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 1 एमएल बाँझ पीबीएस में रखें। कैंची के साथ घाव ऊतक कीमा। सभी घावों को एबीएल-2 माना जाना चाहिए, भले ही उन्हें संक्रमित न माना जाए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 300 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट। भंवर 10 एस के लिए प्रत्येक ट्यूब और क्रमिक रूप से PBS में जीवाणु प्रवाह पतला । बैक्टीरियल बोझ की गणना करने के लिए एलबी एगर पर पतला बैक्टीरियल बहिस्त्राव प्लेट करें।
  4. संक्रमित घावों पर विचार करें यदि घाव में ल्यूमिनेसेंट सिग्नल पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस से ऊपर है और नियंत्रण के रूप में पीबीएस के साथ टीका लगाए गए घावों की तुलना में घाव प्रवाह में अधिक बैक्टीरिया का पता लगाया जाता है।

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Representative Results

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लक्साबाडे रिपोर्टर सिस्टम (PAO1:lux) को एन्कोडिंग करने वाले प्लाज्मिड के साथ पीएओ1 के ल्यूमिनेसेंट तनाव का उपयोग करते हुए, हमने चूहों पर एक्सीशनल घायल किया, प्लैंकटोनिक पी aeruginosa 24 एच के साथ इन घावों को टीका लगाया, और समय के साथ बैक्टीरियल बोझ मापा(चित्रा 1 और चित्रा 2)। इमेजिंग ऑप्टिकल सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त एक प्रतिनिधि छवि दर्शाती है कि इस मॉडल का पता लगाने योग्य ल्यूमिनेसेंस(चित्रा 3ए)में परिणाम है। संक्रमण 3 दिन के बाद टीका पर नुकीला और 7 दिनों के बाद दोनों bioluminescence और कॉलोनी मायने रखता है(चित्रा 3बी-सी)के आधार पर टीका कायम है । इस मॉडल का उपयोग करके, हम बैक्टीरिया और माउस पृष्ठभूमि के तनाव के आधार पर 7-10 ays स्थायी घावों को मज़बूती से उत्पन्न करने में सक्षम हैं। घाव से अलग बैक्टीरिया की संस्कृति से पता चला है कि मात्राबद्ध CFU/घाव का पता लगाया ल्यूमिनेसेंस(चित्रा 3डी)के साथ सहसंबद्ध । अंत में, प्रदर्शनीय और मात्रात्मक पी aeruginosa संक्रमण के बावजूद, चूहों कम से 7 दिनों के लिए बच गया। हालांकि संक्रमण के तुरंत बाद प्रारंभिक तेजी से वजन घटाने था, खारा इंजेक्शन और पूरक पोषण वजन की बहाली के परिणामस्वरूप(चित्रा 3ई)। अंत में, हमने टीका खुराक की गणना की जिस पर 50% घाव पाओ1 से स्थायी रूप से संक्रमित हो जाएंगे। गणना आईसी50 मूल्य ~ 7.7 x 102 सीएफयू/एमएल था। 104 सीएफयू/एमएल से अधिक खुराक के परिणामस्वरूप 100% संक्रमण दर(चित्रा 3एफ)हुई। इन परिणामों को पहले प्रकाशित आंकड़ों13से अनुकूलित किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध जैवल्यूमिनेसेंट पी aeruginosaके साथ देरी टीका के साथ एक्सीशनल पूर्ण मोटाई घाव संक्रमण मॉडल का चित्रण । लकीर PAO1: दिन पर लक्स-2 । दिन -1 पर एक कॉलोनी का चयन करें और एलबी शोरबा में रात भर बढ़ें। दिन -1 पर एक्सीशनल घाव सर्जरी करें। 0 दिन पर, पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के माध्यम से घाव बिस्तर में इंजेक्शन द्वारा PAO1: लक्स के साथ टीका । टीका के बाद बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग करें। 7-10 दिन के माध्यम से दैनिक रूप में अक्सर इमेजिंग दोहराएं। 7-10 दिन, जानवरों और फसल के घावों का बलिदान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सीशनल घाव सर्जरी की योजनाबद्ध। शराब और बीटाडीन के साथ त्वचा के बालों को हटाने और नसबंदी के बाद, बाएं और दाएं डोरसम के एपिडर्मिस के माध्यम से प्रारंभिक चीरा बनाने के लिए 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें। डर्मल और एपिडर्मल परतों को हटाने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें। पीबीएस से धोएं। एक स्पष्ट ड्रेसिंग के साथ कवर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पी aeruginosa घाव संक्रमण संक्रमण के 7 दिनों के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। (A)पीएओ 1 से संक्रमित माउस की प्रतिनिधि छवि: लक्स के साथ एक्सिजनल घावों पर बायोल्यूमिनेसेंस ओवरले। (ख)ल्यूमिनेसेंट सिग्नल घाव बैक्टीरियल बोझ को दर्शाता है । N = 6 घाव। टीका: १० CFU/mL PAO1 । (C)वीवो ल्यूमिनेसेंट सिग्नल और पीएओ1 के बैक्टीरियल सीएफयू में रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण: लक्स-संक्रमित घावों ने बैक्टीरियल बोझ की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देने के लिए 105 सीएफयू/एमएल के साथ 4-7 दिनों के बाद टीका एकत्र किया। (घ)सीएफयू/घाव में बैक्टीरियल बोझ १० CFU/mL PAO1:lux से संक्रमित चूहों में समय के साथ घाव । (ई)वजन परिवर्तन (टी = -1) एन = 4 चूहों/समूह पर घाव एक्सीशन सर्जरी से पहले वजन के सापेक्ष । चित्रित 5-95 शतमक के लिए बॉक्सप्लॉट हैं। आंकड़े दो तरह से ANOVA Sidak कई तुलना के साथ सही कर रहे हैं । (एफ)घाव संक्रमण दर के Nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण तीन दिन के बाद टीका PAO1 के लिए आईसी५० की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । सभी रेखांकन nn.3 प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। इस आंकड़े को स्वीरे एट अल अल. 201913से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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हमने एक उपन्यास देरी से टीका पी aeruginosa घाव संक्रमण मॉडल विकसित किया है। एक्सिजनल घायल होने के बाद 24 घंटे तक बैक्टीरिया के साथ टीका में देरी की रणनीति 1 सप्ताह की समय सीमा पर घाव संक्रमण के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है। पी aeruginosaके एक ल्यूमिनेसेंट तनाव का उपयोग करके, संक्रमण पाठ्यक्रम में संक्रमण की प्रगति को ट्रैक करना संभव है। अन्य पी aeruginosa संक्रमण मॉडल की तुलना में संक्रमण का लंबा कोर्स मेजबान रोगजनक बातचीत और पी aeruginosa घाव संक्रमण को लक्षित उपन्यास चिकित्सा का अध्ययन करने के लिए नए अवसरों की अनुमति देगा । उदाहरण के लिए, हमने पहले ही इस मॉडल का उपयोग एक एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने में पीएफ बैक्टीरियोफेज की भूमिका प्रदर्शित करने के लिए किया है जो पी एरुजिनोसा को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली14से बचने की अनुमति देता है।

एक्सिजनल घाव सर्जरी और बैक्टीरियल टीका के बीच वसूली समय के 24 घंटे का समावेश इस घाव संक्रमण मॉडल में एक महत्वपूर्ण कदम है । यह जानवरों को संक्रमित होने से पहले घाव सर्जरी से उबरने की अनुमति देता है, जो संभावना है कि उनकी कम से 7 दिनों के माध्यम से जीवित रहने की क्षमता में एक भूमिका निभाता है । इसके अलावा, यह टीका से पहले एक अनंतिम घाव मैट्रिक्स के गठन का समर्थन करता है, जो पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के संयोजन में, बायोफिल्म गठन के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करता है। हमने घायल और टीका के बीच विभिन्न समय ों को देखते हुए इस मॉडल के विकास के दौरान अन्वेषणात्मक प्रयोगों की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया। हमारे अनुभव में, घायल होने के बाद तत्काल टीका अक्सर सेप्सिस और मौत में परिणाम देता है। इसके विपरीत, 48 घंटे और बाद के समय बिंदुओं पर टीका चूहों के बीच और एक ही माउस पर घावों के बीच विषमता के अस्वीकार्य स्तर के लिए नेतृत्व किया। चित्रा 3में स्पष्ट है, संक्रमित घावों के बैक्टीरियल लोड में अभी भी कुछ हद तक अपेक्षित विषमता हो सकती है, यहां तक कि 24-h विलंबित टीका के साथ भी। इसके लिए क्षतिपूर्ति करने का एक तरीका प्रत्येक प्रयोग में कई जानवरों का उपयोग करना है।

इस प्रोटोकॉल का एक अनूठा पहलू दो घावों का एक अनूठा पहलू स्वतंत्र रूप से दो घावों का चीरा है बजाय मिडलाइन नीचे त्वचा तह और छिद्रण के माध्यम से दो द्विपक्षीय घाव बनाने के लिए, के रूप में कुछ अंय घाव मॉडल में किया जाता है । हमने पाया कि यह तह विधि स्वच्छ मार्जिन के साथ सममित घावों के उत्पादन के लिए भी प्रभावी थी। हालांकि, इस तरीके से इलाज चूहों आम तौर पर बैक्टीरियल टीका के बाद जल्दी सेप्टिक बन गया और मर गया । हमारा मानना है कि ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि यह तह विधि डर्मल पैनिकस कार्नोस सकोता को हटा देता है - चूहों की त्वचा में अंतर्निहित मांसपेशियों की एक पतली परत जो मनुष्यों में मौजूद नहीं है। हम अटकलें लगाते हैं कि यह बाधा बैक्टीरियल प्रसार को रोकने में मदद कर सकती है ।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक शल्य चिकित्सा साइट से पर्याप्त बाल हटाने है, क्योंकि अतिरिक्त बाल सुपरइंफेक्शन के लिए एक निडस प्रदान कर सकते हैं और पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के पालन में हस्तक्षेप करते हैं। हमने पाया है कि बाल हटाने क्रीम के अलावा शेविंग कम से कम त्वचा जलन के साथ इष्टतम बाल हटाने प्रदान करता है, हालांकि अच्छी तरह से गर्म पानी के साथ क्रीम धोने अभी भी महत्वपूर्ण है।

एक अन्य अभिन्न कारक पोस्टसर्जिकल और संक्रमण पाठ्यक्रम के पहले कुछ दिनों के दौरान पोषण सहायता, हाइड्रेशन और दर्द नियंत्रण है। इसका समाधान करने के लिए, हम दिन -1 और 0, फिर 1 और 2 दिन में 250 माइक्रोन के 500 माइक्रोन का प्रशासन करते हैं। हम एक्सीशनल घाव सर्जरी के समय एक मल्टीविटामिन और कैलोरी तरल जेल पूरक की आपूर्ति भी करते हैं। जैसा कि चित्रा 3में प्रदर्शित किया गया है, ये उपाय 3 दिन तक वजन की पर्याप्त वसूली की अनुमति देते हैं। एनाल्जेसिया के संबंध में, हमने पाया है कि एक्सिजनियल घाव सर्जरी से पहले दी गई निरंतर रिहाई ०.५ मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन ७२ घंटे के लिए पर्याप्त दर्द नियंत्रण प्रदान करता है, लेकिन किसी भी व्यक्तिगत माउस में संकट के निष्कर्षों के आधार पर आवश्यक होने पर अतिरिक्त खुराक दी जा सकती है ।

हालांकि पी aeruginosa घाव संक्रमण का एक मॉडल 7-10 दिनों के लिए विस्तार संक्रमण के अधिक तीव्र मॉडल पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, यह अभी भी कुछ अनुसंधान अधिक पुराने संक्रमण से जुड़े सवालों का जवाब देने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । इस सीमा का एक कारण यह है कि पीएओ 1 का ल्यूमिनेसेंट सिग्नल: पी एरुजिनोसा चोटियों का लक्स तनाव दिन 2-3(चित्रा 3बी)में। ~ 7 दिनों के बाद लूसिफ़ेरेज़ सिग्नल अविश्वसनीय हो सकता है। इस कारण से, हम प्रयोग के अंत में प्रत्येक घाव के संक्रमण की पुष्टि करने के लिए एलबी प्लेटों पर घाव प्रवाह चढ़ाना और सीएफएस की गिनती करके बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करते हैं। इस मॉडल का एक और संभावित नुकसान वीवो इमेजिंग सिस्टम में एक के लिए आवश्यकता है, जो कुछ प्रयोगशालाओं तक पहुंच नहीं हो सकती है। इस बाधा के आसपास एक तरीका गैर-ल्यूमिनेसेंट जंगली प्रकार के बैक्टीरियल उपभेदों का उपयोग करना है। यह अभी भी शोधकर्ता को इस पुरानी संक्रमण मॉडल का लाभ उठाने की अनुमति देता है और, जैसा कि ऊपर बताया गया है, प्रयोग के अंत में बैक्टीरिया सीएफयू को निर्धारित किया जा सकता है।

हमने विलंबित टीका पी aeruginosa घाव संक्रमण का एक उपन्यास मॉडल बताया है जो 7-10 दिनों तक विस्तारित प्रयोगों को सक्षम बनाता है। यह मॉडल पी एरुजिनोसाके साथ मेजबान-रोगजनक बातचीत के मूल्यांकन के साथ-साथ नए उपचारों के विकास के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम करेगा। इस मॉडल में कई भविष्य की दिशाओं की क्षमता है, जिसमें स्टेफिलोकोकस ऑरियसजैसे अन्य घाव रोगजनकों के लिए अनुकूलन, साथ ही पी एरुजिनोसा सहित पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमण शामिल हैं जो अन्य रोगजनकों के साथ संयुक्त हैं।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

PUT-Tn5-EM7-लक्स-Km1 ल्यूमिनेसेंट निर्माण वेक्टर जे हार्डी से एक शालीन उपहार था । BioRender.com के साथ योजनाबद्ध बनाया गया था। हम घाव संक्रमण मॉडल पर उनकी सलाह के लिए जी गुर्टनर की लैब का शुक्रिया अदा करते हैं । हम अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए वीवो इमेजिंग में स्टैनफोर्ड सेंटर फॉर इनोवेशन से टी डॉयल को भी धन्यवाद देते हैं । इस काम को अनुदान R21AI133370, R21AI 133240, R01AI12492093, और स्टैनफोर्ड स्पार्क, फाल्क मेडिकल रिसर्च ट्रस्ट और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) से P.L.B. C.R.D. द्वारा समर्थित T32AI0007502 द्वारा समर्थित किया गया था । विज्ञान और इंजीनियरिंग के लिए एक गैबलन स्टैनफोर्ड ग्रेजुएट फेलोशिप और एक लुबर्ट स्ट्राइकर बायो-एक्स स्टैनफोर्ड इंटरडिसिप्लिनरी ग्रेजुएट फेलोशिप ने जेएमएस का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

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References

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क्रोनिक <em>स्यूडोमोनास एरुजिनोसा</em> घाव संक्रमण का एक विलंबित टीका मॉडल
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de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).More

de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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